亲和性膜系统及其应用方法 发明背景
总的来说，本发明是关于为净化血液而设计的治疗方法，更具体地说，本发明是关于设计用于从血液中清除特殊溶解物的亲和性膜系统。
亲和性分离是依赖于溶液中的一种分子和一种固相化配体之间的高度特异性结合，而达到高度纯化的目的。按常规方法，分离是在以多孔小珠装填的亲和柱上进行，并在小珠上固相化有配体。这种配体深深地位于多孔小珠的微孔中。此亲和性分离过程是借助于泵送蛋白质溶液，使之通过含有多孔小珠的填充床来进行。
这些目前用于吸附性血浆处理的柱系统是基于在多数情况下适合于其它类型分离过程，如工业分离的装置吸附量。当然，促使工业分离方法发展的目的可能完全不同于那些与治疗过程有关的目的。这种差别可能导致所采用的技术虽然是有效的，但决不是最佳的。见Kessler，“吸附性血浆处理：体外装置和系统的最优化”Blood purification，Vol.11，pp.150-157(1993)(下面省略为Kessler，“吸附性血浆处理”)。
为了设计和最优化血浆处理地体外(extracorporeal)系统，已经提出了多种预定目标。基本目标之一是，尽量减少用于捕捉靶分子的昂贵配体，通常是抗体的用量。通过尽量减少配体的用量，每次处理的费用可以相应地降低。另一个目标是尽量减少系统的容积，从而使操作过程对病人的冲击变得最小。这样的容积最小化作用既能减少急性反应，又能减少慢性作用如蛋白质的损失。见Kessler，“吸附性血浆处理”P.150(1993)。从市场的观点出发，亲和性装置的另一些理想的特征是易于放大和制造，其操作仅需要少量的辅助设备。
如上面所显示，目前用于除去靶分子的治疗装置是由以多孔小珠装填的柱组成。这种装置存在许多缺点。例如，这种装置的捕捉效率受颗粒内缓慢的扩散作用所限制，特别是对于大分子靶溶解物，并且也受具有较高流速的高压降低(drop)的限制。见Suen & Etget，“对亲和性膜生物分离的数学分析”chemical Engineering Science，Vol.47，No.6，pp.1355-1364(1992)(下面省略为Suen & Etget“数学分析”)。这种扩散限制性吸附作用导致昂贵配体的低效率利用，因为相当大量的配体也许不能与靶溶解物接近。
除了与扩散限制性吸附作用有关的问题之外，还存在其它的缺点。为了限制分离装置的大小和价格，通常都采用二个柱，一个柱用于吸附，而靶溶解物从另一个柱上被洗脱。采用二个柱不但增加了方法的费用，而且也增加了实施分离和除去溶解物所需要的处理时间。并且，为了避免过度高压降低通过这种柱床而采用的缓慢流速，将导致增加装载次数。
更进一步的问题是，由于这种柱基质材料的生物不相容性，有必要先使血浆与血液的其它细胞成分分离开，然后将血浆导入填充床。通过被称为血浆除去法的处理，首先可将血液分离成细胞成分和血浆成分。可借助于过滤或离心来完成血浆除去法。膜血浆除去法是应用膜进行分离，这种膜具有比血浆蛋白质粒度大、但比血液细胞成分小的孔径，因此可分离出血浆。离心法对各成分的分离是基于密度不同，可分批或连续地进行处理。下一步是泵吸血浆，使之通过装填柱，以便除去靶溶解物如毒素。然后再将处理过的血浆与细胞成分合并，并输回给病人。这种多步骤的处理过程是很费时间的，并且需要利用大量的体外体积。该处理过程还需要许多设备，并需要对血液成分进行大量的处理，这些都将导致增加感染的可能性。
近年来，已有人提议将空心纤维膜用作亲和性基质，作为对多孔小珠令人注目的替代物。在纤维壁液流通路中存在的大量表面积，可消除由于与多孔小珠相关的吸附作用所造成的扩散性限制。改变靶溶解物和膜结合配体之间的吸附动力学速度限制性步骤，从而允许使用较高的流速，并且可能更有效地利用配体，因为所的有配体都可以用于结合靶溶解物。
已计划制作亲和型系统用于便利从血液中除去靶溶解物。例如，Shettigar er al的专利U.S.Patent No.5,211,850，是关于一种空心纤维(hollow fiber)系统，其中的吸着剂小珠是放置在一个特别设计的U-形装置之中。在此装置中，血浆溶解物被优先过滤通过多孔空心纤维膜而进入血浆室中，在此，不需要的成分将借助吸附结合技术被除去。然后，使血浆和未结合的溶解物再次进入空心纤维，并被输回给病人。
Parham er al的专利U.S.Patent No.5,258,149，是关于从全血中除去低密度脂蛋白胆固醇复合物。这个在Parham er al的专利中所述的系统致力于利用一种微孔的血浆除去膜，其中有固相化的亲和性试剂整合在此膜中。用一个血液泵将全血泵入这种亲和性膜中。然后用另一个泵，即血浆泵，吸引血浆通过微孔纤维的通路，并且使血浆与血液细胞成分分离。
发明概述
本发明提供了一种改进的亲和性膜装置，用于从血液中除去靶溶解物。本发明的发明者发现，为了使该装置能在体外装置的运行制约下充分地发挥功能，对用于亲和性膜装置的纤维必须进行特殊地设计。在设计这种亲和性膜装置时，必须考虑到纤维的各种相互制约特性，包括内径，长度，微孔的大小和壁的厚度。同样，为了防止病人体内血液容量过度改变或者血中细胞成分的过度损伤，在体外血流循环中必须细心控制血流速度和其流体切应变速率(shear rate)等操作条件。
本发明者认为，在本发明之前，还没有人对如何成功地制备适合于治疗运用的亲和性膜装置进行研究和确定。虽然空心纤维膜已被用于分离过程，并且平面(flat sheef)亲和性膜片也容易得到，但是，对空心纤维亲和性系统有严格控制要求的许多治疗运用在以前的工作中尚未着手进行。本发明提供了一种亲和性膜装置，它可用于治疗以血中具有过高浓度具体溶解物为特征的许多病症。
本发明的亲和性膜装置可用于选择性地除去包含在血浆或血液中的靶分子。本发明简便而有效的亲和性膜装置具有一个细长的外套腔(housing)，此腔备有供血液进出的入口和出口。此外，这种膜装置还包括有封装在外套腔内的空心纤维。这些空心纤维具有适当孔径的微孔，适合于把血液分离成血浆和其细胞成分。在微孔的内表面还具有固相化的配体，在一个实施方案中，该配体对被传输进入空心纤维微孔的血浆中存在的靶分子具有亲和性，并且能结合靶分子。在另一个实施方案中，配体可能是一个酶，它能修饰并释放靶分子。值得注意的是，血液的细胞成分并不进入空心纤维的微孔，而血浆是在不存在外部泵产生越过空心纤维的血浆流的情况下，借助于正向和反向过滤作用被传输进入微孔。
在实施方案中，微孔的孔径范围是从大约0.2到0.6微米。
在实施方案中，这种空心纤维具有的壁厚度，使之有足够的表面积用于附着配体，从而有可能充分地结合靶分子。为此，空心纤维壁厚度的优选范围是从大约300到3500微米。
在实施方案中，该空心纤维具有大约70至140微米的内径。
本发明还提供了一种用于选择性地除去存在于血液血浆中靶分子的方法。首先，此方法包括提供一套按照本发明制备的亲和性膜装置。其次是将血液泵入外套腔的入口。然后借助于正向和反向过滤作用，血液的血浆被传输进入空心纤维的微孔，而不允许细胞成分进入空心纤维壁。使血浆中的靶分子达到与配体紧密接近持续一段有临床意义的时间，以便有可能对靶分子发生结合或进行修饰。最后，在一个实施方案中，借助于正向和反向过滤作用，血浆中的非靶分子被传输通过空心纤维的微孔，而与血液的细胞成分重新结合(reunit)，并通过出口退出此装置。在另一个实施方案中，血浆中的非靶分子是借助于现存的压力梯度，经过一个血浆导管与细胞成分重新结合。
更进一步地，本发明提了一套具有特定尺寸和传输特性的空心纤维装置。此空心纤维装置包含有许多细长的空心纤维。每一根空心纤维都有环绕着一个腔隙的外周壁。外周壁上具有许多延伸贯通的微孔。这种微孔的数量和空间构型都便于有效地将血液分离成血浆和细胞成分。微孔的内表面结合有配体。外周壁具有的壁厚度(充分的微孔长度)使之可提供足够的表面积用于附着配体，以便确保配体能捕获足够量的靶分子。
本发明的一个优点是，可通过对空心纤维膜的精心设计，从而不需要特殊的血浆除去步骤。如前面所显示，以前的方案要求与血浆接触而不是与全血接触，因此需要使用分离膜同时进行血浆除去处理。
本发明的另一个优点是，这种膜装置的接触表面与本领域中以前使用的亲和性柱相比较，具有更高的生物相容性。改进的生物相容性在治疗过程中将导致较低的补体激活作用。
更进一步地，本发明的一个优点是，它应用化学固相化技术，使之能够借助于简易、连贯的过程附着广泛多种的配体。这种方法表现出优于以前制备亲和性膜尝试的重大改进。本发明的化学结合技术可容易地用于结合多种配体，与结合单一配体显然不同。
本发明的另一个优点是，当靶溶解物大于固相化的配体时，所采用的一种化学固相化技术，显示出比以前尝试制备更高的配体利用率。
更进一步地，本发明的优点是提供了比现有亲和性柱显著的费用降低。实现费用降低是由于容易制造，配体需要量减少，以及使用设备的简便。
本发明还有另一个优点是，与类似的亲和性柱相比较它非常容易使用。本发明需要较少的支持设备，并且医疗专业人员对其仅需较少的监察。
本发明的另一个优点是，它具有改进的容量传递特性，这样可以导致缩短处理时间，提高对昂贵配体的利用，或者二者兼而有之。
并且，本发明还有一个优点是，它提供了一套比本领域以前推荐的膜装置简便和更有效的膜装置。关于这点，本发明的膜装置独创地不需要使用外加的泵来产生跨越装置中空心纤维的血浆流。而且，按照本发明，细长的外套腔是用于封装空心纤维，并且在装置内促进正向和反向的过滤作用。不同于以前的系统，本发明的发明者发现，为了促进正向和反向过滤作用并不需要U-形的设计。
本发明的另一些特征和优点，将在目前优选实施方案以及附图的详述中被描述和显示。
附图简述
图1是本发明亲和性膜装置一个实施方案的平面图。
图2是本发明亲和性膜装置另一个实施方案的平面图。
图3是代表单根空心纤维的放大示意图，说明借助于在亲和性装置内腔中发生的正向和反向过滤作用而产生穿过纤维壁的血浆流。
图4是显示空心纤维单一纤维壁的放大示意图，显示穿过纤维壁内微孔的血浆流和靶分子结合在固相化的配体上。
图5简略地显示本发明的生物素-抗生物素蛋白固相化模式。
对目前优选实施方案的详述
本发明提供了一种设计用于清除血中特殊有害溶解物(靶溶解物)的亲和性膜装置。此亲和性膜装置被设计用于体外血液循环，并可与其它血液净化的治疗过程如血液透析同时使用。本发明的装置由如下部分组成：具有特殊尺寸和传输特性的空心纤维膜，固相化在膜微孔表面的配体，以及一个封装空心纤维并使血液和滤液能够适当地进入和排出的外套腔。在一个优选的实施方案中，配体是借助特定的化学固相化作用，以最佳功能状态结合在膜上。
工作时，固相化配体结合或修饰特定的靶溶解物，因而可以从流过空心纤维腔隙的血液中有效地除去这种溶解物。配体的定位配置，以及本发明所采用的独特的化学固相化技术，导致所构成的亲和性膜装置具有改进的配体活性存留，具有系统适应性和标准化的膜制造工艺，并具有全面提高效率的潜力。值得注意的是，本发明的亲和性膜装置可用于治疗以血中某一特殊溶解物过高含量为特征的许多病症。
图1显示本发明亲和性膜装置的一个实施方案。该亲和性膜装置可用于选择性地除去血中的多种靶溶解物。例如，此装置可用于除去低密度脂蛋白(“LDL”)，β2-微球蛋白，免疫球蛋白，自身抗体等等。
膜装置10具有一个界定内腔13的细长的外套腔12。入口14与入口导管18连接，使血液能进入此亲和性膜装置10。在亲和性膜装置10对血液发挥作用之后，经过处理的血液通过与出口导管20连接的出口16被排出该系统。
膜装置10还包括多个空心纤维膜22，实际上是一束构成空心纤维膜滤器的膜，它们被封装在由细长的外套腔12形成的内腔13中。如在下面将进一步详述，空心纤维膜22具有许多微孔，其孔径适合于把流过此膜22的血液分离成血浆和其细胞成分。如图所示，血浆从血液中与细胞成分分离，并通过空心纤维膜22纤维壁中的微孔流出。
由于在这种膜装置10内存在跨膜压力，血浆最后又通过空心纤维膜22纤维壁中的微孔流回，并且与血液中的细胞成分重新结合。关于这点，由于纤维内存在轴向压力下降，沿着装置10的长度方向，跨膜压力不同。靠近入口14跨膜压力是正向，导致血浆从纤维腔隙流向延伸外套腔12的套管(shell)空间。靠近出口16的跨膜压力是负向，因此导致血浆从套管空间又流回到腔隙中。
本发明的另一个实施方案显示在图2中，也是使血浆通过微孔进行有效地传输。图2显示出本发明利用血浆出口23的一个实施方案，其中与图1类似的装置用同样的数字标号。与在图1中描述的实施方案不同，在此装置中血浆是通过出口23排出。但是，与图1的实施方案相类似，由于亲和性膜装置内的轴向压力梯度将导致产生跨越空心纤维的滤液(血浆)流。由于此装置10的设计，整个装置内跨膜压力都是正向。出口23经过血浆导管25与出口导管20连接，从而允许借助于现存的压力梯度，使血浆中的非靶分子与血液的细胞成分重新结合。
图3和图4具体地显示在本发明中所应用的血浆除去和溶解物清除的原理。图3显示亲和性装置中的单独一根空心纤维24。它具体地显示在本发明的亲和性膜装置中，血浆与血液细胞成分的分离过程。
空心纤维24具有中央腔隙28，在此仅描画出了纤维束的一根纤维。从病人取出的全血从装置的入口进入通过此腔隙28，到达装置的出口。纤维24的壁上具有一连串开口或微孔，通过它们，尺寸比微孔30小的血浆，毒素，药物或其它溶解物可穿过微孔进入纤维24的壁内。其它细胞成分如红细胞，白细胞和血小板，具有不能穿过微孔30的尺寸，而遗留在纤维24的腔隙28中。
借助于正向和反向过滤作用，血浆成分可流入和流出空心纤维24。起初，当待处理的血液传输进入该膜装置时，空心纤维24内部的血液压力使血浆借助于对流作用从腔隙28流向内腔壁，或者换句话说，是流向细长外套腔套管空间。然后，在靠近装置的出口附近，空心纤维膜24内部的压力比纤维外部的血浆压力更低(在内腔壁的压力)。结果血浆再流回进入腔隙28。
穿过纤维24壁26流回的血浆已受到固相化在纤维24微孔30表面的配体处理或修饰。因此，经处理的血浆可在纤维腔隙内安全地与细胞成分重新结合，并通过出口排出。使病人的血液通过此装置反复循环，直到靶溶解物的浓度被充分降低为止。
结合在微孔30表面的配体将对血浆发挥作用，除去血浆中的靶溶解物，或者，在另一个实施方案中是对此靶溶解物进行修饰。将配体固相化于亲和膜微孔表面的方法，取决于配体的类型(例如抗体，抗原)以及所使用的膜材料。应该采用选择性固相化方案，这样才能通过膜以最少量配体捕获到最大量靶溶解物。本领域的专业人员都能意识到，应该予以考虑的某些普遍性问题是，采用温和的反应条件进行固相化，而对生理状态和洗脱条件的结合稳定性，以及为保持活性位点完整性的位点定向性化学方法。
按照本发明，可采用多种固相化技术将配体结合在空心纤维膜中微孔的表面。除了在本发明中所详述的经改进的固相化方法之外，用于活性膜的某些固相化方法也能经修改用于本发明的亲和性装置。例如，某些活性膜是作为商品买来直接用于固相化蛋白质配体。但是，值得注意的是，所有的这些膜都是以唯一的平面膜片的形式购得。例如包括：ImmobilonTM(从AV Millipore Corporation，Bedford，MA购得)，ImmunodyneTM(购自Pall Biosupport Corporation，Glen Cove，NY)，和Ultra BindTM(购自Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)。
如在下面将要更详细地叙述的，本发明提出了改进的固相化技术，它比以前的方法显示出明显的优越性。在一个优选的实施方案中，抗生物素蛋白/生物素复合物被用于将配体固相化在微孔表面。另一种方法是，聚乙烯醇固相化技术可单独采用，或者与抗生物素蛋白/生物素复合物配合使用。
与在血浆小室内使用吸着剂的其它系统不同，本发明独特地使用了直接固相化在微孔30表面的配体，用于除去来自血浆的靶溶解物。图3中圈出的部分，粗略地描绘了配体被固相化在微孔30的表面。这种方法不但排除了对位于外部血浆小室内吸着剂材料的需要，而且增加了溶解物清除过程的效率，并缩短了治疗的时间。由于配体存在于微孔表面，而血浆和血浆成分正是通过这些微孔被直接传输，因此，配体与靶溶解物相互作用的机率将会增加，从而导致对昂贵配体的更高效率地利用。
图4显示了本发明所应用的清除溶解物的原理。图4是空心纤维膜的纤维壁34中单个微孔32的放大示意图。当血浆通过纤维膜的纤维壁34时，特定的靶分子36能够与固相化在微孔32表面的配体38接触。配体38能如此有效地结合靶溶解物36，以致于可从血浆中除去靶溶解物36。使血浆通过纤维壁34持续具临床意义的一段时间，基本上可从血浆中除去全部靶溶解物36。
本发明的空心纤维膜是由无害的血液相容性材料制成，这样在治疗过程中仅产生较低的补体激活作用。适合的纤维材料有三醋酸纤维素，聚砜，聚丙烯腈，乙烯/乙烯醇共聚物，聚甲基丙烯酸甲酯，聚酰胺，聚丙烯，醋酸纤维素，再生纤维素，聚碳酸酯，聚乙烯，聚乙烯醇，聚氯乙烯等。空心纤维必须具有适当的孔径，以便允许血浆成分，包括靶溶解物通过空心纤维壁。同时，这种孔径还必须能够阻止血细胞和血小板进入纤维壁的微孔。空心纤维中适当的微孔孔径(其径)可以在大约0.2至0.6微米的范围内。
根据本发明，提供了一种亲和性膜装置，它包含有具有特定尺寸和传输特性的空心纤维膜。如上提及，在设计适合用于治疗应用的空心纤维装置时，必须考虑到多种因素。本发明的发明者已发现，对用于亲和性膜装置的纤维必须特别地设计，使该装置能在体外装置的操作限制之下充分地发挥功能。为了确定适当的空心纤维膜，对相互影响的纤维特征，包括内径，长度，微孔孔径和壁厚度，都必须进行测算。
本发明者在计算机模拟的基础上，确定了空心纤维膜装置的适当尺寸。已开发了一套描绘该亲和性膜装置运行特性的计算机模型。关于这点，计算机模型以有限差分形式，为空心纤维膜内血流的径向和纵向剖面，解开了某些守恒方程式。不象其它已有的系统，本发明者已确定，空心纤维的各种相互作用特征必须如何配合才能构成适合的空心纤维膜装置。
空心纤维亲和性膜装置的尺寸，在很大的程度上取决于必须从病人清除的靶溶解物的量。为了设计一个满足这些标准的装置首先必须构成一种膜，它具有特别适合于用亲和性膜装置治疗的各种尺寸(长度，内径，纤维壁厚度)。尽管用于亲的性治疗的膜也能有效地使血液的细胞成分与血浆除去，但是，它们的主要功能是通过提供在其表面能结合配体的最大表面积的基质来参与清除靶物质，此功能主要取决于这种膜的最佳尺寸，并且使其设计不同于完全为分离目的而设计的膜的尺寸。
一般的情况是，膜被用于根据分子大小从溶液中分离出靶物质。为了清除由膜所施加的对质量传递的抗性，这些膜通常被设计成尽可能地薄(对于透析膜薄至8微米，而超滤膜达到几百微米)。
相反，对于亲和性装置中的膜，较厚的膜壁是有利的，因为这种膜本身是提供用于附着配体的基质，此配体又将结合靶溶解物。因为，可用于附着配体的膜面积是纤维内径，厚度和长度的函数，所以，通过增加增加膜壁的厚度，来提供足够的用于在此装置中固相化配体的表面积，是有意义的。如此增加壁厚度将可以最大限度地结合或修饰靶溶解物，同时装置中血液分隔室的容积可减到最小。根据靶溶解物和配体之间的结合动力学，对于任何给定的滤液流速(图3中箭头所指示)，厚膜可提供靶溶解物在膜微孔或“多孔基质”中有最长的滞留时间。结果是，这将增加靶溶解物与固相化的配体接触并被捕获的可能性。
空心纤维亲和性膜装置的尺寸还取决于为实现使血浆浓度达到治疗改变所需的滤液流量。对于某一给定的治疗目的所需要的特殊滤液流量，取决于靶溶解物的分布容积和血浆浓度，以及进行该治疗的处理时间。以前对通过膜的溶解物流量的关系曲线已有描述，其中滤出液流量是受在膜表面红细胞的浓度极化作用所控制。见Zydney et al，“在微粒悬液的交叉流超滤过程中滤出液流量的浓度极化模型”，ChemicalEngineering Communication，Vol.47，pp.1-21(1986)(下面省略为Zydney et al，“浓度板化模型”)。这种流量依赖于血液通过装置的切应变速率，装置的长度和细胞的极化程度。
被设计用于为临床疗效提供充分的靶物质容量和足够的滤液流量的空心纤维亲和性膜装置，必须同时满足基于物理学原理的许多系统制约。
在空心纤维膜装置中，流动液体的切应变速率必须不是太大而足以损害流动液体中的成分，值得注意的是红细胞，它对切应变作用较敏感。因为空心纤维装置中的切应变速率是由血流速度，纤维的内径，以及纤维的数量所决定的，所以这些参数可以通过对系统切应变速率的制约来限定。
在空心纤维膜装置中，通过纤维腔隙的血流将经受沿着腔隙轴向的压力降低。实际上，这种轴向压力降的大小受材料和设备条件的限制。这种制约可能将纤维的内径，纤维长度和纤维的数量限制到可接受的尺寸。
在空心纤维膜装置内，通过膜纤维壁内微孔的滤液流将经受沿着微孔轴向的压力降低。实际上，这种跨膜压力降的大小也受材料和设备条件的限制，并且，这种制约可能将纤维壁的厚度限制到可接受的尺寸。
更进一步地，在空心纤维膜装置中，以对流占优势传输比以扩散占优势传输更优选。对流传输以一种便于最优化未被占据的结合位点与靶溶解物之间相互作用的方式，促进靶溶解物均匀地在整个膜多孔基质中传递。值得注意的是，由对流占优势传输的亲和性膜设计结构导致形成了更有效的装置(即治疗可以在尽可能最短的时间内进行)。对流和扩散作用的相对贡献可以通过系统的Peclet系数(number)来表示，其数值大于40表明传输是由对流占优势。见Suen & Etzel“数学分析”。
并且，在空心纤维亲和性膜装置中，制造条件可能限制该装置的物理尺寸，并随后可能对某些参数形成制约。例如，如下参数可能受到制约：纤维壁厚度，纤维内径，纤维长度和纤维数量。
对于用作体外治疗的空心纤维膜装置，为了病人的安全，将严格控制体外血液总容量。因此，纤维壁厚度，纤维内径，纤维长度和纤维数量可能受到这种约束的限制。
除了设计最佳的纤维膜之外，还必须仔细选择化学连接技术，并使之最优化(另有叙述)，以便得到尽可能最高的结合能力。这将导致对膜和配体的最有效地利用。
如果按图1构成本装置，必须有足够的纤维长度，这样除了为满足在前进方向(血浆从纤维腔隙流向套管侧)充分地捕获靶溶解物的需要之外，血浆还能返回纤维腔隙并排出本装置。必须增加的纤维长度取决于所采用的多聚体膜的渗透性和厚度。
对于给定的一系列治疗要求，以单通道模型(single pass mode)运行的单一装置设计参数，有可能不能满足受上述系统制约所支配的治疗要求。在这样一些情况下，通过在治疗过程中周期性地洗脱靶溶解物而使膜装置再生的方法，有可能使该装置能满足受系统制约的治疗要求。为了避免在再生过程中中断治疗，在治疗中可采用二台装置，这样可以一台用于结合或修饰溶解物，而另一台可同时进行再生处理。
本发明者用表示上述要求和制约的如下公式，计算了适合于各种靶溶解物的空心纤维尺寸，用以作为范例而不是限制。
适当尺寸的范例
待清除靶溶解物的量由治疗要求控制：
待清除量＝V(Co-Cf)
在此：V＝靶溶解物的分布容积
Co＝靶溶解物的起始浓度
Cf＝靶溶解物的最后浓度亲和性膜装置的总容量等于比容量(Cp)乘以膜容积
总容量＝[(r+d)2-r2]πLNCp
在此：r＝空心纤维半径
d＝空心纤维壁厚度
L＝空心纤维长度
N＝空心纤维数量对于亲和性膜装置尺寸的首位要求是，亲和性膜装置的总容量必须比待清除量大：
[(r+d)2-r2]πLNCp＞V(Co-Cf)(1)
为在某一治疗时间(t)内达到最后靶溶解物浓度所要求的容积流速(Qf)，可从对靶溶解物的质量平衡来计算。
假定在单通道设计中(即一种优选设计的膜)溶解物被完全吸附，这种要求可借助如下公式给出：Qf=-VClnCfCo----(2)]]>
假定通过膜的流速是浓度极化作用限制性的，理想的滤液流速可从如下关系式预测(见Zydney et al，“浓度极化作用模型”)：QfQb=1·HCwe[ln0.95He·B]----(3a)]]>
在此：B=2.0×10-5[Lr3]2/3----(3b)]]>
并且：Qb＝入口血流速度
H＝入口血液血细胞比容(B的单位与L和r一致，以cm表示)
通过适当地选择结合靶物质的配体，膜材料和将配体附着于膜所采用的化学方法，可以使对某一给定靶溶解物的比容量(Cp)达到最大值。
在公式(1)至(3)中出现的其余设计参数是装置的尺寸r，d和L，以及纤维的数量(N)。如前面已论述，这些设计参数将服从于许多制约因素。
对r的制约因素之一是可容许的最大壁切应变速率，由下式给出：
对r的另一个制约因素是可容许的最大轴向压力降：
在此 μb＝血液粘度L不仅受制于上述的压力降限度，而且受制于如下对装置整体物理尺寸的实际制约因素：
Nπ(r+d)2＜78.5cm2(6)
厚度(d)不仅受制于上述的制约因素，而且受制于Peclet系数制约因素和跨膜压力制约因素：vdD>40----(7)]]>
在此D是靶溶解物的扩散系数，而滤液速度V由下式给出：v=Qf2πrNL----(8)]]>
跨膜压力差可以借助用于填充床的Blade-Kozeny公式来确定(见Bird，Stewart，Lighfoot，“传输现象”(1960))。此公式是如下：ΔPtransmembrane=150vdμf(1-∈)2DP2∈2----(9)]]>
在此：μf＝滤液的粘度
Dp＝膜孔直径＝0.25微米
ε＝膜孔隙度＝0.7
将上述各公式用于设计要求和制约因素，本发明者已确定，亲和性膜装置的空心纤维应具有的壁厚度大约为300-3500微米，内径大约为70-140微米。
除了确定用于设计适当空心纤维膜的最佳设计程序外，本发明的发明者还确定了一种改进的方法，用于将配体结合在亲和性膜装置中微孔的表面。这种改进的方法导致增加了装置的效率，对配体更高的利用率，更高的膜标准化程度，更简便，并导致了对市场的适应性和系统的灵活性。膜标准化程度指的是，对可得到的多种配体采用的固相化方法，使之标准化的能力。
如前面已提及到，以前开发的溶解物清除装置，膜形式的或者是微珠柱形式的，都着眼于清除单一的靶溶解物。以这样一种目的，开发者通常是使他们的清除系统仅对感兴趣的专一配体-靶对最佳化，而忽略了对其它配体-靶对是否适用的问题。用于将配体偶联于支持基质的化学固相化技术也是非常专一，实际上不能转向用于其它配体。
根据本发明，在实施方案中，采用了包括抗生物素蛋白和生物素的固相化程序。使用特殊的化学固相化技术将抗生物素蛋白偶联在膜表面。这种方法可标准化地用于许多可得到的配体。在通过将生物素分子连接于配体的连接化学中保持了系统的灵活性。
本发明独特的抗生物素蛋白/生物素化学固相化技术按如下进行。使一个或多个生物素分子与配体共价连接。将抗生物素蛋白共价地连接于膜微孔的表面。抗生物素蛋白和生物素的这种各自相应的连接可用本领域中已知的技术来实现。然后，使生物素化的配体与包含固相化抗生物素蛋白的膜发生反应，从而导致将生物素化的配体固相化在膜上。
图5用图解法显示用抗生物素蛋白/生物素复合物固相化配体，以及捕捉靶溶解物。将生物素化的配体40被连接于固相化在膜微孔表面44的抗生物素蛋白。如图中所示，生物素化的配体40然后能够自由地从血浆液中捕捉靶分子46。
值得注意的是，形成的抗生物素蛋白-生物素复合物表现出相当大的稳定性。抗生物素蛋白和生物素之间的相互作用，是已知的蛋白质和配体之间最强的非共价生物学相互作用(Ka＝1015M-1)。而且，生物素和抗生物素蛋白之间的键形成非常快，并且，一旦形成就不受相差甚远极端pH的影响，也不易受到温度，有机溶剂和其它变性剂的影响。例如，生物素-抗生物素蛋白复合物可经受高达80℃的温度，以及2-13的pH范围。
关于生物素对配体的结合，许多可购得的生物素衍生物都能使生物素通过多种功能基团共价地与配体偶联。例如，生物素可被偶联至蛋白质配体中的特异性位点，包括含有末端氨基的(赖氨酸)，含有咪唑基的(组氨酸)，含有苯酚基的(酪氨酸)，或者含有巯基的(半胱氨酸)特异性氨基酸残基。此外，生物素衍生物还可用于偶联存在于糖或哺乳动物蛋白质中的糖基。这种化学技术，能够有效地将生物素偶联于例如免疫球蛋白G(IgG)不干扰抗原结合的位点。这种化学灵活性为将生物素结合于配体提供了许多可能的方法，并且对所研究的配体增加了得到适当方法的机会。
由于其分子结构，抗生物素蛋白对膜表面的结合可保证对配体的有效利用。抗生物素蛋白是一种四聚体蛋白质，并且每个分子能够以同等的亲和性结合最多可达四分子生物素。这种存在于每个抗生物素蛋白分子的多功能度，可保证被固相化的抗生物素蛋白仍然保留一些结合生物素的能力。蛋白质非特异性固相化到固体基质，通过或者是与蛋白质的活性位点反应，或者是活性位点与溶液中靶分子的空间屏蔽作用，通常导致在此表面的蛋白质的某些部分失活。如果抗生物素蛋白分子是对称的，对固体表面的固相化作用将使一个或几个可能的生物素结合位点失活；但是，这也能保证一个或几个结合位点将仍然有活性，并且能够自由地结合生物素或生物素化配体。
通向制备活性亲和性膜的最后步骤是形成抗生物素蛋白-生物素复合物。优选地，这种形成过程可通过使含有固相化抗生物素蛋白的膜与含有生物素化配体的溶液反应来进行。这种反应进行迅速，并且可在温和的条件下进行，例如在室温下在透析缓冲液中进行。特别是，因为此反应步骤既简单又直接，所以本发明者相信，可以想象，任何一个使用者都可能以所选择的生物素化配体来活化抗生物素蛋白膜。
使最终使用者都能活化亲和性装置膜的能力，提供了显著优于以前系统的优越性。除了方法的简便性之外，本发明的这方面还提供了更高的系统灵活性和膜标准化程度，这样又进步导致对市场的适应性。按照本发明，最终使用者都能得到一种单一的抗生物素蛋白膜和多种含有不同的生物素化配体的溶液。于是，取决于将被治疗的病症，使用者可以用适当的配体活化抗生物素蛋白膜，并用生理盐水或透析液洗去剩余的配体。
除了在化学固相化过程中发挥作用之外，抗生物素蛋白还有作为膜表面和固相化配体之间的亲水性隔离物的作用。使用分子隔离物将固体基质表面与配体的活性位点作物理学上的分离，是化学固相化技术中熟知的。关于这方面，分子隔离物通常是相对较短的脂肪链(长度4-10个碳原子)，这对促进表面的相互作用，或者促进涉及小配体或靶溶解物的相互作用是适宜的。但是，当这种相互作用涉及到一个或多个大分子时，这些短链隔离物是相当无能为力的。另一方面，使用更长的脂肪链令其不利地改变膜表面的疏水性。因此，按本发明使用抗生物素蛋白，不但提供了改进的固相化程序，并且它还具有作为隔离物分子而不表现上述隔离物缺点的双重作用。
在绝大多数情况下，抗生物素蛋白将是适合的隔离物分子，但是，使用抗生物素蛋白的潜在缺点是，当配体和靶分子都相当小时抗生物素蛋白引起的密度限制。在这种情况之下，抗生物素蛋白的饱和单层可能是膜结合溶解物的比容量有关的限制因素。但是，在绝大多数情况下，无论配体还是它的靶分子，或者它们二者都是足够大，以至使抗生物素蛋白的饱和限制对膜容量不是限制因素。
在本发明中，本发明者还公开了用于在亲和性膜装置中将配体结合于微孔表面的第二种改进方法。这种改进的方法导致形成了更高效率的装置，对配体更大的利用率，以及更高的装置容量。
如上面所述，使用分子隔离物便利了固相化配体和靶溶解物之间的分子相互作用。相对较短的脂肪链(长度4-10个碳原子)对涉及一个或几个大分子的相互作用是无能为力的，而较长的脂肪链又会不期望地改变膜表面的疏水性。
按照本发明，在一个实施方案中，其固相化程序使用了聚乙二醇(PEG，也称为聚乙烯氧化物)。应用特殊的化学固相化技术，可将适当链长度的聚乙二醇，通常是50至250个碳原子之间长度的聚乙二醇共价地固相化在膜表面。在封闭剩余的活性位点之后，接着可以应用适当的化学方法将所需要的配体与聚乙二醇共价偶联。聚乙二醇作为分子隔离物的独特优点是它的亲水性和生物学惰性，这二点对于接触血液或血浆的装置都非常有利。
作为范例而不是限制，下面将对简便的杂官能(heterofunctional)PEG固相化方法进行描述，杂官能PEG可从供应商购得，它的一端具有氨基末端，另一端具有羧基末端。应用与氨基反应的许多适合的化学固相化方法中的任何一种，可以将杂官能PEG通过它的氨基末端固相化在膜表面。如上面所述，这些方法包括那些应用溴化氰，N，N′-羰基二咪唑等的方法。在封闭剩余的活性基团之后，应用适当的化学方法将所需要的配体共价地偶联于此杂官能PEG的羧基末端。能促进在羧基和胺之间形成酰胺键的这样一种试剂，是1 乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺。
应用PEG的固相化方法具有几个优点。首先是，使用一个非常长的分子链可减少在表面的空间干扰，并可使大分子在表面分成多层。例如，据我们应用抗生物素蛋白-生物素化学法的经验，抗生物素蛋白的存在将抗体-LDL的相互作用投射至远离膜表面，但是膜的总容量仍然受到可用于在其表面结合LDL颗粒的表面面积的限制。通过从膜表面延伸长而易揉曲的链，抗体被伸出远离膜表面，按这样一种方式可允许靶大分子堆积起来。邻近的链可能是相同长度的，但是通过伸展程度不同，与LDL结合的部分卷曲的链，不可能干扰LDL对附近完全伸展链的结合。
尽管抗生物素蛋白也能使抗体伸出远离膜表面，但是，一个长而向易揉曲的隔离物可能更有效地使抗体伸入到流动的液体之中，从而提高结合的动力学，并增加容量。
值得注意的是，尽管PEG途径显得具有许多优势，但是使用PEG的化学途径本身可能不具有抗生物素蛋白-生物素模式的化学适应性。因此，既使用PEG的同时使用抗生物素蛋白-生物素复合物可能是有益的。按照这样一种途径，抗生物素蛋白将被偶联于已固相化在膜表面的PEG。然后将如上所述的抗生物素蛋白-生物素化学技术用于配体的固相化。
作为范例而不是限制，下面将列举可说明某些示范性固相化技术的实验结果。值得注意的是，这些范例显示了各种在平面膜片上进行的固相化作用，不同于在空心纤维膜上的固相化作用。在此引入这些范例，用于证明按照本发明开发改进的固相化模式。如下的范例主要是用于化学连接的材料不同：(1)抗生物素蛋白，(2)链霉抗生物素蛋白，和(3)聚乙二醇。
实验实施例1
针对人载脂蛋白B(apo B)的绵羊免疫球蛋白G(IgG)，通过亲和层析法分离后用偏高碘酸钠(Sigma Chemical Co.，St.Louis.MO)氧化。用甘油使反应淬灭，并通过凝胶渗透层析法从反应产物中分离出氧化的IgG。通过与生物素-LC-酰肼(Pierce，Rockford，IL)反应使氧化的IgG生物素化。
按照厂商说明书中的扩散性固相化程序，将抗生物素蛋白(Pierce)固相化在Immobilon AV膜(Millipore)上。末反应的位点以脱脂干乳溶液(1％ w/w)掩盖。将包含有固相化抗生物素蛋白的膜浸泡在含有生物素化IgG的溶液中。被固相化在膜上的IgG量，可以从溶液中在280毫微米光吸收度的改变来确定。IgG的密度是每ml膜容积143μg。
静止膜容量是通过将该膜在含有过量apoB的人血浆溶液中温育来确定。用缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)粗略地漂洗之后，以0.04M柠檬酸缓冲液在pH2.9从膜上洗脱apoB。借助于总蛋白测定法(从BioRad可购得试剂盒)测定存在于洗脱缓冲液中的apoB含量。
所形成的膜容量是每ml膜容积31μg apoB。
实验实施例2
如实施例1中所述制备氧化的IgG。按照厂商说明书中的扩散性固相化程序，将链霉抗生物素蛋白(Pierce)固相化在Immobilon AV膜(Millipore Corporation，Bedford，MA)上。末反应的位点以无脂干乳液(1％w/w)掩盖。将包含有固相化链霉抗生物素蛋白的膜浸泡在含有生物素化IgG的溶液中。被固相化在膜上的IgG量，可以从溶液中在280毫微米光吸收度的改变来确定。IgG的密度是每ml膜容积1.39mg。
按在实施例1中所述，对静止膜容量进行测定。所形成的膜容量是每ml膜容积30μg apoB。
实验实施例3
如实施例1中所述制备氧化的IgG。按照厂商说明书中的斑点固相化程序，将杂官能聚(乙二醇)(NH2-PEG-COOH，从ShearweterPolymer，Huntsville，AL购得)固相化在Immobilon AV膜上。未反应的位点以乙醇胺(7％ v/v)掩盖。在1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(“EDC”)存在下使固相化的聚(乙二醇)(“PEG”)与己二酰肼反应，产生用于连接氧化IgG的功能位点。使用氧化的IgG与PEG-酰肼隔离物偶联，再将生成的Schiff碱以氰基氢硼化钠还原。此膜在使用前以蒸馏水和1M NaCl溶液漂洗。
可通过使人血浆液流过一个包含有一叠膜园片的膜园片小盒(从Amicon购得)来测定动态膜容量。提供给膜园片的人血浆内包含有过量的apoB。一叠膜园片的数量范围是5-20片。根据从小盒流出的样品和起始样品之间血浆apoB的浓度之差，可确定与膜结合的apoB量。血浆apoB的浓度可用商购检测试剂盒(可从Boehringer MannheimCorporation，Indianapolis，IN购得)测定。
所形成的膜容量范围为每ml膜容积0.39-2.03mg apoB。
本发明还提供了一种用于治疗某些疾病的方法，而这些疾病是以血中某一特殊溶解物过高含量为特征的。如以前已提及，本发明的亲和性膜装置是设计用于体外血液循环的，并可同用于净化血液的其它治疗过程，如血液透析同时应用。通过应用本发明可实现的免疫吸附治疗，对某些病症可作为有效的治疗方案。具体地说，本发明可用于治疗与血浆中存在某一特殊的分子结构有关的病症，对这种分子的清除是对此病症作暂时治疗或根治的基础。除了识别血浆中的靶分子之外，根据其对能够从血浆中结合并清除这种靶分子的适合配体的识别能力，还预示本发明可用于治疗这类病症。
作为范例而不是限制，根据本发明可能治疗的病症实例包括：血胆固醇过多症，与IgG或IgM相关的移植排斥反应，Goodpastures氏综合症，全身性脉管炎，以及系统性红斑狼疮。这些病症的每一种都与血中含有过量的某种特殊溶液物为特征。例如，患有家族性血胆固醇过多症的病人，其特征是血中具有高浓度的低密度脂蛋白(LDL)，清除LDL将对这种病症发挥有效的治疗作用。
根据本发明，这种亲和性膜装置不但可用于清除待治疗病人血中的靶溶解物，而且还可以与其它分离过程(如血液透析)同时应用。关于这方面，对于正在接受血液透析治疗晚期肾病(ESRD)病人，某些治疗应用可以优选地采用。这些治疗应用包括例如，体外清除LDL，β2-微球蛋白，以及同种异体移植接受者的IgG。这些病人理想地适合这种体外治疗，因为许多病人已经接受了每周3次，每次3-4小时的。体外血液透析治疗。并且，许多这种病人已经接受了外科手术，对他们的血管系统形成了允许使用高血液流速(＞200ml/min)的进出通道。
本发明与血液透析过程同时应用的能力必然显示出许多优点。通常，体外治疗要求病人有专用的时间保证，需要医务人员准备好血管进出通道并操纵仪器，还涉及与血管进出通道有关的医疗危险。通过把本发明的溶解物清除过程与血液透析结合起来，既不增加总的治疗时间，也没有任何附加的要求，或承担比血液透析治疗本身更多的危险。
因为实施亲和性膜治疗需要血流的进出通道，所以，可能特别适合于定期接受体外血液处理如血液透析的病人。而且，如下面所述，透析处理病人患有的严重病症，通过用亲和性膜装置治疗可能会有改善。对于尚没有血液进出通道可容易利用的病人，使用亲和性膜治疗应限于那样一些病症，对其实施治疗的好处胜于血液进出通道的危险。下面将对这种非透析应用的实例作更详细论述。
作为范例而不是限制，下面将列举显示应用本发明亲和性膜装置方法的一个实例。
在开始透析之前，实施外科手术，形成一个永久性的血液进出通道位置(人工动静脉移植，或者动静脉吻合，即动脉和静脉的手术接合)。透析过程典型地是采用双针程序进行，具有分开的线路供血液抽取和返回。将亲和性装置与透析器串联相连，并与透析循环的剩余部分一起注入生理盐水。根据病人一贯的抗凝方式对血液进行抗凝处理。在透析过程中，用蠕动泵以200-500ml/nin的流速将血液泵入透析器。因为亲和性膜装置是与透析器串联相连，它的血流速度与病人规定用于透析的血流速度相等。为了尽量减小与正常透析程序的差异，使亲和性装置按照病人通常透析治疗的时间运行，一般是一周3次，每次3-4小时。取决于待清除的靶配体量，亲和性装置可能在部分或者全部透析过程中使用。
作为范例而不是限制，可能借助于亲和性膜装置改善的透析病人病症的例子是，淀粉样变性，血胆固醇过多症，以及移植排斥反应。
长期透析的病人令遭受关节痛和其它淀粉样变性症状之后，据认为是由于在关节和其它组织中β-2微球蛋白长期积累所致。β-2微球蛋白是一种小分子量蛋白质，正常情况下它是从体内所有具核细胞的细胞膜流出。通常，在从血浆中清除过多的β-2微球蛋白的过程中，肾起了决定性的作用。在肾功能缺乏的情况下，血浆中β-2微球蛋白的浓度逐渐上升，最高达到其正常值的50倍。高血浆浓度导致β-2微球蛋白转移进入各种组织。对透析病人，通过用亲和性膜处理，定期清除β-2微球蛋白，将使血浆中β-2微球蛋白的浓度降低。较低的平均血浆浓度将减少从血浆向组织的转移，并可能导致从组织中被清除。
导致透析病人死亡的原因是心血管病，而不是肾脏病。在一般的人群中，已知高LDL浓度是心血管病的危险因素。因为相当大部分透析病人具有高LDL浓度，所以本发明者相信，透析病人心血管病发病率和死亡率的高危险，可部分地归因于它们的高LDL浓度。对于具有高LDL浓度值的病人，通过在透析过程中用亲和性膜处理，将降低LDL浓度，从而降低发病率和死亡率的危险。
典型的肾移植受者在等待得到供体器官时，需靠透析维持几个月之久。对于同种异体移植(即人器官对人受者)，清除免疫球蛋白G(IgG)可以降低急性器官排斥反应发生率和/或严重程度，从而改善整体移植存活率。因此，使用亲和性膜在临移植之前清除IgG，将降低移植时的IgG水平，从而减少移植排斥反应的危险性。
对于没有制备永久性血液进出通道的病人，可在适当的部位制备临时性血流进出通道(例如，通过在锁骨下静脉插入双通(dual lumen)导管)。将亲和性装置的腔隙端与蠕动泵相连接，并注入生理盐水。在腔隙端被灌注之后，将滤出液出口打开，使之对套管端进行灌注。然后，当装置注入血液时，将滤出液导管夹住。为防止血液凝结，在步骤开始时应以大丸剂加入抗凝剂(用注射器或泵)，并且/或者在整个操作过程中持续地加入抗凝剂(通过泵)。因为血液流速受临时性进出通道的容量所限制，最大的血液流速应在100-300ml/min的范围内。为了按照图2中描绘的本发明实施方案运行，可在血液充满腔隙端之后将滤出液出口打开。如前面所述，靶物质在血浆和血液中的浓度将降低。处理过程的时间和使用频率取决于待清除靶配体的含量。
作为范例而不是限制，对于未进行透析的病人，可使用亲和性膜的三种病症实例是，严重的血胆固醇过多症，严重的移植排斥反应，以及严重的自身免疫疾病。
血胆固醇过多症的最严重形式是纯合的家族性血胆固醇过多症。如果不治疗，这种病人通常在20岁左右致死。而较轻型的血胆固醇过多症可能也没有理由使用侵害性体外血液处理，患有纯合的家族性血胆固醇过多症的病人以前是用复杂和昂贵的亲和性柱系统进行治疗。与亲和性柱相比较，亲和性膜提供了操作简便，费用较低的潜在性优点。通过使用本亲和性装置本发明者预期，降低LDL水平将导致增加概率寿命。
象透析病人一样，其它器官移植的接受者也可以通过在移植之前清除免疫球蛋白而受益。如上所述，在进行同种异体移植之前清除免疫球蛋白G(IgG)，可以降低急性器官排斥反应的发生率和/或严重程度，从而改善总体移植存活率。
由于供移植的人器官非常缺乏，当前正在研究异种移植(例如将猪的器官用于人受者)。清除引起超急性排斥反应的免疫球蛋白M亚类(异种反应性IgM)，可能是异种移植成功的关键所在。
对于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，是由于病人产生了针对其自身细胞的抗体。自身免疫性疾病的多种症状可能是由于自身抗体对特异性组织的作用，或者是由于从这些自身抗体形成的免疫复合物的积累。因此，通过使用亲和性膜清除自身抗体和/或免疫复合物，将减少自身免疫性疾病的症状和并发症。对于针对于肾脏的自身免疫性疾病，例如Goodpasture氏病和全身性脉管炎，清除自身抗体将延缓肾病的进程，延缓或阻止对透析的需要。
应该理解到，对于本领域的专业人员，在此所述的优选实施方案的各种变化和修改形式将是显然的。可能产生这些变化和修改形式而不脱离本发明的精髓和范围，并且不减少其伴随的优越性。因此我们打算通过附加的权利要求来包括这些变化和修改形式。