一种喹啉生物碱的二聚物盐及其制备方法和应用 (一)技术领域
本发明涉及一种喹啉生物碱的二聚物盐及其制备方法和应用。
(二)背景技术
海洋中蕴藏着丰富的微生物资源，海洋的特殊复杂环境决定了海洋微生物特殊的代谢方式，代谢物化学结构具有极大的复杂性和多样性。海洋真菌是海洋微生物的重要组成类型，海洋真菌次级代谢产物研究从1988年陆续有文献报道，直到1992年，从海洋真菌中发现的新的化合物只有15个，在1994年之后有所增加。最近几年，随着全世界对海洋生物资源研究的不断深入，海洋真菌由于其资源优势和新颖的次生代谢产物，成为海洋天然产物的研究热点。海洋真菌能产生丰富的生物活性次级代谢产物，如萜类、肽类、生物碱类和酯类等，许多化合物因为具有一定的抗菌、细胞毒、抗氧化、抗肿瘤、抗滤过性病原体、酶抑制等活性，而成为药物研发的新资源。
本发明从海洋来源真菌Penicillium sp.701中分离得到天然化合物3-仲-丁基-4甲基-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，4-b]喹啉-1，9(4H)-二酮二聚物盐，属于喹啉生物碱的二聚物盐类化合物，该化合物具有显著的抗肿瘤活性。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种喹啉生物碱的二聚物盐及其制备方法和应用。
本发明所述喹啉生物碱的二聚物盐为如式(I)所述的两个3-仲-丁基-4甲基-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，4-b]喹啉-1，9(4H)-二酮配体与羟基氯化镁和水分子络合形成的二聚物盐：
一种制备所述的喹啉生物碱的二聚物盐的方法，所述制备方法是将海洋来源真菌Penicillium sp.701用人工海水GYT培养基培养后所得菌体用甲醇浸提制得甲醇提取物，用200～300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为10～0∶1的氯仿/甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，这里体积比为0∶1的氯仿/甲醇为洗脱液的含意即只用甲醇为洗脱液，洗脱液的流速为1～10ml/min，每种浓度的洗脱液洗脱时间为30min～120min，将各流分回收洗脱溶剂，用硅胶GF254板为薄层层析板，体积比为5∶1的氯仿/甲醇混合液为展开剂，以碘化铋钾生物碱为显色剂，进行薄层层析，收集所有Rf为0.5的流分合并，用甲醇进行重结晶，得到所述的喹啉生物碱的二聚物盐，即3-仲-丁基-4甲基-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，4-b]喹啉-1，9(4H)-二酮的二聚物盐。
优选的，本发明所述的喹啉生物碱的二聚物盐的制备方法，所述洗脱液的流速为1ml/min，所述每种浓度洗脱液的洗脱时间为30min，所述洗脱液的浓度变化为：氯仿/甲醇体积比为10∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、甲醇。
本发明所述的菌体按如下步骤制得：海洋来源真菌Penicilliumsp.701接种于人工海水GYT培养基，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到菌液，分离得到湿菌体，通常每20L人工海水GYT培养基在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到的菌液能分离得湿菌体20g。所述人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。所述人工海水每100ml组成为：NaCl 2.448g，Na2SO40.3917g，KCl 0.0664g，KBr 0.0096g，SrCl2 0.0024g，MgCl·6H2O0.4981g，CaCl2·H2O 0.1102g，NaHCO3 0.0192g，H3BO3 0.0026g，NaF 0.0004g，蒸馏水100ml。
本发明所述的喹啉生物碱的二聚物盐的制备方法，所述的甲醇浸提方法如下：将湿菌体加入甲醇中浸没，在室温条件下冷浸三次，每次冷浸一周，通常每次用来提取湿菌体的甲醇量是100～300ml/g，合并冷浸提取液，回收溶剂旋转蒸干甲醇，得到浸膏即甲醇提取物。
本发明实验证明所述喹啉生物碱的二聚物盐在制备抗肿瘤药物中的有应用前景。
本发明所述的喹啉生物碱的二聚物盐具有显著的抗肿瘤作用，体外对人肺癌细胞H460半抑制率浓度为19.38±0.15μg/ml，可能是潜在的抗肿瘤药物。
(四)附图说明
图1实施例1得到的喹啉生物碱的二聚物盐化合物的单晶衍射图。
(五)具体实施例
实施例1
喹啉生物碱的二聚物盐的制备：
菌体制得过程：人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。
将海洋来源真菌Penicillium sp.701(台州科技局提供)接种于20L人工海水GYT培养基中，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到菌液，其中分离得到湿菌体20g。
将所得菌体20g，用3L甲醇室温冷浸，冷浸三次，每次在室温冷浸一周，合并冷浸提取液，回收溶剂后得到浸膏9.4g，用200-300目柱层析硅胶(80g)进行柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比10∶1)梯度洗脱至甲醇冲柱，梯度洗脱所用的洗脱液依次为：氯仿/甲醇体积比为10∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、甲醇；洗脱液的流速为1ml/min，每种浓度洗脱液的洗脱时间为30min，浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂，以紫外灯检测，GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后，根据Rf值分组。将展开剂氯仿/甲醇体积比为5∶1，Rf＝0.50的组份合并，蒸干溶剂，用甲醇进行重结晶，得到喹啉生物碱的二聚物盐8.3mg，单晶衍射图见图1。
实施例2
喹啉生物碱地二聚物盐的制备：
菌体制得过程：人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。
将海洋来源真菌Penicillium sp.701接种于20L人工海水GYT培养基，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到20L体积的菌液，其中分离得到湿菌体20g。
将所得菌体，用3L甲醇室温冷浸三次，每次一周，回收溶剂后得到浸膏10.6g，用200-300目柱层析硅胶(90g)进行柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比9∶1)梯度洗脱至甲醇冲柱，梯度洗脱所用的洗脱液依次为：氯仿/甲醇体积比为9∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为3∶1、氯仿/甲醇体积比为1∶1、甲醇，洗脱液的流速为10ml/min，每种浓度洗脱液的洗脱时间为120min，浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂，以紫外灯检测，GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后，根据Rf值分组。将展开剂为氯仿/甲醇体积比为5∶1，Rf＝0.50的组份合并，蒸干溶剂，用甲醇进行重结晶，得到喹啉生物碱的二聚物盐8.8mg。
实施例3
喹啉生物碱的二聚物盐的制备：
菌体制得过程：人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。
将海洋来源真菌Penicillium sp.701接种于20L人工海水GYT培养基，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到20L体积的菌液，其中分离得到湿菌体20.5g。
将所得菌体，用2L甲醇室温冷浸三次，每次一周，回收溶剂后得到浸膏8.8g，用200-300目柱层析硅胶(90g)进行柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比10∶1)梯度洗脱至甲醇冲柱，梯度洗脱所用的洗脱液依次为：氯仿/甲醇体积比为10∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、甲醇，洗脱液的流速为2ml/min，每种浓度洗脱液的洗脱时间为60min，浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂，以紫外灯检测，GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后，根据Rf值分组。将展开剂为氯仿/甲醇体积比为5∶1，Rf＝0.50的组份合并，蒸干溶剂，用甲醇进行重结晶，得到喹啉生物碱的二聚物盐7.6mg。
实施例4
喹啉生物碱的二聚物盐的制备：
菌体制得过程：人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。
将海洋来源真菌Penicillium sp.701接种于20L人工海水GYT培养基，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到20L体积的菌液，其中分离得到湿菌体20.9g。
将所得菌体，用4L甲醇室温冷浸三次，每次一周，回收溶剂后得到浸膏11g，用200-300目柱层析硅胶(90g)进行柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比10∶1)梯度洗脱甲醇冲柱，梯度洗脱所用的洗脱液依次为：氯仿/甲醇体积比为9∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为7∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为5∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为3∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、氯仿/甲醇体积比为1∶1、甲醇，洗脱液的流速为4ml/min，每种浓度洗脱液的洗脱时间为80min，浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂，以紫外灯检测，GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后，根据Rf值分组。将展开剂为氯仿/甲醇体积比为5∶1，Rf＝0.50的组份合并，蒸干溶剂，用甲醇进行重结晶，得到喹啉生物碱的二聚物盐9.0mg。
实施例5
喹啉生物碱的二聚物盐的制备：
菌体制得过程：人工海水GYT培养基每100ml组成为：葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.1g，琼脂2g，60ml人工海水，溶剂为40ml蒸馏水，初始pH为7.5。
将海洋来源真菌Penicillium sp.701接种于20L人工海水GYT培养基，在28℃，200rpm条件下摇床培养1个月得到20L体积的菌液，其中分离得到湿菌体20g。
将所得菌体，用6L甲醇室温冷浸三次，每次一周，回收溶剂后得到浸膏10g，用200-300目柱层析硅胶(90g)进行柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比10∶1)梯度洗脱至甲醇冲柱，梯度洗脱所用的洗脱液依次为：氯仿/甲醇体积比为10∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、甲醇，洗脱液的流速为6ml/min，每种浓度洗脱液的洗脱时间为100min，浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂，以紫外灯检测，GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后，根据Rf值分组。将展开剂为氯仿/甲醇体积比为5∶1，Rf＝0.50的组份合并，蒸干溶剂，用甲醇进行重结晶，得到喹啉生物碱的二聚物盐9.0mg。
实施例6：化合物测试
仪器：Nicolet 5DX-FT-IR红外光谱仪(KBr压片)，岛津UV-1800紫外分光光度计，Thermo Scientific ITQ 1100TM型质谱仪，BruckerAVANCE III 500MHz型超导核磁共振波谱仪(δ/ppm，TMS内标)，254nm紫外灯，R-ASIX RAPID型单晶衍射仪。
试剂：溶剂均为分析纯试剂，未进行处理。
对实施例1制得的喹啉生物碱的二聚物盐化合物进行化合物测试：
C32H36N4O4Mg(OH)Cl·H2O，白色针状晶体，IR vmaxKBr：3440.96，2964.49，1684.89，1606.58，1526.53，1456.00，1420.99，1384.33，1265.75，1225.87，1177.16，1119.96，816.70，768.99，640.94，531.56，468.75cm-1；UVmaxMeOH：245nm；HR-ESI-MS：m/z 563.2657[M+Na-Mg(OH)Cl·H2O，理论值：563.2634]+；293.1275[M+Na-Mg(OH)Cl·H2O-C16H18N2O2，理论值：293.1266]+；1H-和13C-NMR(CD3OD，500MHz)见表1；化合物的单晶衍射图见附图1，该化合物的空间群为“P-1”，R1＝0.1216，最大残余密度峰1.05在C-17附近。
表1喹啉生物碱的二聚物盐化合物的NMR数据(500MHz，CD3OD)
实施例7：抗肿瘤活性测试
我们对实施例1-5制得的喹啉生物碱的二聚物盐化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。
方法：采用MTT法进行人肺癌细胞H460体外抑制实验。细胞在37℃，5％的二氧化碳，95％的湿度，10％牛血清白蛋白的DMEM培养液中，放在25cm2培养瓶中培养。在96孔板每孔中接种100μl密度为2×104个/ml的人肺癌细胞H460在上述条件下培养48小时。去除培养液，在96孔板每孔中接种不同浓度的喹啉生物碱二聚物盐(0.1％DMSO为溶媒)培养液200μl，在相同条件下进一步培养48小时。然后在96孔板每孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL的PBS溶媒)培养4小时。去除培养液，加入150μL的DMSO在490nm下酶标仪测定吸光度并计算。
结果：所述实施例1-5制得的喹啉生物碱的二聚物盐具有显著的抗肿瘤作用，体外对人肺癌细胞H460半抑制率浓度(IC50)为19.38±0.15μg/ml(见表2)，这提示该化合物可能是潜在的抗肿瘤药物。
表2实施例1-5制得的喹啉生物碱的二聚物盐体外抗人肺癌细胞H460活性