胶枝霉素C的制备方法及其应用 【技术领域】
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及化合物胶枝霉素C(Gliocladicillin C)的制备方法，以及化合物胶枝霉素C在制备抗肿瘤活性的药物中的应用。本发明还涉及用于发酵制备胶枝霉素C的粘帚霉属(Gliocladium sp.)菌株6.102CGMCC No.2673。
背景技术
恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一。在第18届国际抗癌联盟大会上，世界卫生组织的一项研究报告表明，今后20年，新发肿瘤患者人数将由目前每年1000万增加到1500万，每年因恶性肿瘤而死亡的人数也将由600万增至1000万。据国家卫生部统计，20世纪90年代我国肿瘤发病率已上升为127/10万。近年来我国每年新增肿瘤患者160万～170万，总数估计在450万左右。在恶性肿瘤的三大疗法中，药物治疗占有重要的地位。在合成的化学类抗肿瘤药物中绝大多数都是以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物的。[参见，《中国肿瘤》2007，16，705-708]
据报道，1984～1995年，天然产物占上市抗肿瘤药的60％以上；1983年以前在美国上市以及1983～1994年全世界批准广泛使用的92种抗肿瘤药中，约62种来源于天然产物；1995～1999年，3个天然产物的衍生物作为新抗肿瘤药上市，由此可见，天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。[参见，《中国抗生素杂志》2004，29，636-640]
本发明涉及的胶枝霉素C(Gliocladicillin C)结构式如下式(I)所示：
该化合物是本发明人首次发现并且命名的新结构化合物，同时是首次报道其抗肿瘤活性。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种利用微生物发酵制备胶枝霉素C的方法，以及提供胶枝霉素C在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明人在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，发现了生产菌株粘帚霉属菌株6.102(CGMCC No.2673，于2008年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101))的固体发酵提取物具有抗肿瘤活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，制备并鉴定了该活性化合物胶枝霉素C。通过对化合物进行抗肿瘤活性评价，发现其具有显著的抗肿瘤活性。
具体而言，本发明内容如下：
本发明提供一种利用粘帚霉属菌株6.102发酵制备式(I)所示的胶枝霉素C的方法，
所述方法的特征在于包括下列步骤：
a)将粘帚霉属菌株6.102进行固体发酵；
b)在步骤a)的固体发酵以后，向培养产物中加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；
c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析和凝胶色谱分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到式(I)的化合物。
其中胶枝霉素C的生产菌株是粘帚霉属菌株6.102，该菌株分离自采集于西藏林芝地区的冬虫夏草样品，并于2008年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为2673。粘帚霉属菌株6.102属于子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypoceraceae)，粘帚霉属(Gliocladium sp.)。
在如上所述的本发明方法中，本领域技术人员应当理解步骤b)中所用的有机溶剂包括多种不溶于水的在室温下是液态的有机溶剂，诸如氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯等，优选地，所述有机溶剂是乙酸乙酯。
在优选实施方案中，本发明的胶枝霉素C具有良好的在体外抑制肿瘤细胞生长的活性。所述肿瘤细胞包括子宫颈癌HeLa细胞和肝癌HepG2细胞，另外，对肺癌A549细胞也有一定的抑制活性。
本发明还提供了式(I)所示的化合物胶枝霉素C在制备抗肿瘤活性的药物中的用途。
本发明还提供式(I)的化合物胶枝霉素C在制备抗肿瘤活性的试剂盒中的用途。所述肿瘤包括，但不限于，子宫颈癌、肝癌、和肺癌等。本领域技术人员应当理解，可以利用药剂生产领域中的常规技术将式(I)的化合物胶枝霉素C用于生产抗肿瘤活性的试剂盒，该试剂盒中的有效成分是式(I)的化合物胶枝霉素C，并且还可以包括药用载体等。本领域的技术人员还应该理解，当用于抗肿瘤治疗时，本发明的胶枝霉素C可以单独使用，或者与其它抗肿瘤活性药物组合使用。
综上所述，本发明提供了利用粘帚霉属菌株6.102发酵制备胶枝霉素C的方法，并提供了胶枝霉素C在制备抗肿瘤活性的药物中的用途。与文献报道的其它抗肿瘤化合物相比，化合物胶枝霉素C具有显著抗肿瘤活性的效果。本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物。
【附图说明】
图1显示胶枝霉素C的1H NMR光谱图(500MHz，CDCl3)；
图2显示胶枝霉素C的13C NMR光谱图(500MHz，CDCl3)。
图3显示胶枝霉素C体外抑制HeLa细胞增殖的生长抑制曲线，从图中计算的IC50值为0.679μg/mL。
图4显示胶枝霉素C体外抑制HepG2细胞增殖的生长抑制曲线，从图中计算地IC50值为0.285μg/mL。
【具体实施方式】
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：粘帚霉属菌株6.102的分离
粘帚霉属菌株6.102分离自西藏冬虫夏草，具体是分离自冬虫夏草的中部部分(即幼虫和子座的交界处)。并于2008年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为2673。粘帚霉属菌株6.102属于子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypoceraceae)，粘帚霉属(Gliocladium sp.)。
分离方法如下：将新鲜冬虫夏草的中部部分(即幼虫和子座的交界处)切下，用2％的次氯酸钠溶液进行表面消毒3分钟，然后用无菌水冲洗组织把次氯酸钠溶液除去。将洁净的组织放入研钵中，加入适量无菌水进行研磨。将研磨好的组织液涂布在添加了抗生素的PDA培养基平板上(所加抗生素种类和浓度分别为：链霉素100ppm，四环素50ppm)。在25℃条件下培养直到菌落长出，挑取单菌落进行纯培养，即完成菌种的分离。
粘帚霉属菌株6.102的生物学特征如下：
1.形态特征：
在PDA培养基上菌落为絮状，产孢瓶梗，3-5轮生，背面产生浅黄色色素；产生气生菌丝，菌丝直径为1.5-2.5微米，多分隔，无色透明，可以形成菌丝束；分生孢子梗直立；分生孢子椭圆形，大小为2.8-3.5x3.9-6.2微米，相互粘结成团，孢子团浅褐色；未见有性型，无子座和子囊壳包裹。
2.在固体培养基上的生长特征：
本发明中采用大米固体发酵，粘帚霉属菌株6.102在大米培养基中会产生黄色菌丝，同时产生黄色色素。
3.生理生化特征：
在用PDA平板培养时，在培养基中会产生黄色色素。在液体种子培养时会产生黄色色素，使培养液呈黄色。
4.碳源利用：
所用碳源为葡萄糖。
实施例2：化合物胶枝霉素C的制备
材料：马铃薯、大米为市售，本发明所用的其他试剂均为分析纯级别，一般的生物化学试剂公司均有销售。
a.粘帚霉属菌株6.102的固体发酵
粘帚霉属菌株6.102的活化：
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养7天；
粘帚霉属菌株6.102的固体发酵：
制备大米培养基：将100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却待用；将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×106个/mL)5mL接种于该大米培养基上，在25℃无菌培养间培养40天。
b.胶枝霉素C的提取
待发酵完毕，把大米培养物用铁勺粉碎，按照乙酸乙酯与粉碎后培养物的体积比例为1∶1，将乙酸乙酯加入盛有粉碎后培养物的三角瓶中提取三次，将有机溶剂减压蒸馏至干燥，得到10.0g粗提物。
c.粗提物的分离纯化
将粗提物用二氯甲烷-甲醇体系(详细的体积比分别为：100％二氯甲烷；二氯甲烷∶甲醇＝200∶1；100∶1；50∶1；25∶1；10∶1；100％甲醇)进行常压硅胶柱层析，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成20个组分，在活性跟踪指导下，发现在二氯甲烷∶甲醇＝200∶1作为流动相洗脱得到的组分(命名为组分1)有抗肿瘤活性，收集活性洗脱组分1(400mg)。
将活性组分1通过凝胶色谱分离，凝胶柱填料为Sephadex LH-20(购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)，流动相是甲醇，将组分1分成10个亚组分，然后，再通过活性跟踪分别测试这10个组分的抗肿瘤活性，得到150mg活性组分1-2。
将活性组分1-2通过HPLC纯化而得到2.0mg活性化合物胶枝霉素C，其中HPLC的条件是：采用安捷伦(Agilent)1100型半制备高压液相色谱仪，安捷伦C18反相半制备色谱柱(10μm、10x 250mm)，流速2.0mL/分钟，用甲醇和水作为流动相，制备条件：70％甲醇/水等度洗脱5分钟，70％-90％甲醇/水梯度洗脱25分钟，得到胶枝霉素C的保留时间tR＝16.8分钟。
实施例3化合物胶枝霉素C的物化分析
实施例2中步骤c得到的化合物胶枝霉素C具有下述理化性质：形状为白色粉末；分子式为C32H32N6O7S4；分子量为740(据ESI-MS)；紫外UV数据(用乙腈作溶剂)：最大吸收波长λmax＝203nm(310000)，298nm(33000)。胶枝霉素C的质谱和红外光谱数据见表1，氢谱和碳谱数据见表2，1H NMR谱图见图1，13C NMR谱图见图2。其中红外光谱由北京大学化学学院提供测试，核磁共振谱由中国医学科学院药物研究所提供测试。
表1.化合物胶枝霉素C的物化常数
表2.化合物胶枝霉素C的氢谱和碳谱数据(CDCl3)
s-单峰；d-双峰；t-三型峰；m-多重峰
通过将上述核磁共振氢谱、碳谱数据，质谱数据，与文献中所报道的“Inhibition of c-fos Proto-oncogene Induction by Sch 52900 and Sch 52901，Novel Diketopiperazines Produced by Gliocladium sp.”(抗生素杂志，1995，48，1440-1445)中化合物Sch 52900的数据相比较，发现该化合物的结构和化合物Sch 52900的结构非常类似，但是侧链的取代基不同，证实得到的产物是一种新的化合物，将其命名为胶枝霉素C。
综上，10.0g粗提物经过分离纯化而得到2.0mg纯化合物胶枝霉素C，其纯度为90％以上，收率为0.2％。
实施例4：采用MTT法检测胶枝霉素C对于肿瘤细胞的抑制活性
1.试验用试剂：
将在实施例3中分离纯化的胶枝霉素C用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂分别配制浓度为0.4，2，10，40mg/mL的待测溶液；
阳性对照物为5-氟尿嘧啶(购自上海邦成化工有限公司)，其是一种公认的抗肿瘤试剂。
本实验所用肿瘤细胞株为子宫颈癌HeLa细胞株(ATCC CCL-2)和肝癌HepG2细胞株(ATCC HB-8065)(即，所述细胞均来源于美国典型培养物收藏中心ATCC)。
染色液为MTT(噻唑蓝)，购自美国Sigma公司。
2.试验方法
(1)将肿瘤细胞培养于96孔板中，每孔细胞数为104个，DMEM培养基(购自invitrogen公司，货号12100-046，使用前按说明书加适当体积的水配制成液体培养基灭菌待用)100微升。
(2)将肿瘤细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养16-18小时后，轻轻倒掉液体培养基，用PBS洗涤1次，加入适当浓度的化合物溶液，37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时。
(3)培养结束后，用新鲜DMEM培养基替换化合物溶液，再在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时；
(4)培养结束后，每个孔中加入50微升(浓度为0.5毫克/毫升)的MTT(噻唑蓝)溶液，在37℃，5％CO2条件下培养3小时；
(5)除去培养基和MTT溶液，在每孔中加入200微升DMSO溶液，在37℃条件下放置1小时；
(6)使用微量平板ELISA读数仪(SUNRISE-basic TECAN，TECANAustria Gmbh，Austria)读取培养后的混合物在570nm下的光吸收值OD570；
(7)以未处理细胞的吸收值相对于初始值的增长为增殖率100％，计算胶枝霉素C的IC50值。
其中IC50表示导致50％细胞增殖抑制的药物浓度。实验结果需要通过三次独立实验决定。
3.试验结果
本发明制备的化合物胶枝霉素C对HeLa细胞和HepG2细胞的体外增殖抑制的IC50值分别为0.679μg/mL(图3)和0.285μg/mL(图4)。阳性对照物5-氟尿嘧啶对HeLa细胞和HepG2细胞的IC50均为5μg/mL(未显示抑制曲线)。
结果表明，本发明的化合物胶枝霉素C对HeLa细胞和HepG2细胞的体外抑制活性分别约是5-氟尿嘧啶抑制活性的7.36倍和17.5倍，可见本发明的胶枝霉素C具有良好的抑制肿瘤细胞生长的活性，可用于制备抗肿瘤活性的药物和试剂盒。另外，本发明的胶枝霉素C对肺癌A549细胞(ATCC CCL-185)也有一定的抑制活性(数据未显示)。因此，所述肿瘤包括子宫颈癌、肝癌、和肺癌。本领域的技术人员应该理解，当用于抗肿瘤治疗时，本发明的胶枝霉素C可以单独使用，或者与其它抗肿瘤活性药物组合使用。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，对其进行各种形式和细节的变化。