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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610947934.5 (22)申请日 2016.10.26 (71)申请人 浙江海洋大学 地址 316022 浙江省舟山市临城街道长峙 岛海大南路1号 (72)发明人 杨最素张亚茹丁国芳余方苗 黄芳芳闫海强 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 代理人 徐佳晶 (51)Int.Cl. C07K 5/078(2006.01) A61K 38/05(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 36/748(2006.01)。
2、 A61K 35/618(2015.01) A61K 31/69(2006.01) (54)发明名称 一种青蛤抗肿瘤提取物 (57)摘要 本发明公开了一种青蛤抗肿瘤提取物。 本发 明以青蛤为原料， 通过超滤、 HPLC纯化制得青蛤 抗肿瘤提取物， 该提取物的分子结构为： 随着青蛤抗肿瘤 提取物浓度的增加， 作用时间的延长， DU-145细 胞的增殖抑制率明显上升。 细胞早期凋亡率及线 粒体膜电位下降所占百分率增加， 且随着青蛤抗 肿瘤提取物浓度增加， 早期凋亡率增加较为明 显， 其膜电位下降更为显著， 即预示线粒体凋亡 信号通路在青蛤抗肿瘤提取物诱导的DU-145细 胞凋亡过程中起着重要作用，。
3、 具有抗肿瘤效果。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 107056886 A 2017.08.18 CN 107056886 A 1.一种青蛤抗肿瘤提取物， 其特征在于： 该提取物的分子结构为： 2.一种青蛤抗肿瘤提取物的应用制剂， 其特征在于： 按重量份数含有如权利要求所述 的青蛤抗肿瘤提取物1-5份、 灵芝1-3份、 黄芪1-5份、 茯苓1-10份、 丹参10-20份、 半支莲1-10 份、 白花舌蛇草2-10份、 葛根3-20份、 0.01-0.1份胺氰基硼烷和0.01-0.1份胺羧基硼烷。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107056886 A 2 一种青蛤抗肿瘤提取物 技。
4、术领域 0001 本发明涉及一种海洋生物活性物质， 具体涉及一种青蛤抗肿瘤提取物。 背景技术 0002 前列腺癌的发病率在男性恶性肿瘤中位居首位， 好发于老年男性。 在我国， 前列腺 癌发病率呈逐年上升趋势， 居泌尿系统肿瘤的首位， 严重威胁老年男性的健康。 传统治疗方 法如手术、 放疗和冷冻治疗等效果并不理想， 且复发率比较高， 并且当复发的前列腺癌转化 为非雄激素依赖性时， 治疗将更困难； 而化疗药物产生耐药性后， 疗效更差并毒副作用明 显。 因此， 寻找抗前列腺癌药物成为学者们研究的热点。 海洋是发现新型抗癌药物的一个丰 富的资源宝库， 多种海洋寡肽、 糖胺聚糖等都具有抗肿瘤、 抗病毒、。
5、 抗真菌等生理活性。 从双 壳贝类中提取的文蛤寡肽Mere15、 菲律宾蛤仔寡肽对人慢性骨髓性白血病K562细胞、 前列 腺癌细胞具有增殖抑制作用， 并导致浓度依赖性细胞凋亡； 从近江牡蛎提取的糖胺聚糖具 有体内外抗肿瘤活性， 不仅可以抑制K562、 CNE-2Z、 Hela细胞的生长， 还对CTX损伤小鼠的免 疫功能有一定的修复作用。 青蛤 （Cyclina sinensis） 属于软体动物门， 鳃瓣纲， 异齿亚纲， 帘蛤目、 帘蛤科， 含高蛋白、 低脂肪和高含量的不饱和脂肪酸， 味道鲜美， 具有很好的营养价 值。 青蛤在民间入药具有悠久的历史， 是一种重要的海洋药物， 具有软坚散结、 清热。
6、燥湿及 镇咳作用。 Changxing J等从青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性， 对人胃癌BGC- 823细胞的生长具有强烈的抑制作用。 然而， 目前关于青蛤寡肽的提取及活性的研究报道并 不多， 本实验采用蛋白酶酶解青蛤内脏， 经正交实验获得最佳酶解条件， 经分离纯化， 筛选 出活性寡肽， 研究其体外抗人前列腺癌DU-145 细胞的活性， 以期为青蛤活性寡肽的制备及 抗癌作用研究提供实验依据。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗肿瘤功效的青蛤抗肿瘤提取物。 0004 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为： 一种青蛤抗肿瘤提取物， 该提 取物的分子结构为： 。
7、采用上述成分配制青蛤抗肿瘤提取物的应用制剂， 按重量份数含有青蛤抗肿瘤提取物 1-5份、 灵芝1-3份、 黄芪1-5份、 茯苓1-10份、 丹参10-20份、 半支莲1-10份、 白花舌蛇草2-10 份、 葛根3-20份。 可预期的能达到一定的抗肿瘤效果。 0005 该青蛤抗肿瘤提取物肽采用如下方式制备： 1） 取青蛤匀浆， 以活性酶在最适酶解温度及pH值条件下， 加蛋白酶20012000 U/g、 保 说明书 1/4 页 3 CN 107056886 A 3 温410 h进行酶解； 然后后灭活， 在04 oC、 12000 r/min的条件下离心， 取上清； 2） 取最佳酶种及最优酶解条件下。
8、酶解的上清液， 用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超 滤； 3） 取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离， 浓度： 0.010.5g/mL， 离心后取上清过0.22 m滤膜， 进行洗脱； 收集洗脱产物， 冷冻干燥； 4） 取组分过HPLC进一步分离得到青蛤抗肿瘤提取物； 青蛤抗肿瘤提取物的分子结构为： 与现有技术相比， 本发明提供的青蛤抗肿瘤提取物的优点在于： 本发明工艺科学合理， 操作简单， 随着青蛤抗肿瘤提取物浓度的增加， 作用时间的延长， DU-145细胞的增殖抑制率 明显上升； 倒置显微镜下观察、 AO/EB荧光染色、 Hoechst 33258荧光染色及透射电镜技术实 验表明细胞出现凋亡的。
9、形态学变化； 流式细胞仪结果表明， 细胞早期凋亡率及线粒体膜电 位下降所占百分率增加， 且随着青蛤抗肿瘤提取物浓度增加， 早期凋亡率增加较为明显， 其 膜电位下降更为显著， 即预示线粒体凋亡信号通路在青蛤抗肿瘤提取物诱导的DU-145细胞 凋亡过程中起着重要作用。 同时， 本发明所制备的青蛤抗肿瘤提取物是天然原料经酶解制 得， 安全、 无毒副作用， 抗肿瘤活性显著， 青蛤抗肿瘤提取物可以作为抗癌药品、 食品添加 剂、 功能食品进行开发。 附图说明 0006 图1本为发明实施例分子结构示意图； 图2本为发明实施例琼脂糖凝胶柱洗脱峰示意图； 图3本为发明实施例峰3高效液相色谱图； 图4本为发明实施。
10、例峰3组分在280nm处高效液相色谱图； 图5为本发明实施例对DU-145细胞的增殖抑制作用示意图。 具体实施方式 0007 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0008 实施例： 一种青蛤抗肿瘤提取物， 该提取物的分子结构为： 随着青蛤抗肿瘤提取物浓度的增加， 作用时间的延长， DU-145细胞的增殖抑制率明显 说明书 2/4 页 4 CN 107056886 A 4 上升； 倒置显微镜下观察、 AO/EB荧光染色、 Hoechst 33258荧光染色及透射电镜技术实验表 明细胞出现凋亡的形态学变化； 流式细胞仪结果表明， 细胞早期凋亡率及线粒体膜电位下 降所占百分率增加， 且随着青蛤。
11、抗肿瘤提取物浓度增加， 早期凋亡率增加较为明显， 其膜电 位下降更为显著， 即预示线粒体凋亡信号通路在青蛤抗肿瘤提取物诱导的DU-145细胞凋亡 过程中起着重要作用。 同时， 本发明所制备的青蛤抗肿瘤提取物是天然原料经酶解制得， 安 全、 无毒副作用， 抗肿瘤活性显著。 0009 一种青蛤抗肿瘤提取物的应用制剂按重量份数含有青蛤抗肿瘤提取物1-5份、 灵 芝1-3份、 黄芪1-5份、 茯苓1-10份、 丹参10-20份、 半支莲1-10份、 白花舌蛇草2-10份、 葛根3- 20份、 0.01-0.1份胺氰基硼烷和0.01-0.1份胺羧基硼烷。 采用上述组合的制剂尤其是胺氰 基硼烷和胺羧基硼烷。
12、的使用能使实验结果更好。 0010 青蛤抗肿瘤提取物的制备方法如下： 1） 取青蛤匀浆， 以活性酶在最适酶解温度及pH值条件下， 加蛋白酶20012000 U/g、 保 温410 h进行酶解； 然后后灭活， 在04 oC、 6000 12000 r/min的条件下离心， 取上清； 2） 取上清液， 用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤； 3） 取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离， 浓度： 0.010.5g/mL， 离心后取上清过0.22 m滤膜， 进行洗脱； 收集洗脱产物， 冷冻干燥； 4） 取组分过HPLC进一步分离得到青蛤抗肿瘤提取物。 0011 活性酶为碱性蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或。
13、中性蛋白酶或胃蛋白酶。 0012 步骤3） 洗脱的条件为： 柱尺寸： 10300-310 mm； 柱料： 琼脂糖； 柱料颗粒大小： 10 2 m； 上样量： 500 L； 流动相： 超纯水； 洗脱液流速： 0.5 mL/min； 检测波长： 280nm； 自动 收集体积： 3.2 mL/管。 0013 步骤4)色谱条件为， 色谱柱： 填料粒径为5 m 4.6250 mm的ZORBAX SB-C18分析 型色谱柱； 检测波长： 214 nm， 280 nm； 流速： 0.8 mL/min； 流动相A为含0.05% TFA的乙腈 ， 流动相B为含0.06% TFA的超纯水 ， 采用梯度洗脱方式， 。
14、流动相A与流动相B的流动相体积比 为20 80； 柱温： 25oC； 自动进样， 进样量： 500 L； 洗脱方式为： 0%-0% B 洗脱4 min； 0%-100% B 洗脱25 min； 100%-100% B 洗脱6 min。 0014 选取峰3的HPLC保留时间约为15 min的峰组分进行收集， 峰面积38.47， 峰高 2829.00， 即为青蛤提取物的产品， 分子量301.34Da， 命名为目标肽2； 同样收集的纯品再次 上HPLC检测纯度， 在280 nm处约8min时出现主要单一峰， 即纯的青蛤提取物。 0015 实验中样品与试剂 青蛤， 购于舟山市菜市场 （经浙江海洋学院赵。
15、盛龙教授鉴定） 。 经洗净、 去壳、 取内脏， 并 用0.1 mol/L的NaoH溶液浸泡去脂， 于蒸馏水中轻轻搅拌去杂质， 加一倍体积的纯水匀浆后 备用。 0016 青蛤寡肽： 本实验室自制， 分子量为3 ku； 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶和胃蛋白酶， 北京亚太恒信生物科技有限公司； F12 培养基， Gibco 公司； 胎牛 血清， 杭州四季青生物工程公司； MTT、 胰蛋白酶， Sigma公司； AO/EB （吖啶橙/溴化乙锭） ， 杭 州昊天生物技术有限公司； JC-1细胞线粒体膜电位试剂盒， 上海贝博生物； nm23H1单克隆抗 体为Santa Cruz公司产。
16、品， 工作浓度为1： 100， 试剂盒为DAKO公司产品。 其余试剂均为分析 纯。 说明书 3/4 页 5 CN 107056886 A 5 0017 细胞株采用人前列腺癌DU-145细胞购于中科院上海细胞所， 由本室传代保存。 0018 主要仪器与设备 CF16RX型 高速低温离心机， 日本日立公司； Forma3111 CO2培养箱， 美国Thermo公 司； Cogent u Scale 超滤系统， 默克密理博； ApurifierUPC100 快速蛋白液相色谱系统， GE Healthcare； Agilent-1260高效液相色谱仪， 美国安捷伦公司； 超净台， 上海智城分析仪器 制。
17、造有限公司； CKX4倒置显微镜、 BX2-FLB3荧光显微镜和CCD-NC6051显微摄像， 日本 OLYMPUS公司； 酶标仪， 美国Bio-Rad公司； easy Cyte6 HT-2L流式细胞仪， 美国Millipore 公司； HITACHI H-7650透射电镜， 日立公司。 0019 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。 显然， 本发明 不限于以上实施例， 还可以有许多变形。 本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 107056886 A 6 图 1 图 2 说明书附图 1/3 页 7 CN 107056886 A 7 图 3 图 4 说明书附图 2/3 页 8 CN 107056886 A 8 图 5 说明书附图 3/3 页 9 CN 107056886 A 9 。