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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510688406.8 (22)申请日 2015.10.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105219657 A (43)申请公布日 2016.01.06 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 10903 2015.06.11 (73)专利权人 江苏安惠生物科技有限公司 地址 226009 江苏省南通市经济开发区中 央路68-A号 专利权人 江苏省苏微微生物研究有限公司 (72)发明人 陈惠郑惠华刘广建全卫丰 薛璟蒋益季宏更汪洁 汪少芸田贞乐吴伟杰 。
2、(74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (56)对比文件 CN 102067788 A,2011.05.25, CN 102399840 A,2012.04.04, CN 103070010 A,2013.05.01, CN 103820428 A,2014.05.28, CN 103408645 A,2013.11.27, 陈建红等.广西产云芝的云芝多糖的研究初 探. 大众科技 .2012,第14卷(第8期)。
3、,108-109. 林晓霞等.云芝糖肽的液体发酵培养基的研 究. 生物加工过程 .2006,第4卷(第2期),64- 68. 审查员 温婧 (54)发明名称 云芝液体发酵高产多糖菌株及其选育方法 (57)摘要 本发明公开了一种云芝液体发酵高产多糖 菌株及其选育方法， 菌株保藏编号为CGMCCNo. 10903； 分类命名： 云芝， 拉丁文学名：Coriolus versicolor。 本发明诱变出一株云芝菌丝体多糖 产量高于原出发菌株的云芝诱变菌株， 提高了云 芝多糖的产量可以创造很好的经济效益。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105219657 B 2018.11.23 CN 10521。
4、9657 B 1.一种液体发酵高产多糖的云芝菌株， 其特征是： 保藏编号为 CGMCC No. 10903； 分类 命名： 云芝， 拉丁文学名： Coriolus versicolor。 2.根据权利要求1所述的云芝菌株用于液体发酵高产多糖的方法， 其特征是： 发酵条件 为： 发酵罐容积100 L， 装液量60L ， 搅拌转速150 r win， 通气量1： 0 5-1， 压差法接种， 接种 量为8， 2728条件下培养； 添加0 1 豆油作为消泡剂； 发酵终止时间为60小时； 发酵 培养基： 每升发酵液用玉米粉30g， 豆饼粉15 g， 蛋白胨3 g， 葡萄糖30 g， 碳氮比为19:1。 。
5、权利要求书 1/1 页 2 CN 105219657 B 2 云芝液体发酵高产多糖菌株及其选育方法 技术领域 0001 本发明涉及一种云芝液体发酵高产多糖菌株及其选育方法。 背景技术 0002 云芝胞内多糖(Coriolus versicolor intracellular polysaccharides)系从 担子菌纲多孔菌科云芝属真菌云芝或培养的菌丝中提取纯化的结合蛋白多糖， 是良好的生 物效应调节剂， 具有抑制肿瘤、 调节免疫、 降低放、 化疗毒副反应等多种药理作用， 并有抗艾 滋病毒活性。 由于野外云芝的资源有限， 采用固体发酵培养菌丝体提取多糖成本高、 周期 长、 产品质量不稳定、 。
6、产量低， 而且最近我国药品监督管理局要求由固体培养变更为液体培 养云芝菌丝体提取胞内多糖， 所以为了弥补这些不足， 适应大规模集约化生产。 云芝多糖主 要来自液体发酵的菌丝体提取得到， 目前云芝液体发酵提高多糖得率的研究大都是在云芝 液体发酵的条件及云芝多糖提取工艺上的研究很多， 而通过菌种诱变， 得到特异菌株来提 高发酵产物云芝多糖的含量， 几乎没有报道， 产量高、 生物性状优异、 生产性状良好的云芝 菌种是保障云芝生产和云芝产业发展良好的先决条件， 从野外分离的云芝菌种大多产量不 高， 需要经过人工驯化和不断的选育， 以提高云芝的产量和生产性状， 因此， 菌种的选育方 面的研究就显得尤为重。
7、要。 自然选育的效率较低， 而采取人工选育的方法效果较好， 云芝作 为一种大型真菌， 有其自身的特点， 其新菌种的选育研究离不开食用菌育 种方面的研究。 0003 优良的药用真菌工程菌是提高药用真菌液体发酵水平的关键。 目前， 对药用真菌 采用的育种手段主要有自然选择、 诱变育种和杂交育种。 除利用紫外线、 激光和化学诱变剂 等物理化学诱变因素来筛选出优良药用真菌外， 为了提高药用真菌育种的有效性和目的 性， 研究人员越来越重视利用原生质体融合技术、 基因重组技术等来构建新型的药用真菌 发酵工程菌。 原生质体融合又称细胞融合， 该技术不受亲合因子的影响， 可实现药用真菌的 种内不同品种间、 种。
8、间以及属间细胞中的全基因组的有效混合， 使遗传距离较大的远缘种 间、 属间杂交成为可能。 但由于杂合子鉴定标准上存在着技术难度而影响了该技术的广泛 应用。 0004 在食用菌的菌种选育中， 通常有许多难题， 诸如新菌种的产量筛选周期长、 工作量 大， 菌种选育的效率不高等， 采用传统方法进行食用菌菌种选育， 筛选到一株产量高、 生物 性状优异、 生产性状优良的高产新菌株的难度较大。 因此， 在食用菌菌种选育研究领域亟待 引进一种高效的新育种技术和工艺。 0005 目前在微生物育种中， 利用离子束进行诱变育种受到了追捧， 离子束作为一种新 的诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物效应而发展。
9、极为迅速， 离子注入可引 起DNA键断裂， 致使大量受体原子移位、 重组， 形成新的分子结构和基因， 产生丰富的基因突 变， 从而提高突变率。 与传统诱变源相比， 离子注入能以较小的生理损伤得到较高的突变 率、 较广的突变谱， 而且具有设备简单、 使用方便、 成 本低廉、 对人体和环境无害等优点。 近 年来， 有报道将离子束诱变技术运用在抗生素菌株的诱变上， 并获得成功。 许立青、 张荫芬 等人采用离子束注入法应用于核糖霉素、 卡那霉素产生菌和卡那霉素抗株产生菌的诱变， 说明书 1/6 页 3 CN 105219657 B 3 结果表明抗生素效价单位有明显提高， 用N+处理的生产菌株庆大霉素和。
10、卡那霉素产生 菌， 选出的高产菌株已用于生产， 提高幅度分别为20左右和12.5以上， 经济效益明显。 2006年赵树欣等人采用离子束注入法对一株酵母菌TQ601进行诱变选育， 成功获得一株产 高级醇低的菌株TQ105菌， 比出发菌株降低了34.15。 离子束注入技术用于菌株的选育工 作， 效果优于传统的诱变技术。 0006 目前对于云芝新品种选育报导不多， 国内外还未见有关利用离子束注入诱变选育 高产云芝多糖发酵菌株的相关报道， 本项目的实施将填补这方面的空白。 引进离子束诱变 技术运用于高产云芝多糖发酵菌株的选育， 发挥其优势， 大大提高诱变选育的成功率， 在云 芝液体发酵菌株选育上建立一。
11、个新的高效方法， 为真菌发酵技术的发展开辟新的道路。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种云芝液体发酵高产多糖菌株及其选育方法。 0008 本发明的技术解决方案是： 0009 一种云芝液体发酵高产多糖菌株， 其特征是： 保藏编号为CGMCC No.10903； 分类命 名： 云芝， 拉丁文学名： Coriolus versicolor。 0010 所述的云芝液体发酵高产多糖菌株， 发酵条件为： 发酵罐容积100 L， 装液量60L， 搅拌转速150r/win， 通气量1： 0.5-1， 压差法接种， 接种量为8， 2728条件下培养； 添加 0.1豆油作为消泡剂； 发酵终止时间为60小。
12、时； 发酵培养基： 每升发酵液用玉米粉30g， 豆 饼粉15g， 蛋白胨3g， 葡萄糖30g， 碳氮比为19:1。 0011 一种云芝液体发酵高产多糖菌株的选育方法， 其特征是： 包括下列步骤： 0012 (1)选择多种不同的云芝生产菌菌株， 进行云芝的液体发酵试验， 挑选云芝菌丝体 多糖产量最高的云芝菌株作为诱变的高产出发菌株； 0013 (2)出发菌株利用原生质体制备技术， 进行云芝原生质体的制备； 0014 (3)云芝出发菌株的原生质体作为低能N+离子注入诱变的材料： 通过云芝原生质 体的制备， 并使云芝原生质体达到106个/ml的悬液， 吸取0.1ml涂布于空白培养皿中， 风干、 进行。
13、低能N+离子注入诱变； 0015 (4)N+离子注入诱变： 对步骤(3)涂布于培养皿中的材料进行N+离子注入诱变， 然 后用1ml 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗脱， 吸取0.1ml洗脱液涂布于再生平面培养基上培 养； 0016 (5)诱变菌株的筛选： 将经离子束注入后的平板用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗 脱， 涂布于再生培养基平板上， 待菌落长成后， 挑选菌丝粗壮浓密、 生长较快的菌丝进行液 体发酵试验， 对菌丝体多糖进行测定， 挑选菌丝体多糖含量比出发菌株高的云芝菌株， 对其 进行筛选培养， 最后得到一株液体发酵高产多糖的云芝新菌株； 0017 (6)遗传性状稳定性验证： 将上述。
14、诱变筛选后的菌株连续传代20代， 然后进行液体 发酵试验， 产量稳定、 性状无变化的最终确定为用 于生产上的新的诱变云芝液体发酵工程 菌株。 0018 所述的N+离子注入条件为注入能量为20KeV， 注入剂量为91014ions/cm2， 靶室真 空度为10-3pa， 以5s脉冲式注入， 间隔为15s。 0019 再生培养基为： 麦芽糖5克， 葡萄糖10克， 酵母粉4克， 0.6mol/L甘露醇， 琼脂5.5克、 说明书 2/6 页 4 CN 105219657 B 4 pH自然， 蒸馏水定容至总体积为1000mL。 0020 本发明的优点及积极效果是： 0021 1、 以往云芝等食用菌菌种的。
15、育种通常采用杂交育种和紫外诱变育种等手段进行， 诱变效率低、 易导致负突变、 遗传性状不稳定等缺点， 而通过采用离子注入技术诱变云芝等 食用菌原生质体进行菌株的诱变选育， 提高了诱变的效率和正突变的机率， 并且诱变后的 云芝菌株不易发生退化。 采用本发明诱变出一株云芝菌丝体多糖产量高于原出发菌株的云 芝诱变菌株， 提高了云芝多糖的产量可以创造很好的经济效益。 0022 2、 本发明通过对高产多糖的云芝新菌株最佳最佳培养条件及最佳液体发酵参数 的研究， 以发酵产物多糖为指标， 从培养基的营养、 pH、 发酵时间等进行筛选适合高产多糖 新菌株的最佳发酵参数， 从摇瓶培养到工厂发酵生产的不同发酵参数。
16、， 提高工厂化生产云 芝多糖的得率， 为工厂化生产云芝多糖提供成熟的工艺。 0023 3、 通过低能N+注入诱变得到一株液体发酵高产多糖的云芝新菌株， 对新菌株最佳 培养基及液体参数的研究使发酵云芝多糖产量高于高产出发菌株50,每升液体发酵量菌 丝体多糖达到2.26克。 0024 下面结合实施例对本发明工艺作进一步说明。 0025 低能N+注入诱变选育抗病高产云芝菌株的方法及所选育的菌株， 保藏编号为 CGMCC No.10903； 分类命名： 云芝， 拉丁文学名： Coriolus versicolor， 保藏单位： 中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西。
17、路1号院3号， 保藏日期 2015年06月11日。 具体实施方式 0026 诱变筛选云芝液体发酵高产多糖新菌株的工艺方法， 其步骤是： 0027 1、 高产云芝菌丝体多糖出发菌株筛选 0028 从国内引进不同品种的云芝菌种SYZ1、 SYZ2、 SYZ3、 SYZ4、 SYZ5、 SYZ6、 SYZ7、 SYZ8。 菌株分别来自中国农科院， 东北， 及本研究所保藏的菌株， 接种于PDA斜面培养基上， 28避 光培养7天进行活化。 将活化的菌株接种于装有PDA培养基培养皿的中央， 记录云芝菌丝萌 发的时间， 测定其生长速度， 观察菌丝的形态(菌丝粗细、 浓密)。 接着进行云芝液体发酵试 验， 通。
18、过打孔定量接种至液体培养基中(培养基配方见下)， 150转/分旋转式摇床28避光 培养7天， 4000转/分离心5分钟， 收集菌丝体， 65烘干至恒重， 测定其质量得云芝液体发酵 生物量， 同时进行云芝菌丝体多糖进行测定。 以云芝菌丝体多糖产量最高者作为云芝多糖 高产出发菌株。 试验最后确定以SYZ2来自中国农科院的一株云芝菌株作为诱变的高产出发 菌株。 (见表1) 0029 高产菌丝体多糖出发菌株筛选(表1) 0030 说明书 3/6 页 5 CN 105219657 B 5 0031 0032 2、 低能N+离子注入诱变 0033 (1)样品前处理： 出发菌株SYZ2培养5天的菌丝， 用2。
19、溶壁酶在30下酶解5小时， 用8层擦镜纸过滤酶解液， 用渗透压稳定剂共8ml分次洗涤过滤， 取过滤液。 4000r/min离心 10分钟， 去上清液， 用渗透压稳定剂8ml离心洗涤， 得纯化的原生质体。 将原生质体用渗透压 稳定剂10ml稀释用， 制成原生质体悬液， 用血球计数板计数。 将精制原生质体悬液稀释至 106个/ml。 取0.1ml涂布于培养皿中， 无菌风风干， 立即进行低能N+离子注入。 0034 (2)离子注入条件： 注入能量为20KeV， 注入剂量为9.001014ionscm-2靶室真空 度为10-3Pa， 以5s脉冲式注入， 间隔为15s。 (此条件为我研究团队在省科技支撑。
20、项目 运用人 工诱变育种等多级交叉联用法选育云芝抗病高产新菌株 中经过研究筛选出的最佳离子注 入条件) 0035 3、 云芝菌丝体多糖高产菌株的筛选 0036 (1)初筛： 将经离子束注入后的平板用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗脱， 取0.1ml 涂布于再生培养基平板上， 待菌落长成后， 挑选菌丝体之间有明显拮抗的菌株， 一共挑选出 有96株。 然后转入PDA培养基平板上与出发菌株SYZ2进行拮抗试验， 共筛选出5株有明显拮 抗菌株。 5株菌株为SYZ203、 SYZ209、 SYZ225、 SYZ261、 SYZ285； (2)复筛： 然后将经过初筛后的 菌株云芝液体发酵试验， 选择菌丝。
21、体 多糖产量高于对照菌株的菌株作为诱变的高产多糖 菌株， 最终得到一株高产菌丝体多糖的云芝新菌株SYZ209编号为SYZ9， 比出发菌株SYZ2高 出35.9， 最后进行同工酶电泳试验确定SYZ9为高产菌丝多糖新菌株。 (见表2) 0037 表2:5株变异菌株与对照在PD液体培养基发酵情况表 0038 0039 4、 遗传稳定性验证 0040 l、 将诱变筛选后得到的菌株进行20次传代， 然后再进行云芝栽培试验， 与第一代 比较， 选择菌丝体多糖产量稳定(即各代菌株的产量之间不存在显著性差异， 统计学分析， 方差pO.05)、 性状无变化的作为最终的云芝诱变高产菌株。 最终筛选到一株抗病高产云。
22、芝 诱变菌株， 比原高产出发菌株产量高35.9， 遗传性状稳定， 保藏编号为CGMCC No.10903。 0041 5、 高产多糖的云芝新菌株最佳最佳培养条件及最佳液体发酵参数的研究。 0042 以发酵产物菌丝体多糖为指标， 从培养基的营养、 PH、 发酵时间等进行筛选适合高 产多糖新菌株的最佳发酵参数， 从摇瓶培养到工厂发酵生产的不同发酵参数， 提高工厂化 生产云芝多糖的得率， 为工厂化生产云芝多糖提供成熟的工艺。 0043 高产多糖最佳培养基配方的筛选 说明书 4/6 页 6 CN 105219657 B 6 0044 (最适碳源的确定、 最适氮源的确定、 碳氮比(C/N)对发酵的影响、。
23、 pH测定) 0045 在云芝液体发酵最适碳源、 氮源、 碳氮比(C/N)的研究科研工作者已研究很多， 并 且已研究出云芝液体发酵最佳的碳源、 氮源、 碳氮比(C/N)， 本研究团队运用多年在食药用 菌液体发酵中研究出的液体发酵培养基配方作为基本发酵培养基(葡萄糖20g， 玉米粉20g， 豆饼粉10g， KH2PO410g， MgSO45g， VBl100mg， H2O1000ml)结合国内一些科研工作者在云芝液体 发酵的研究方法以C/N在20左右进行筛选， 以发酵产物菌丝体产量、 多糖为指标进行研究筛 选得出一组适合高产多糖的云芝新菌株最佳培养基。 最佳培养基为： (葡萄糖30g， 玉米粉 。
24、30g， 豆饼粉15g， 蛋白胨3克， KH2PO410g， MgSO45g， VBl100mg， H2O1000ml)见表3。 0046 表3： SYZ9液体发酵接种量8、 140转/分旋转式摇床28避光培养6天 0047 0048 最佳培养基为： 葡萄糖30g， 玉米粉30g， 豆饼粉15g， 蛋白胨3克， KH2PO410g， MgSO45g， VBl100mg， H2O1000ml,C:N为19:1。 0049 从实验室到工厂化生产过程中的不同参数变化的研究 0050 (以生物量、 多糖产量、 最短发酵时间为工厂化生产参数) 0051 实验室摇瓶液体发酵试验 0052 0053 实验室。
25、摇瓶液体发酵试验： 新菌株SYZ9以最佳培养基为配方， 培养温度28， 摇床 转速150转/分钟， 接种量8。 摇瓶液体发酵试验发现当PH值由低到高在上升然后再下降， 达到最高时就是最佳发酵时间点。 整个发酵过程中还原糖在降低， 到发酵结束时还原糖基 本没有太大的变化。 实验室摇瓶液体发酵试验最佳时间为6天， 发酵终产物， 云芝菌丝体干 重28.42g、 菌丝体多糖含量8.6、 每升发酵物可产云芝菌丝体多糖2.41g。 0054 工厂化100L发酵罐液体发酵试验 说明书 5/6 页 7 CN 105219657 B 7 0055 0056 注： 发酵未完成时由于玉米淀粉的存在， 运用蒽酮硫酸法。
26、检测时多糖数值偏高。 0057 工厂化100升液体发酵罐试验： 新菌株SYZ9以最佳培养基为配方， 发酵罐(通气加 搅拌)容积100L， 装液量60L， 搅拌转速150r/win， 通气量1： 0.5-1， 压差法接种， 接种量为 8， 2728条件下培养。 添加0.1豆油作为消泡剂。 整个发酵过程发现与实验室摇瓶液 体发酵试验具有一致性， 发酵罐发酵时间60小时最佳， 发酵终产物， 云芝菌丝体干重 26.58g、 菌丝体多糖含量8.5、 每升发酵物可产云芝菌丝体多糖2.26g。 0058 6、 通过低能N+注入诱变得到一株液体发酵高产多糖的云芝新菌株， 对新菌株最佳 培养基及液体参数的研究使。
27、发酵云芝多糖产量高于高产出发菌株50,每升液体发酵量菌 丝体多糖达到2.26克。 0059 0060 多糖检测方法： 蒽酮硫酸法测定 0061 还原糖检测方法： DNS法测定 0062 培养基配方： 0063 再生培养基： RM4再生培养基： 麦芽糖5克， 葡萄糖10克， 酵母粉4克， 0.6mol/L甘露 醇， 琼脂5.5克、 PH自然， 蒸馏水定容至总体积为1000mL。 0064 PD液体培养基： 马铃薯200g煮汁， 葡萄糖20g， KH2PO410g， MgS()45g， H2O1000m1。 0065 基本发酵培养基： 葡萄糖20g， 玉米粉20g， 豆饼粉10g， KH2PO410g， MgSO45g， VBl100mg， H2O1000ml。 说明书 6/6 页 8 CN 105219657 B 8 。