作为CDK抑制剂的perharidines 本发明涉及三取代的或四取代的咪唑并[4，5-b]吡啶类，涉及它们的用途以及生产方法。
细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)在细胞分裂、凋亡、转录、神经元功能、和胞吐的调节方面起到重要调节剂的作用。
CDK在人肿瘤中频繁的失调以及CDK5在各种疾病中的牵连已经刺激了对化学的CDK抑制剂的活跃研究，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、和Nieman-Pick病、缺血和中风，以及各种肾脏疾病(诸如，肾小球膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、坍塌性肾小球病、增生性狼疮肾炎、多囊肾病(PKD)、糖尿病性肾病和急性肾脏损伤、顺铂诱导的肾中毒)、炎症(诸如，胸膜炎、关节炎、青光眼)、II型糖尿病、病毒感染(HSV、HCMV、HPV、HIV)、单细胞寄生虫病(诸如，由于变形体(Plasmodium)、利什曼原虫(Leishmania)等引起的单细胞寄生虫病)等等。
在已经识别的许多抑制剂中，一种早期的化合物-Roscovitine似乎是相对有效的和有选择性的。
Roscovitine是下式的嘌呤类化合物：
由于其细胞生长抑制和神经保护活性，这种嘌呤化合物目前被认为是分别用于治疗癌症、肾病、各种神经变性疾病和炎症的有效的药物。
此外，蛋白质激酶的药理学抑制剂的选择性是重要的问题，并且与包括已经商业化的抑制剂的其它抑制剂相比，Roscovitine是相对地选择性的CDK抑制剂。然而Roscovitine与吡哆醛激酶相互作用。
关于Roscovitine及其衍生物与吡哆醛激酶的相互作用的研究报道在Tang等人，J.Biol.Chem，280，35，September 2，2005，31220-31229中。
在ATP和Zn2+的存在下，吡哆醛激酶催化吡哆醛、吡多胺、和维生素B6的磷酸化。这构成了合成吡哆醛5′-磷酸酯的必要步骤，所述吡哆醛5′-磷酸酯是维生素B6的活性形式，是超过140种酶的辅助因子。因此，与吡哆醛激酶系统的相互作用可能导致不希望的副作用。
因此，一方面，这种相互作用对合成维生素B6的活性形式有害，和/或，而另一方面，对Roscovitine及其衍生物在使用这类CDK抑制剂治疗的患者中的可用性有害。
因此，本发明的目的是提供具有CDK抑制剂性质但是与吡哆醛激酶相互作用很少或没有相互作用的Roscovitine的衍生物。
为此，本发明提出了下式I的化合物：
式I
其中：
A为CH或N或O，
R3为：
-H，或
-C1-C5烷基基团，或
-＝O，或
-(C1-C3)烷基-C＝O基团，其中所述烷基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代，
R4为：
-H，或
任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的-C1-C6烷基基团，
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的(C1-C5)烷基(C3-C6)环烷基基团，或
-＝O，或
-O＝CCF3，或
-被酯基团(诸如，O-酰基基团)、或衍生自天然或非天然氨基酸的氨基酰基基团，或乙酰基基团或烟酰基基团取代的C1-C6烷基基团，
或者，A、R3和R4合起来形成C5-C7环烷基基团，任选地包含一个或多个杂原子，优选哌嗪基团，
B为O或S或NH或卤素原子，
R1为：
-任选地为支链的和/或任选地被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基基团，或
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或任选地包含一个或多个杂原子取代的芳基基团，或
-C1-C5烷基芳基基团，该芳基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，
R2为：
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团、和/或CF3基团取代的芳基基团，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基或3-噻吩基基团，或
-甲基联芳基基团，其中每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-甲基芳基基团，所述芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子取代，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，
-联芳基基团，每个芳基环任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，或每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，
或者，B和R2合起来形成非芳香族环，
R5为：
-卤素原子，或
-氢原子，或
-C1-C5烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，或
-(C1-C4)烷基(C3-C6)环烷基基团，其中所述环烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，
及其盐、水合物、和立体异构体。
如本文中使用的，术语“联芳基”表示通过单键连接的两个芳基环，术语“羧酸基团”是指-COOH基团。
在本发明的第一优选实施方案中，在式I中，A为N。
在本发明的第二优选实施方案中，在式I中，A为CH。
在本发明的第三优选实施方案中，在式I中，A为O。
在本发明的每个优选实施方案中，在式I中，优选R1基团为乙基、或甲基、或异丙基、或甲基环丙基、或环戊基、苯基基团、或苄基基团或甲基吡啶基基团，或
在本发明的每个优选实施方案中，在式I中，优选的B-R2基团为以下表1中列举的那些之一：
表1
在本发明的每个优选实施方案中，在式I中，优选R4-A-R3取代基为以下表2中列举的基团之一：
表2
另外，在本发明的每个优选实施方案中，优选R4-A-R3为酯官能度。
实际上，尽管这些酯表现出中等或低的体外活性，但是它们作为本发明的式I的生物活性化合物的前体药物在体内起作用。
在作为本发明的式I化合物地酯的这种前体药物中，优选的R4-A-R3基团是以下表3中列举的那些。
表3
优选的本发明化合物为下式Ia的化合物：
式Ia。
这种化合物具有绝对构型(R)，以下也称为“perharidine A”。
但是，也优选以下式Ib的perharidine A的(S)异构体：
式Ib。
这个化合物在以下也称为“perharidine B”。
本发明的另一个优选的化合物为以下式Ic：
式Ic。
这个化合物在以下也称为“perharidine C”。
本发明的另一个优选化合物为以下式Id：
式Id。
这个化合物在以下也称为“perharidine D”。
但是还优选以下式Ie的本发明化合物：
式Ie。
以下式If的本发明化合物也是优选的化合物：
式If。
还优选以下式Ig的本发明化合物：
式Ig。
此外，还优选以下式Ih的本发明化合物：
式Ih。
上述的每个和所有本发明化合物的立体异构体、水合物、和盐也都在本发明范围内。
如所指出的，在式Ia-Ig的化合物中，A为N。
但是本发明的其它优选化合物是其中A为CH或为O的对应于式Ia-Ig的这些化合物的那些化合物。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员公知的任何适合的方法生产。
然而，在A为N时，一方面，这些化合物不能通过合成2，6，9-三取代嘌呤的经典方法来制备。
这个经典的方法涉及其中在氨基-醇的存在下在145℃-170℃的温度加热2-氯取代的嘌呤以得到例如Roscovitine的步骤。
但是在将这种方法应用于相应的3，5，7-三取代的咪唑并[4，5-b]吡啶时，反应不发生。
在提高温度时，仅得到降解产物。
另一方面，还发现用于制备去氮杂嘌呤的经典方法也不适合。
实际上，最先由Francis，JE和Moskal，MA在Can J Chem 1992，70，第1288-1295页中描述的这种经典的方法首先涉及使用磷酰氯作为试剂使仲酰胺与氨基氰基咪唑反应形成脒。在第二步骤中，使用NaH作为碱将脒环化为咪唑并吡啶。这种方法不能用于制备本发明的化合物，因为它仅提供在7位带有未被取代的氨基基团的衍生物。另外，在取代基包含羟基基团时，在形成杂环的过程中应该将它们保护起来。在由Koch，M在WO 2006/027366中描述的另一个合成方法中，可以在5位引入的取代基的性质限制为由亚硝基基团形成，并且通过相同的方法仅描述了未被取代的7-氨基基团。
为了缓和现有技术的方法中的缺点，本发明提出了原始的和通用的方法，其中使用了以下式II的化合物：
式II
其中：
B为O或S或NH或卤素原子，
R1为：
-任选地支链的和/或任选地被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基基团，或
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-C1-C5烷基芳基基团，所述芳基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，
R2为：
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团、和/或CF3基团取代的芳基基团，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基或3-噻吩基基团，或
-甲基联芳基基团，其中每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-甲基芳基基团，所述芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3取代基团，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，
-联芳基基团，每个芳基环任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，或每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，
或者B和R2合起来形成非芳香族环，
R5为：
-卤素原子，或
-氢原子，或
-任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代的C1-C5烷基基团，或
-(C1-C4)烷基(C3-C6)环烷基基团，其中所述环烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，
X为Cl或Br或I或NH2。
这些式II的化合物也在本发明范围内。
优选的式II的化合物是其中X为I的那些。
因此，本发明还提出了用于生产以下式I的化合物的方法：
式I
其中：
A为N，
R3为：
-H，或
-C1-C5烷基基团，或
-＝O，或
-(C1-C3)烷基-C＝O基团，其中所述烷基任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代，
R4为：
-H，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的C1-C6烷基基团，
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的(C1-C5)烷基(C3-C6)环烷基基团，或
-＝O，或
-O＝CCF3，或
-被酯基团(诸如，O-酰基基团)、或衍生自天然或非天然氨基酸的氨基酰基基团、或乙酰基基团或烟酰基基团取代的C1-C6烷基基团，
或者A、R3和R4合起来形成任选地包含一个或多个杂原子的C5-C7环烷基基团，优选为哌嗪基团，
B为O或S或NH或卤素原子，
R1为：
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基基团，或
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-C1-C5烷基芳基基团，所述芳基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，
R2为：
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基或3-噻吩基基团，或
-甲基联芳基基团，其中每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-甲基芳基基团，所述芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，
-联芳基基团，每个芳基环任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，或者每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，
或者B和R2合起来形成非芳香族环，
R5为：
-卤素原子，或
-氢原子，或
-任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代的C1-C5烷基基团，或
-(C1-C4)烷基(C3-C6)环烷基基团，其中所述环烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，
及其盐、水合物、和立体异构体，
包括以下反应步骤：使以下式II的化合物反应：
式II
其中B、R2、R1和R5如上述对于式I的化合物所定义的，且X为Br、Cl、I或NH2。
在本发明的方法的第一实施方案中，这个反应步骤为使其中X为Cl、Br或I的式II的化合物在催化剂的存在下并且任选地在配体诸如2，2′-双(二苯膦基)-1，1-联萘(也称为Binap)或乙二醇或二酮的存在下与以下式III的化合物偶联：
式III
其中A、R3和R4如对于式I所定义的，所述催化剂选自Pd(OAc)2、三(二亚苄基丙酮)二钯(也称为Pd2dba3)、或CuI。
在本发明方法的第二实施方案中，这个反应步骤是使其中X为NH2的式II的化合物与以下式IV的化合物偶联：
Y-R6
式IV
其中Y为I、Br或Cl，且R6为R3或R4，得到以下式V的化合物：
式V
并且在R3和R4不是H时，随后进行使式V的化合物与以下式VI的化合物偶联的步骤：
Y-R7
式VI
其中Y为I、Br或Cl，且在R6为R4时R7为R3或在R6为R3时R7为R4，
所述偶联步骤在碱性条件下进行。
在本发明方法的所有实施方案中，在每种情况中，优选X和Y是I或Br，更优选为I。
本发明还提出了本发明的或通过本发明的方法得到的化合物用作药物。
本发明的另一个目的为药物组合物，其包括至少一种本发明的、或通过本发明方法得到的化合物以及至少一种药学可接受的赋形剂。
本发明的另一个目的是本发明的或通过本发明方法得到的至少一种化合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗由于肿瘤或非肿瘤性质的细胞异常增殖所引起的疾病。
在本发明的所述用途的一个实施方案中，所述疾病为转移性或非转移性的肿瘤(诸如，实体瘤)、或白血病。
在另一个实施方案中，所述疾病为涉及CDK5和/或CDK1异常活性的神经变性疾病。
更具体地，所述神经变性疾病为帕金森氏病。
但是，所述神经变性疾病也可以是阿尔茨海默氏病和相关的Taupathies。
在另一个实施方案中，所述疾病为病毒病，诸如HIV、疱疹、巨细胞病毒等。
另外，本发明包括本发明的或通过本发明方法得到的至少一种化合物用于生产治疗疼痛的药物的用途。
此外，本发明的或通过本发明方法得到的至少一种化合物有利地用于生产药物或用在治疗肾疾病的方法中，所述肾疾病诸如肾小球膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、坍塌性肾小球病、增生性狼疮肾炎、多囊肾病、糖尿病性肾病、急性肾脏损伤、和顺铂诱导的肾中毒。
但是，本发明的或通过本发明方法得到的至少一种化合物也可以用于生产药物和/或用于治疗炎症的方法，所述炎症诸如胸膜炎、关节炎、囊性纤维化或青光眼。
最后，本发明的化合物也可以在II型糖尿病的情况中用于增强胰腺的胰岛素产生。
在本发明的至少一种化合物的用途的所有实施方案和变体中，优选所述至少一种化合物为以下式Ia：
式Ia
更优选地，所述至少一种化合物为以下式Ib的化合物：
式Ib
但是在另一个优选的变体中，所述至少一种化合物为以下式Ic的化合物：
式Ic
然而，在本发明的至少一种化合物的用途的另一个优选变体中，所述至少一种化合物为以下式Id的化合物：
式Id
在本发明的至少一种化合物的用途的另一个优选变体中，所述至少一种化合物为以下式Ie的化合物：
式Ie
但是，所述至少一种化合物也可以是以下式If的化合物：
式If
但是，所述至少一种化合物也可以是以下式Ig的化合物：
式Ig。
此外，所述至少一种化合物也可以是以下式Ih的化合物：
式Ih。
式Ia-Ih的化合物的盐、水合物和立体异构体也可用作所述至少一种化合物。
通过参考实施例和附图阅读随后的描述可以更好地理解本发明，且使本发明的特征和优点变得显而易见，所述实施例只是说明性的并不限制本发明的范围，在附图中，
-图1示出了用分别为500μM或100μM的(R)-Roscovitine、或式Ic的化合物、或式Id的化合物进行的银染色试验的结果，用于测定本发明的化合物和Roscovitine与吡哆醛激酶的相互作用，
-图2示出了对应于图1的免疫印迹，用于显示浓度为500μM和100μM的(R)-Roscovitine、式Ic的化合物、和式Id的化合物对激酶PDXK和CDK5的影响，
-图3示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、和式Ib的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的细胞存活力的影响，
-图4示出了在SH-SY5Y神经母细胞瘤(neuroblastome)细胞中测量的不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、和式Ib的化合物对以任意荧光单位(a.f.u.)表示的半胱天冬酶活性(DEVDase)的影响，
-图5示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的MTS还原的影响，
-图6示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的以任意荧光单位(a.f.u)表示的半胱天冬酶活性(DEVDase活性)的影响，
-图7示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化作用的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图8示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的视网膜母细胞瘤总蛋白的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图9示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的RNA聚合酶II SeR2磷酸化作用的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图10示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的RNA聚合酶II总蛋白的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图11示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的Thr320的蛋白质磷酸酶1-α磷酸化的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图12示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的Mcl-1存活因子的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图13示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的p53总蛋白水平的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图14示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的p27总蛋白水平的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，
-图15示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的PARP裂解的影响。在这个图中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物，下部刻度适用于式Ic的化合物，和
-图16示出了不同浓度的(R)-Roscovitine、式Ia的化合物、式Ib的化合物、和式Ic的化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的肌动蛋白总蛋白的影响，作为用于图5-14的加载对照(loadingcontrol)。在这个图16中，上部的刻度适用于(R)-Roscovitine、式Ia和式Ib的化合物。下部刻度适用于式Ic的化合物。
本发明的化合物具有与Roscovitine的结构接近的结构，但是它们是脱氮杂嘌呤类。
更确切地，本发明的化合物为以下式I：
式I
其中：
A为CH或N或O，
R3为：
-H，或
-C1-C5烷基基团，或
-＝O，或
-(C1-C3)烷基-C＝O基团，其中所述烷基任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代，
R4为：
-H，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的C1-C6烷基基团，
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或氨基基团、和/或烷基氧基基团、和/或酮基团取代的(C1-C5)烷基(C3-C6)环烷基基团，或
-＝O，或
-O＝CCF3，或
-被酯基团(诸如，O-酰基基团)、或衍生自天然或非天然氨基酸的氨基酰基基团、或乙酰基基团或烟酰基基团取代的C1-C6烷基基团，
或者A、R3和R4合起来形成C5-C7环烷基基团，任选地包含一个或多个杂原子，优选为哌嗪基团，
B为O或S或NH或卤素原子，
R1为：
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基基团，或
任选地被一个或多个羟基基团取代的-C3-C6环烷基基团，或
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-C1-C5烷基芳基基团，所述芳基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，
R2为：
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基或3-噻吩基基团，或
-甲基联芳基基团，其中每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-甲基芳基基团，所述芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，
-联芳基基团，每个芳基环任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，或每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，
或者B和R2合起来形成非芳香族环，
R5为：
-卤素原子，或
-氢原子，或
-C1-C5烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，或
-(C1-C4)烷基(C3-C6)环烷基基团，其中所述环烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，
及其盐、水合物、和立体异构体。
式I中的优选的取代基A、B、和R1-R6以及优选的式I的化合物前述已有定义。
在Roscovitine和式I的化合物之间的本质区别在于Roscovitine的核中的7位氮被式I化合物的碳代替。
除非另有说明，Roscovitine的核中的嘧啶环被本发明化合物中的吡啶环(pydirine cycle)代替。
这个差异是本发明化合物的关键特征，赋予本发明化合物以独特的性质：与现有技术的嘌呤型化合物相比，它们更少与吡哆醛激酶相互作用，如图1中所示。
实际上，本发明化合物与吡哆醛激酶的相互作用已经通过以下方法来测定：(银染色试验)
将补充有100μM的Roscovitine、或100μM的式Id的化合物、或100μM的式Ie的化合物的1000μg的猪脑溶胞产物(100μl的溶胞产物，10μg/μl)加载在琼脂糖小珠上并用小珠缓冲液(50mM TrispH 7.4、5mM NaF、250mM NaCl、5mM EDTA、5mM EGTA、0.1％NP-40、10μg/ml亮肽素、抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM苄脒)洗涤。
这些试验的结果示出在图1中。
从图1可见，本发明的化合物表现出CDK5的竞争试剂作用，这证明它们实际上与酶有相互作用。
Roscovitine表现出对于次要靶Erk2和PDXK的竞争试剂作用。相比之下，本发明的化合物表现出没有或很少的对于吡哆醛激酶和Erk2的竞争试剂作用，这证明这些蛋白质不是本发明化合物的靶或是非常弱的靶。
除非另有说明，与Roscovitine相比，本发明的化合物表现出增加的CDK特异性。
另外，与嘌呤衍生物相比，指出的是，它们对CDK9表现出较少的抑制作用，所述CDK9是由于其在转录中的关键作用而不应被抑制的激酶。
此外，本发明人发现，在式I中的B-R2不是NH2或者具有较短的链长度并且优选包含至少一个芳基基团时，式I化合物对细胞存活率的影响得到增强，尽管它们对CDK的作用略有不同。此外，在它们的选择性方面的细微差异(对CDK9的影响减小)提示，与它们的嘌呤对应物相比，可以预期这些分子具有较少的非特异性作用。
因此，本发明的化合物是三取代的或四取代的咪唑并[4，5-b]吡啶，即，1-脱氮杂嘌呤。
已经与Roscovitine相比较，对本发明的化合物试验了它们对不同CDK和细胞系的作用。
这些试验和它们的结果在以下标题为“结果”的部分中。
此外，对于其中A为N的那些本发明化合物，本发明人发现了对它们特别适合的生产方法。
所述方法基于使用以下式II的中间化合物：
式II
其中：
B为O或S或NH
R1为：
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基基团，或
-任选地被一个或多个羟基基团取代的C3-C6环烷基基团，或
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-C1-C5烷基芳基基团，所述芳基基团任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，
R2为：
-芳基基团，其任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基或3-噻吩基基团，或
-甲基联芳基基团，其中每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，或
-甲基芳基基团，所述芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团取代，和/或任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团、
-联芳基基团、每个芳基环任选地包含一个或多个杂原子，从而形成2-吡啶基基团、或3-吡啶基基团、或4-吡啶基基团、或2-噻吩基基团或3-噻吩基基团，或者每个芳基环任选地被一个或多个卤素原子、和/或羟基基团、和/或C1-C3烷基氧基基团、和/或CF3基团、和/或羧酸基团、和/或羧酸酯基团、和/或胺基团取代，
或者B和R2合起来形成非芳香族环，
R5为：
-卤素原子，或
-氢原子，或
-任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代的C1-C5烷基基团，或
-(C1-C4)烷基(C3-C6)环烷基基团，其中所述环烷基基团任选地被一个或多个羟基基团和/或胺基团和/或卤素原子和/或羧酸基团取代，
X为Cl或Br或I或NH2。
这些中间化合物也在本发明范围内。
在以下反应路线1中描绘得到这些式II的化合物的方法。
反应路线1
使用三个途径来制备式II的前体：
路线a＝使如G.Cristalli等人，“Nucleosides andnucleotides”，1985，4，625-639中所述得到的5，7-二氯咪唑并吡啶1与R1X(X＝Br或I)在碱性条件下反应，得到2，使其进一步在丁醇中与R2BH在90-100℃反应，使用三烷基胺(例如NEt3或NBu3)作为碱，得到IIa(X＝Cl)。
路线b＝将根据已知方法在与用于1的相似的条件中制备的3烷基化，得到4，使其与四丁铵硝酸盐反应，得到二硝基化合物5。使5与R2BH在热的丁醇中或在DMF中在20-30℃反应，得到6，使用Fe、HCl将其还原为IIb(X＝NH2)；Iib X＝NH2。IIb可以转化为IIc(X＝Br)或转化为IId(X＝I)。在将IIb在CH2I2和有机亚硝酸酯(例如亚硝酸叔丁基酯或亚硝酸异戊基酯)中加热时实现IIb到IId的转化。
路线c＝第三个路线与第二个路线密切相关。较早进行用于引入基团R1的烷基化步骤。
式I的化合物的生产方法使用了式II的化合物。
在第一实施方案中，所述方法使用其中X为Cl、Br或I(优选为I)的式II的化合物。
这个方法涉及使式II的化合物与以下式III的亲核试剂偶联以得到式I的化合物的步骤：
所述偶联方法在碱性条件下使用金属催化剂诸如Pd(OAc)2、Pd2dba3或CuI。
所述碱可以是碳酸盐(诸如，Cs2CO3)、金属醇盐(诸如，叔丁醇钾或叔丁醇钠)。
所述金属催化剂在大多数情况中与所添加的配体一起使用，所述配体诸如，(+)Binap、Xantphos、或乙二醇或二酮。二酮配体的实例由Shafir等人描述在J.Amer.Chem.Soc.2006，126，8742-8743中和由Shafir描述在J.Amer.Chem.Soc 2007，129，3490-3491中。
但是在第二实施方案中，本发明的方法使用其中X为NH2的式I。
在这个第二实施方案中，要进行一个或两个偶联步骤，这取决于期望的取代基R3和R4的性质。
因此，使其中X为NH2的式II的亲核试剂化合物与以下式IV的亲电子试剂偶联：
Y-R6
式IV
其中Y为I、Br或Cl，R6为R3或R4，得到以下式V的化合物：
式V
最优选地，Y为I。
然后，在R3和R4不是H时，使式V的化合物与以下式VI的化合物偶联：
Y-R7
式VI
其中Y为Br或Cl或I，最优选为I，且如果式V中的R6为R4，则R7为R3，或者，如果在式V中的R6为R3，则R7为R4。
这些偶联步骤在碱性条件下进行，如对于本发明方法的第一实施方案中所述的。
更优选地，在每种情况中，X和Y为I或Br，且最优选为I。
下面借助于优选实施方案描述本发明。
实施例1：perharidine B(式Ib的化合物)的制备。
5，7-二氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶2。
将搅拌的5，7-二氯咪唑并[4，5-b]吡啶(5g，26.5mmol.)的DMSO(50mL)溶液在冰浴中冷却，并用K2CO3(14.6g，106.2mmol.)和2-溴丙烷(12.47mL，132.8mmol)处理。将混合物温热到18℃并搅拌过夜。真空除去DMSO。将残余物和水的混合物(100mL)用AcOEt提取(3x300mL)。将提取物合并，用盐水(300mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将残余物在硅胶上色谱纯化，使用甲苯-AcOEt-CH2Cl2 3∶1∶1，得到5，7-二氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶。(收率：57％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.67(d，6H)；5.01(m，1H，)；7.95(s，1H)；8.39(s，1H)
7-苄基氨基-5-氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶IIa。
在N2气氛下将2(1.87g，8.1mmol.)，苄基胺(1.4mL，13mmol.)和1.5mL的Et3N在10mL DMF中的混合物室温搅拌过夜。真空除去DMF。添加水(150mL)并用CH2Cl2提取(3x100mL)。将有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。将残余物在硅胶上色谱纯化，使用甲苯-AcOEt-3∶2，得到3(82％)。还可以通过将2、苄胺和三乙胺在正丁醇中的混合物在90℃加热1小时来制备3a。在真空浓缩之后，通过柱色谱法以75％收率分离3a。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.5(d，6H)；4.49(d，2H，)；4.88(m，1H)；5.75(t，1H)；6.31(s，1H)；7.3-7.25(m，5H)；7.7(s，1H)。
perharidine B：(S)-7-苄基氨基-5-[(2-丁基-1-醇)氨基]-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶Ib。
在乙酸钯(4mol％)的存在下向3a(540mg，1.8mmol)(7-苄基氨基-5-氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶)在甲苯(20mL)中的悬浮液添加(S)-(+)-2-氨基-1-丁醇，以及在回流甲苯(20mL)中的BINAP(4mol％)，使用叔丁醇钾(282mg，2.5mmol)。将反应混合物在N2下加热5小时。在冷却后，添加水(10mL)并用CH2Cl2提取(3x10mL)。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。将残余物在硅胶上色谱纯化，使用AcOEt-1％MeOH，得到Ib(42％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.95(t，3H)；1.49(m，8H)；3.55(m，1H)；3.77(m，2H)；4.48(d，2H)；4.62(hept，1H)；4.85(brt，1H)；5.35(s，1H)；6.10(brs，1H)；7.30(m，5H)；7.65(s，1H)。
实施例2：perharidine A(式Ia的化合物)的制备。
通过本发明方法的第一实施方案，从3a开始如对于perharidineB所述合成perharidine A，不同之处在于在最后一个步骤中使用(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇。收率：38％。
实施例3：perharidine D(式Id的化合物)的制备。
采用与实施例1中详述的相同的方法。
如对于3a所述制备这个产物，将4-(2-吡啶基)-苄基铵三氟乙酸盐(0.15mol)、三乙胺5mL和5，7-二氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶2(0.1mol)的混合物在50ml正丁醇中加热。
5-氯-3-异丙基-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶IIb。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.52(d，6H，2CH3)；4.56(d，2H，CH2)；4.94(hept，1H，CH，iPr)；5.89(t，1H，NH)；6.35(s，1H，6-H)；7.35m，1H，吡啶基)；7.45(d，2H，苯基)；7.75(m，2H，吡啶基)；7.83(s，1H，H-2)；7.95(d，2H，苯基)；8.70(d，1H，吡啶基)。
perharidine D：(S)-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-5-[(2-丁基-1-醇)氨基]-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶Id。收率：35％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.03(t，3H，CH3)；1.50(d，6H，2CH3)；3.51(m，1H，CH-OH)；3.75(m，2H，CH-OH+CH-NH)；4.20(brs，1H，OH)；4.50(d，2H，CH2-Ar)；5.44(s，1H，H-6)5.85(t，1H，NH)；7；25(m，1H，吡啶基)；7.45(d，2H，苯基)；7.65(s，1H，H-2)；7.75(m，2H，吡啶基)；7.98(d，2H，苯基)；8.70，(d，1H，吡啶基)。
实施例4：perharidine C(式Ic的化合物)的制备。
如对于perharidine D所述合成perharidine C，不同之处在于在最后一个步骤中使用(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇。收率：47％。
实施例5：从7-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶制备perharidines。
3-异丙基-7-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶4。
在与用于合成2相同的条件下进行7-硝基-咪唑并[4，5-b]吡啶3的烷基化。收率：76％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.61(d，6H，2CH3)；4.99(hept，1H，CH，iPr)；7.90(d，1H，H-6)；8.36(s，1H，H-2)；8.52(d，1H，H-5)。
3-异丙基-5，7-二硝基-咪唑并[4，5-b]吡啶5。
在0℃向22.63g四丁基铵硝酸盐在100mL CH2Cl2中的溶液中添加10.33mL的三氟乙酸酐。在0℃搅拌20分钟后，将这个溶液添加到被保持在0℃的3-异丙基-7-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶3(10.21，0.049mol)在130mL CH2Cl2中的溶液中，在0℃搅拌2小时之后，将溶液倾倒在冷的(5℃)NaHCO3饱和溶液中。将有机层用H2O洗涤一次，干燥并真空浓缩。收率97％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.76(d，6H，2CH3)；5.10(hept，1H，CH，iPr)；8.63(s，1H，H-2)；8.96(s，1H，H-6)。
7-苄基氨基-3-异丙基-5-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶6a
向5，7-二硝基-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶、5在DMF中的溶液添加NEt3和苄基胺。在20℃搅拌6小时之后，添加15mL的Et2O并将沉淀的固体过滤，并用Et2O洗涤。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.65(d，6H，2CH3)；4.65(d，2H，CH2)；4.92(hept，1H，CH，iPr)；6.95(t，1H，NH)；7.24(s，1H，H-6)；7.42(m，5H，苯基)；7.98(s，1H，H-2)。
通过相同的方法制备联芳基衍生物。
3-异丙基-5-硝基-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶6b
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.55(d，6H，2CH3)；4.63(d，2H，CH2)；5.01(hept，1H，CH，iPr)；6.88(br s，1H，NH)；7.22(m，1H，吡啶基)；7.49(d，2H，苯基)；7.68(dd，1H，吡啶基)；8.01(d，2H，苯基)；8.04(s，1H，H-2)；8.66(d，1H，吡啶基)。
5-氨基-3-异丙基-7-苄基氨基-咪唑并[4，5-b]吡啶IIb
向5.5g的Fe在30mL EtOH中的悬浮液缓慢添加2mL的12N HCl。将混合物在75℃搅拌1小时。在65℃冷却后，添加12mL的25％NH4Cl溶液。将混合物搅拌5分钟并添加6a(0.02mol，在5mL EtOH中)。将混合物在75℃加热2小时。在冷却到室温之后，添加5g硅藻土。将混合物在硅藻土上过滤并将剩余的固体用乙醇洗涤几次。将合并的过滤液浓缩并用CH2Cl2和10％Na2CO3提取。浓缩有机层使胺IIb的结晶。收率：98％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.45(d，6H，2CH3)；4.12(br s，2H，NH2)；4.68(hept，1H，CH，iPr)；5.48(s，1H，H-6)；5.53(t，1H，H-2)；7.15-7.35(m，5H，苯基)；7.55(s，1H，H-6)。
通过相同的方法制备联芳基衍生物IIc。
5-氨基-3-异丙基-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶IIc
收率：95％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.55(d，6H，2CH3)；4.55(d，2H，CH2)；4.92(hept，1H，CH，iPr)；5.80(t，1H，NH)；6.74(s，1H，H-6)；7.22(m，1H，吡啶基)；7.47(d，2H，苯基)；7.62(m，2H，吡啶基)；7.98(d，2H，苯基)；8.70(m，1H，吡啶基)。
5-苄基氨基-3-异丙基-7-碘-咪唑并[4，5-b]吡啶IId
通过以下反应路线中所述的方法制备化合物IId。
在第一步骤中，如化合物2的合成中所述将7-氯咪唑并[4，5-b]吡啶烷基化得到7-氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶7。然后如5的合成中所述用四丁基铵硝酸盐和三氟乙酸酐的混合物进行硝化，得到7-氯-3-异丙基-5-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶8。根据用于合成IIb时所使用的方法将硝基基团还原，得到5-氨基-7-氯-3-异丙基-咪唑并[4，5-b]吡啶9。在随后的步骤中，然后使用CH2I2和烷基亚硝酸酯(亚硝酸叔丁基酯或异戊基亚硝酸酯)将胺9转化为7-氯-5-碘-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶10。最后，如用于制备IIa所述从10得到衍生物IId。
可以通过相同的方法制备前述定义的只在R1上不同的通式V的化合物。
化合物V
7-氯-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶7。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.65(d，6H，2CH3)；4.98(hept，1H，CH(CH3)2)；7.28(d，1H，H-5)；8.18(s，1H，H-2)；8.3(d，1H，H-6)；
7-氯-3-异丙基-5-硝基咪唑并[4，5-b]吡啶8
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.75(d，6H，2CH3)；5.12(hept，1H，CH(CH3)2)；8.35(s，1H)；8.45(s，1H)。
5-氨基-7-氯-3-异丙基-咪唑并[4，5-b]吡啶9。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.60(d，6H，2CH3)；4.50(bs，2H，NH2)；4.80(hept，1H，CH(CH3)2)；6.53(s，1H，H-8)；7.84(s，1H，H-2)。
7-氯-5-碘-3-异丙基咪唑并[4，5-b]吡啶10
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.65(d，6H，2CH3)；4.95(hept，1H，CH(CH3)2)；7.68(s，1H，)；8.07(s，IH)。
IId的制备
在60℃向搅拌的0.1mol的5-氨基-3-异丙基-7-苄基氨基-咪唑并[4，5-b]吡啶IIb在100mL CH2I2中的悬浮液缓慢添加0.2摩尔亚硝酸异戊基酯。在60℃搅拌1小时之后，将二碘甲烷真空蒸馏掉(0.1mm)。将残余物聚集在CH2Cl2和饱和NaHCO3的混合物中。分离有机层并用H2O洗涤，干燥并浓缩，得到IId。
收率：95％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.51(d，6H，2CH3)；4.40(d，2H，CH2)；4.82(hept，1H，CH，iPr)；5.56(t，1H，NH)；6.64(s，1H，H-6)；7.28(m，5H，苯基)；7.75(s，1H，H-2)。
通过相同的方法制备联芳基衍生物IIe。
3-异丙基-7-碘-5-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶IIe
收率：95％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.55(d，6H，2CH3)；4.55(d，2H，CH2)；4.92(hept，1H，CH，iPr)；5.80(t，1H，NH)；6.74(s，1H，H-6)；7.22(m，1H，吡啶基)；7.47(d，2H，苯基)；7.62(m，2H，吡啶基)；7.98(d，2H，苯基)；8.70(m，1H，吡啶基)。
3-异丙基-5-(4-N-乙酰基环己基氨基)-7-(苄基氨基)-咪唑并[4，5-b]吡啶Ih
向K3PO4(900mg，0.022mol)、CuI(50mg，0.25mmol)的混合物添加4mL 1-丁醇、0.5mL乙二醇(0.010mol)、5-苄基氨基-3-异丙基-7-碘-咪唑并[4，5-b]吡啶IId和反式-4-N-乙酰基氨基环己基胺(0.010mol)。将烧瓶用氮气吹扫，封闭并在90℃加热18小时。在冷却到室温之后，将残余物聚集在CH2Cl2和H2O的混合物中。将有机层干燥并浓缩。柱色谱纯化，得到3-异丙基-5-N-乙酰基环己基氨基-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶。
收率94％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.35(m，4H，环己基)；1.56(d，6H，2CH3)；1.98(s，3H，CH3CO)；2.20(m，4H，环己基)；3.45(m，1H，环己基)；3.75(m，1H，环己基)；4.5(d，2H，CH2)；4.69(hept，1H，iPr)；5.32(d，1H，NH)；5.35(s，1H，H-6)；5.65(br s，NH)；7.35(m，5H，苯基)；7.58(s，1H，H-2)。
类似地以79-95％收率从碘衍生物IId或IIe得到perharidines A、B、C和D。
实施例6：3-异丙基-5-(1，3-二羟基丙基氨基)-7-[4-(2-吡啶基)-苄基氨基]-咪唑并[4，5-b]吡啶，Ii，perharidine E。
化合物Ii，perharidine E
1H-NMR：1.45(d，6H)；3.55-3，80(m，5H)；4.38(d，2H)；4.55(hept，1H)；4.90(bs，1H)；5.35(s，1H)；5.75(t，1H)；7.15(m，1H)；7.30(d，1H)7.5(s，1H)；7.65(m，2H)；7.85(d，2H)；8.6(d，1H)。
已经对在实施例1-6中得到的化合物进行了试验，以测定它们对不同的激酶和细胞系的作用。
使用了以下材料和方法。
缓冲液
缓冲液A：10mM MgCl2、1mM EGTA、1mM DTT、25mM Tris-HClpH 7.5、50μg肝素/ml。
缓冲液C：60mM β-甘油磷酸酯、15mM对硝基苯基磷酸酯、25mM MOPS(pH 7.2)、5mM EGTA、15mM MgCl2、1mM DTT、1mM钒酸钠、1mM苯基磷酸酯。
激酶制备和试验
在30℃以15μM的最终ATP浓度在缓冲液A或C中试验激酶活性。减去空白试验值并将活性表示为最大活性(即，在没有抑制的情况下的活性)的百分率。使用二甲基亚砜的适当稀释物作为对照。
如以前所述(Leclerc S.等人，J Biol Chem 2001；276：251-60)制备CDK1/细胞周期蛋白B(M期海星卵母细胞，未加修饰)和CDK5/p25(人，重组的)。在15μM[γ-33P]ATP(3,000Ci/mmol；10mCi/ml)的存在下在30μl的最终容积中在含1mg组蛋白H1/ml的缓冲液C中试验激酶活性。在30℃保温30分钟之后，将上层清液的25μl等分样品点到2.5x3cm大小的Whatman P81磷酸纤维素纸上，并在20秒之后将过滤器在10ml磷酸/升水的溶液中洗涤五次(每次至少5分钟)。在1ml ACS(Amersham)闪烁流体的存在下对湿的过滤器进行计数。
如对于CDK1/细胞周期蛋白B所述对CDK2/细胞周期蛋白A(人，重组的，在昆虫细胞中表达的)进行试验。
如对于CDK1/细胞周期蛋白B所述对CDK9/细胞周期蛋白T(人，重组的，在昆虫细胞中表达的)进行试验，但是使用pRB片段(氨基酸.773-928)(3.5μg/试验)作为底物。
如对于CDK1所述对GSK-3α/β(猪脑，未加修饰，经过亲合纯化)进行试验，但是在缓冲液A中并使用GSK-3特异性底物(GS-1：YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE)(Sp表示磷酸化的丝氨酸)(Bach S.等人，J Biol Chem 2005；280：31208-19)。
如对于CDK1所述对CK1 δ/ε(猪脑，未加修饰，经过亲合纯化)进行试验，但是使用CK1-特异性肽底物RRKHAAIGSpAYSITA(ReinhardtJ.等人，Protein Expr & Purif 2007；54：101-9)。
细胞生物学
抗体&化学品
AcDEVDafc和Q-VD-OPh购自MPbiomedicals(Vannes，France)。包含MTS试剂的Cell Titer和CytoTox试剂盒购自Promega(Madison，WI，USA)。蛋白酶抑制剂混合物得自Roche(Penzberg，Germany)。除非另有说明，未列举的试剂得自Sigma。
肌动蛋白的单克隆抗体得自Calbiochem(Madison，WI，USA)。成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)的单克隆抗体购自BD Biosciences(SanDiego，CA，USA)。磷酸-Ser249/Thr252-Rb的多克隆抗体由Biosource(Camarillo，CA，USA)提供。磷酸-Thr320-蛋白质磷酸酶1α(PP1α)的多克隆抗体和半胱天冬酶-9的单克隆抗体得自CellSignalling(Danvers，MA，USA)。RNA聚合酶II和磷酸-Ser2-RNA聚合酶II的多克隆抗体由Covance Research Products(Berkeley，CA，USA)提供。Mcl-1的多克隆抗体得自Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz，CA，USA)。
细胞系和培养条件
使SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞在DMEM培养基(Invitrogen，Cergy Pontoise，France)生长。使HEK 293人胚肾细胞系在得自Invitrogen的MEM培养基中生长。使人包皮(foreskin)初级成纤维细胞(由Dr.Gilles Ponzio友情提供)在补充有2mM L-谷氨酰胺和20mM HEPES的DMEM中生长。所有的培养基都补充以得自Lonza的抗生素(青霉素-链霉素)和得自Invitrogen的10％体积的FCS。将细胞在5％CO2下在37℃培养。药物处理以所示时间和浓度针对指数生长的培养物进行。使用适当的DMSO稀释物进行对照实验。使用MDCK细胞系试验化合物PKD。
细胞死亡和细胞存活力评价
通过测量3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)的减少测定细胞存活力。通过测量在细胞溶解时释放的乳酸脱氢酶活性(LDH)的水平来测定细胞死亡。所述两个方法都在以前有详细描述(Ribas J.等人，Oncogene 2006；25：6304-18)。
半胱天冬酶(caspase)试验
通过在将AcDEVDafc合成底物直接添加到培养基中、洗涤剂分解并在37℃保温之后测定从AcDEVDafc合成底物释放的荧光来测量半胱天冬酶活性。这个方法为96多孔板格式而设计。其允许同时进行半胱天冬酶活化的动力学测定和多药物表征(Ribas J.等人，Oncogene2006，25：6304-18)。
电泳和蛋白质印迹法
将细胞再悬浮并在4℃在Homogenization Buffer[60mM β-甘油磷酸酯，15mM对硝基苯基磷酸酯，25mM MOPS(pH 7.2)，15mM EGTA，15mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，1mM钒酸钠，1mM NaF，1mM苯基磷酸酯，0.1％Nonidet P-40和蛋白酶抑制剂混合物]中裂解30分钟，并进行声处理。在离心之后(14000rpm，15分钟，4℃)，通过Bradford蛋白质试验(Bio-Rad)测定上层清液中的蛋白质浓度。
在包含100mM Tris/HCl(pH 6.8)、1mM EDTA、2％SDS和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中制备全细胞提取物。在热变性5分钟之后，在含MOPS SDS(除了细胞色素C、RNA聚合酶II和磷酸-Ser2-RNA聚合酶II蛋白质印迹外全部适用)、MES SDS(细胞色素C)、或Tris-乙酸盐SDS(RNA聚合酶II和磷酸-Ser2-RNA聚合酶II)的10％或7％NuPAGE pre-cast Bis-Tris或Tris-乙酸盐聚丙烯酰胺缩型凝胶(Invitrogen)上分离蛋白质，运行缓冲液取决于蛋白质大小。将蛋白质转移到0.45μm硝基纤维素过滤器(Schleicher和Schuell)。将这些用含5％低脂奶的Tris-缓冲的盐水-Tween-20阻断，与抗体(抗-肌动蛋白：1∶2000)保温1小时或在4℃过夜(细胞色素C：1∶500)、Rb(1∶500)、磷酸-Rb(1∶500)、磷酸-Thr320-PP1α(1∶1000)、RNA聚合酶II(1∶500)、磷酸-Ser2-RNA聚合酶II(1∶500)、Mcl-1(1∶500)、半胱天冬酶-9(1∶1000)，并通过Enhanced Chemiluminescence(ECL，Amersham)分析。
生物试验的结果。
本发明化合物的作用
对纯化的激酶的作用
在不同的分离的纯化的疾病相关蛋白质激酶上试验PerharidineA和B(S和R异构体)和它们的前体。平行地试验了(R)-Roscovitine并用作参考化合物。结果作为以μM为单位的IC50值提供在以下表4和5中。
表4.perharidine及其前体在两个细胞系中对激酶和细胞存活率的影响。
表4中提供的结果显示了用于合成perharidine所合成的不同中间体。实施例Ib为与Roscovitine最接近的相似物，比较了它们的生物学作用。可以看出，化合物Ib表现出与Roscovitine非常相似的对于所分离激酶的作用，但是具有改善的对细胞增殖的效力。
对于perharidine E、化合物Ii，提供了0.34μM的对CDK5的IC50和0.28μM的对CK1的IC50。
如方法部分中所述，在激酶试验中在不同浓度试验化合物。从所示剂量反应曲线计算IC50值，并以μM为单位报告在表5中。
表5.Roscovitine及其perharidine类似物对10种蛋白质激酶靶的活性的影响。
激酶 (R)-Roscovitine (R)-Perharidine A (化合物Ia) (S)-Perharidine B (化合物Ib)(R)-Perharidine C (化合物Ic) (S)-Perharidine D (化合物Id) CDK1/细胞周期蛋白B 0.33 0.43 0.73 0.46 0.27 CDK2/细胞周期蛋白A 0.21 0.30 0.42 0.36 0.15 CDK2/细胞周期蛋白E 0.17 0.18 0.31 0.25 0.10 CDK5/p25 0.28 0.40 0.50 0.60 0.20 CDK7/细胞周期蛋白H 0.80 0.90 - - - CDK9/细胞周期蛋白T 0.23 0.48 1.30 0.53 0.12 CK1 4.00 11.0 4.80 1.10 1.90 DYRK1A 3.00 2.80 22.00 11.00 2.80 Erk2 11.00 7.00 9.00 22.00 9.00 GSK-3α/β 60.00 ＞100.00 ＞30.00 11.00 24.5
表5表明，与(R)-perharidine(式Ia的化合物)一样，其(S)-异构体(式Ib的化合物)、以及式Ic和Id的化合物表现出与(R)-Roscovitine相似的对CDK的效力。然而，与对(R)-Roscovitine的敏感性相比，CDK9和DYRK1A似乎是对这些脱氮杂嘌呤类敏感性略低。
perharidines对细胞存活率的影响
在不同的细胞系上试验perharidine A和B(R和S异构体)和它们的前体、以及式Ic和Id的化合物(通过MTS试验测定存活率水平)。平行地试验了(R)-Roscovitine并用作参考化合物。结果作为以μM为单位的IC50值提供在图3和5中以及表4和以下表6中：
表6.Roscovitine和perharidine在5个细胞系中对细胞存活率的影响。
细胞 (R)-Roscovitine (R)-Perharidine A (S)-Perharidine B 式Ic的化合物 式Id的化合物 SH-SY5Y 17.0 14.3 28.0 1.46 0.66 HEK293 21.0 27.4 45.0 - - LS 174T 26.0 21.5 37.5 - - LS 174T (Oncodesign) 9.25 - - 0.29 0.099 HCT116 20.8 - - - - HCT116 (Oncodesign) 6.97 - - 0.60 0.30 HCT116 (Spheroids) 7+4 10+1.5 - 0.35+0.05 慢性淋巴 细胞性白血病 8.96 7.05 15.27 0.31 0.13
还对这些化合物在如下方面的作用进行评价：
-细胞存活率。结果示出在图3和5中。
-半胱天冬酶活化。结果示出在图4和6中。
-在CDK2/CDK4位置上的成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化。结果示出在图6和7中。
从图6可以推断，化合物Ic以与(R)-Roscovitine相比更低的浓度抑制细胞中的CDK2/4，而式Ia的化合物和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的作用，并且从图8可以推断，使用(R)-Roscovitine和式Ia、Ib和Ic的化合物，总的Rb基本上是恒定的。
-RNA聚合酶II Ser2磷酸化)，CDK9/细胞周期蛋白T磷酸化位置。
结果示出在图9和10中。
从图9可以推断，化合物Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度抑制细胞中的CDK9，而式Ia的化合物和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力，并且从图10可以推断，与式Ia、式Ib、和式Ic的化合物时的情况一样，使用(R)-Roscovitine时的总RNApol II保持基本恒定，
-对Thr320的蛋白质磷酸酶1-α磷酸化，CDK1/细胞周期蛋白磷酸化位置。
结果如图11中所示。
从图11可以推断，式Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度抑制细胞中的CDK1/细胞周期蛋白B，而式Ia和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力。
-存活因子Mcl-1的向下调节。结果如图12中所示。
从图12可以推断，式Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度向下调节细胞中的存活因子Mcl-1，而式Ia和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力。
-p53总蛋白表达。结果如图13中所示。
从图13可以推断，式Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度触发细胞中的p53总蛋白表达，而式Ia和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力。
-p27总蛋白向下调节。
结果如图14中所示。
从图14可以推断，式Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度向下调节细胞中的p27总蛋白，而式Ia和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力。
-PARP裂解。
结果如图15中所示。
从图15可以推断，式Ic的化合物以比(R)-Roscovitine更低的浓度触发细胞中的PARP裂解，而式Ia和式Ib的化合物具有与(R)-Roscovitine相似的效力。
-对于所有的化合物，将肌动蛋白总蛋白水平用作加载对照。结果如图16中所示，证明了在凝胶中的相等的加载。
概括地，这些结果表明：
[1]式Ia和式Ib的化合物表现出与(R)-Roscovitine相似的抗增殖活性。(S)异构体(式Ib的化合物)效力略低，如对于Roscovitine的(S)-异构体所报告的那样。
[2]相比之下，相当令人惊讶的是，式Ic和Id的化合物表现出与(R)-Roscovitine相比大大增强的抗增殖活性(20-100倍)，尽管它们具有相当相似的对激酶的作用。同样出乎意料的是，与(R)-Roscovitine相反，(S)异构体比(R)异构体活性更大(表6)。
[3]在分析在CDK抑制(CDK2/CDK4：成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化；CDK1：蛋白质磷酸酶1αThr 320磷酸化；CDK9：RNA聚合酶II Ser2磷酸化；p27向下调节))和凋亡性细胞死亡的标记物中所涉及的分子作用物时确认了这些作用和效力的顺序(P53表达，存活因子Mcl-1的向下调节，半胱天冬酶活性，PARP裂解)(图4-9)。
因此，在诱导细胞死亡和抑制细胞增殖的方面，这些化合物大大地优于Roscovitine，尽管对于它们的CDK靶具有显然相似的作用。这些结果似乎是和与次要靶诸如吡哆醛激酶的相互作用减少有关(图1)。
Roscovitine和类似物对B2-CLL淋巴细胞和对代表性CDK的激酶活性的影响。在从患者分离得到的B2-CLL淋巴细胞上对不同浓度的(R)-Roscovitine和一些perharidines进行试验。通过测量3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2/H-四唑鎓(MTS)的减少测定细胞存活力。通过测量在细胞溶解时释放的乳酸脱氢酶活性(LDH)的水平来测定细胞死亡。所述两个方法都在Ribas J.Boix J.中有详细描述。细胞分化、半胱天冬酶抑制和大分子合成阻断(但不包括BCL-2或BCL-XL蛋白质)保护SH-SY5Y细胞免于由两种CDK抑制性药物引起的凋亡。Exp.Cell Res.2004；295，9-24。
在LLC B细胞上试验相同的化合物。从所示剂量反应曲线计算的IC50值以μM为单位报告在表中。
化合物 细胞死亡诱导 Roscovitine 8.96 (R)-perharidine A 7.05 (S)-perharidine B 15.27 (R)-perharidine C 0.31/0.28 (S)-perharidine D 0.13
为了评价perharidines在PKD方面的重要性，还在MDCK细胞上对本发明化合物进行试验。发现perharidines D和E的有效性是Roscovitine的50-70倍。
另外，还试验了化合物Ii。它似乎是有效的激酶抑制剂，特别是对于CDK5和CK1的IC50为0.35和0.28μM。
因此，本发明的化合物或通过本发明方法得到的化合物，由于其在上述实施例中所示的独特的生物学特性，具有用于生产药物的高的价值。
实际上，它们不仅具有与Roscovitine至少相同甚至更优的生物学作用，而且具有更少的或者没有与吡哆醛激酶的相互作用。
除非另有说明，它们可在药物组合物中用作活性成分。它们的使用对于生产药物具有高的价值，所述药物用于治疗其中涉及(肿瘤性或非肿瘤性的)细胞异常增生的疾病。这种疾病尤其是肿瘤，或白血病或在各种肾脏疾病中观察到的非肿瘤性但是异常的增生。但是，由于它们对CDK5的作用和它们对分化的细胞(特别是神经元细胞)的抗凋亡性质，它们还可以用于治疗神经变性疾病(诸如，阿尔茨海默氏病或帕金森氏病)或用于治疗中风、缺血和疼痛。此外，由于它们对CDK2和CDK9的作用，它们还可以用于生产用于治疗病毒病的药物。
此外，由于它们对CDK5和凋亡的影响，它们用于生产药物和用在治疗肾疾病(特别是诸如，肾小球膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、坍塌性肾小球病、增生性狼疮肾炎、多囊肾病、糖尿病性肾病和急性肾脏损伤)、以及治疗炎症、胸膜炎、关节炎或青光眼的方法中。由于它们对CDK5的作用，以及由此具有的增加胰腺细胞的胰岛素分泌的能力，它们还可以用于治疗II型糖尿病。
本发明的化合物或通过本发明方法得到的化合物可单独地、或者作为两种或更多种本发明化合物的混合物、甚至与已知对待治疗的特定疾病具有作用的现有技术的其它化合物相结合而用于生产药物或用于治疗特定的疾病。
式Ia-Ii的化合物对于治疗上述疾病是特别适合的。