多肽-聚合物缀合物 【发明领域】
本发明涉及一种多肽-聚合物缀合物，其中所述聚合物是与多肽表面偶联的接枝、嵌段、交替或无规共聚物。本发明也涉及含有本发明的缀合物的工业组合物和产品，将本发明的多肽-聚合物缀合物用于减弱工业组合物和产品的变应原性的用途，和涉及一种减弱多肽的变应原性的方法。发明背景
对于医用和工业用途，多肽、包括酶的应用是本领域熟知的。由于多肽可能潜在地引起不期望的免疫反应(取决于攻击的方式)一般为IgG和/或IgE反应，所以在过去三十年间已开发了减弱这种反应的技术。
一种技术是偶联技术，其中将许多聚合物分子偶联到目标多肽上。当使用该技术时，免疫系统难以识别负责形成抗体的表位(在多肽表面上)，从而减弱免疫反应。
对于已被直接引入人体的循环系统以提供特定的生理效应(即药物制剂)的多肽，典型的潜在免疫反应是IgG和/或IgM反应，而从呼吸系统吸入的多肽(即，工业多肽)可能引起IgE反应(即，变态反应)。
解释免疫反应减弱的一种理论是聚合物分子屏蔽了在多肽表面上的表位，其中多肽负责引起抗体形成的免疫反应。另一种理论或至少部分因素是所述缀合物越大，得到的免疫反应越强。
通常用于与多肽偶联以形成缀合物的聚合物是均聚物，即由一种重复单元组成，例如氧化乙烯(EO)，尤其是聚乙二醇(PEG)，或氧化丙烯(PO)，尤其是聚丙二醇(PPG)。还可使用糖类，例如糊精。
美国专利4,179,337涉及非免疫原性多肽，例如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶联地酶和肽激素。
WO96/17929(Novo Nordisk A/S)涉及与聚合物分子、尤其与聚乙二醇(PEG)偶联的修饰多肽缀合物。发明概述
本发明涉及一种多肽-聚合物缀合物，它适于工业应用和作为活性组分引入工业产品中。
本发明人发现，与亲代酶相比，甚至与相应的已与PEG或其它均聚物偶联的缀合物相比，当使接枝、嵌段、交替或无规共聚物与用于工业应用时的亲代多肽共价偶联时，呼吸变应原性减弱，其中所述聚合物由以下通式表征：
EOxPOy (Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
第二方面，本发明涉及在工业产品中所用的含有本发明缀合物的组合物。
第三方面，本发明涉及一种减弱多肽的变应原性的方法。工业多肽
用于工业用途的多肽通常具有酶活性和/或抗微生物活性。工业多肽(与药物多肽相比)不意在被引入人体的循环系统中。
所以，工业组合物和/或产品(如下定义)，例如洗涤剂，如洗衣和洗碟剂、食物或饲料添加剂，包括用于生产面包的添加剂，用于处理织物的组合物，和个人护理用品，包括化妆品，这些产品中用作活性组分的工业多肽(例如酶)不太可能与人体或动物体的循环系统直接接触，这是由于这些多肽(或含有这些多肽的产品)不直接注射(或以类似方式)入血液中。
因此，在工业多肽的情况下，潜在的危险是由于经呼吸道吸入多肽所导致的呼吸变态反应症(即IgE反应)。
在本发明上下文中，“工业多肽”定义为这样的多肽，包括不旨在引入人体和/或动物的循环系统中的肽、蛋白质和/或酶，。
这种多肽的例子包括具有如下定义的酶活性的多肽。
本发明也涉及具有减弱的变应原性的工业组合物和产物。
另外，本发明涉及将本发明的多肽-聚合物缀合物用于减弱工业组合物和产品的呼吸变应原性的用途。
最后本发明涉及通过将一种或多种接枝、嵌段、交替或无规共聚物与未修饰的亲代多肽偶联来减弱多肽(特别是酶)的变应原性的方法。附图简述
该图显示Brown Norway大鼠血清对修饰和未修饰的酶的IgE反应。发明详述
本发明涉及一种多肽-聚合物缀合物，它适于工业用途且作为活性组分引入工业产品中。本发明的缀合物具有减弱的呼吸变应原性。
在本发明的上下文中，术语“多肽-聚合物缀合物”指在其上共价偶联有一种或多种聚合物的多肽。
在本发明的上下文中，术语“减弱的变应原性”指，与相应的亲代多肽相比，在吸入本发明的修饰多肽时所产生的能导致变应性状态的IgE(在人体内，而在特定动物中为具有相当作用的分子)的量降低。可交换使用术语“呼吸变应原性”。
本发明人已发现，与相应的未修饰的亲代多肽相比，甚至与相应的缀合物(其中相应数量的均聚物(如PEG)已与相应的亲代多肽偶联)相比，当未修饰的亲代多肽与接枝、嵌段、交替或无规共聚物偶联时，由吸入多肽引起的潜在变应原性反应减弱。
众所周知，聚合物可主要(但不仅)根据其分子结构、溶剂(此处为水)、温度和浓度(S.Forster和M.Antonietti,Adv.Mater,1998,10，第3期，195-217页)来采取不同的构象/形态。这些构象/形态包括各种形状的胶束、薄片、规则的柱形或双连续结构。共聚物在水性介质中的分子构象，例如溶剂化的无规线团、伸直的线团、棒状聚合物、超级线团和胶囊是熟知的(水溶性聚合物，M.J.Comstock编辑，ACS Symposium Series,1991)。
因此，在不限于任何理论的情况下，认为连接于多肽表面上的接枝、嵌段、交替或无规共聚物在水中采取如亲水性较强的均聚物那样更好地屏蔽所述表面的构象。由超分子结构的形成导致的协同效应也可降低多肽表面的可接近性。另外，亲油性更强的共聚物(与PEG均聚物相比)对抗体较强的排斥作用也可能起作用。
另外，接枝、嵌段、交替或无规共聚物的刚性较强的结构(与均聚物相比)可导致抗体更难“找到”(从刚性较强的聚合物和采取的构象)到达多肽表面上表位的“路径”，其中所述多肽表面负责导致变态反应的IgE的形成。
也认为聚合物的疏水性对多肽-聚合物缀合物的潜在变应原性有影响。所以，聚合物的疏水性越强，该聚合物越好地屏蔽多肽。
通过适当选择聚合物和分子结构，可获得用于屏蔽多肽表面上的表位的最佳覆盖度。另外，通过调节所附着的聚合物的性能，可获得不同配方(例如在脂肪或乳脂中)的最佳性能。
第一方面，本发明涉及一种多肽-聚合物缀合物，其中一种或多种聚合物已与亲代多肽共价偶联，其中所述聚合物由以下通式表征：
EOxPOy (Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。“EO”指氧化乙烯，“PO”指氧化丙烯。所述聚合物的分子量一般在100-100,000Da的范围内，优选100-50,000Da，尤其是100-10,000Da。
在一个优选实施方案中，所述聚合物含有氧化乙烯单元(EO)和氧化丙烯单元(PO)，其比例在10∶90或20∶80或30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20或90∶10的范围内。变应原性的评价
可在吸入试验的基础上评价变应原性，比较气管内(在气管内)施用亲代多肽和根据本发明的相应修饰多肽的效果。
现有多种用于评价多肽变应原性的体内动物模型。这些模型中的一些可提供用于人类危害评价的适当基础。合适的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。这些模型试图根据在前述致敏动物中引发的反应鉴定呼吸变应原。根据上述模型将推定的变应原通过气管内方法导入动物体内。
合适的豚鼠品系-Dunkin Hartley品系-不是像人那样在变态反应时产生IgE抗体。不过，它们能产生另一种类型的抗体IgG1A和IgG1B(例如，参见Prentφ,ATLA,19,p.8-14,1991)，上述抗体负责针对包括酶在内的吸入多肽的变态反应。因此，当使用Dunkin Hartley动物模型时，IgG1A和IgG1B的相对量是衡量变应原性水平的尺度。
适于气管内接触多肽、例如酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway品系在变态反应中可产生IgE。
关于评价豚鼠和小鼠的呼吸变应原性的更多细节如Kimber等(1996)，基础和应用毒理学，33,1-10页所述。
还可将诸如兔的其它动物用于类似的研究。聚合物分子
与多肽偶联的聚合物是具有以下通式的接枝、嵌段、交替或无规共聚物：
EOxPOy (Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
所述聚合物优选由通式(Ⅰ)表征，其中x=10-90％,y=10-90％,且x+y=100％。
在本发明的一个优选实施方案中，聚合物由氧化乙烯单元(EO)和氧化丙烯单元(PO)组成，(EO单元∶PO单元)比例为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和90∶10。
在一个优选实施方案中，所述聚合物的分子量在100-100,000Da的范围内，特别是100-50,000Da，尤其是100-10,000Da。
在更优选的实施方案中，所述聚合物的分子量为100-12,000Da，更优选300-3,000Da。
在本发明的一个实施方案中，所述聚合物是二嵌段、三嵌段、多嵌段聚合物。通式(Ⅰ)应该理解为包括聚合物，其中EO单元和PO单元独立安置。
可用于与多肽表面偶联的特定嵌段聚合物的例子是：聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)；聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)单丁基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)单丁基醚；聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)单甲基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)单甲基醚。
优选的嵌段聚合物是具有通式：H(-OCH2CH2-)x[-OCH(CH3)CH2-]y(-OCH2CH2-)zOH的聚合物，其平均分子量(Mn)为1100，乙二醇含量为10重量％,Mn=1900和50重量％,Mn=2000和10重量％,Mn=2800和10重量％,Mn=2800和15重量％,Mn=2900和40重量％,Mn=4400和30重量％,Mn=5800和30重量％,Mn=8400和80重量％。
其它优选的嵌段聚合物是具有通式：H(-OCH(CH3)CH2-)x[-OCH2CH2-]y(-OCH(CH3)CH2-)zOH的聚合物，其平均分子量(Mn)为2000，乙二醇含量为50重量％,Mn=2700和40重量％,Mn=3300和10重量％。
特定的嵌段聚合物的例子是购自BASF(德国)的p7120:Pluronics，购自Union Carbide(美国)的Tergitol，购自Fluka(瑞典)的Synperonic。
可用于与多肽表面偶联的特定共聚物的例子是：聚(乙二醇-共聚-丙二醇)，尤其是平均分子量Mn为2500、乙二醇含量为75重量％和平均分子量Mn为12000、乙二醇含量为75重量％的聚(乙二醇-共聚-丙二醇)；聚(乙二醇-共聚-丙二醇)单丁基醚，尤其是Mn为970、乙二醇含量为50重量％和Mn为1700、乙二醇含量为50重量％和Mn为3900、乙二醇含量为50重量％的聚(乙二醇-共聚-丙二醇)单丁基醚；聚(乙二醇-共聚-丙二醇)单甲基醚。
优选的聚合物是由例如PEG和PPG共聚物组成的无毒聚合物。这样的聚合物是优选的，它与酶表面上的附着基团进行共价偶联的化学条件较简单。
接枝、嵌段、交替或无规共聚物可以是星形或支化的。合适的聚合物的制备
附着于亲代多肽表面上的聚合物可用本领域所知的标准技术制备。另外，各种聚合物可购自例如BASF(德国)、Union Carbide(美国)和Aldrich等公司。聚合物的激活
如果与所述多肽缀合的聚合物无活性，那么必须通过采用合适的技术来激活聚合物。根据本发明也考虑通过连接体将嵌段或共聚物偶联到多肽上。合适的连接体是本领域熟练技术人员熟知的。
激活聚合物分子和缀合多肽的方法和化学在文献中作过充分描述。
常用于激活不可溶的聚合物的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等激活官能团(参见R.F.Taylor,(1991)，“蛋白质固定化。功能及应用”，Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong(1992)，“蛋白质缀合和交联化学”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等(1993)，“固定化亲和配体技术”，学术出版社，N.Y.)。上述一些方法涉及激活不溶性聚合物，但也可应用于激活可溶性聚合物，例如，高碘酸、三氯三嗪、磺酰卤、二乙烯基砜、碳化二亚胺等。官能团是所述聚合物上的氨基、羟基、硫羟基、羧基、醛或巯基，在选择激活和缀合化学时，必须考虑选择所述蛋白上的结合基团，其中激活和缀合化学通常包括ⅰ)聚合物的激活，ⅱ)缀合，和ⅲ)封闭剩余的活性基团。
下面将简短地描述多种合适的聚合物激活方法。但是，应该理解的是也可使用其它方法。
聚合物分子与多肽的自由酸基团的偶联可在二酰亚胺的帮助下进行，例如氨基-PEG或联氨基-PEG(Pollak等，(1976)，美国化学会志，98,289-291)或二偶氮乙酸盐或酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白质缀合和交联化学”，CRC出版社)。
聚合物分子对羟基的偶联一般很难，因为必须在水中进行。通常，水解比与羟基的反应更占优势。
聚合物分子对自由巯基的偶联可通过特定的基团如马来酰亚胺或邻吡啶基二硫化物来达到。乙烯基砜(美国专利5,414,135,(1995),Snow等)也是优选的巯基，但不如其它提及的基团的选择性高。
多肽链中的可接近的精氨酸残基可被含有两个临近的羰基的基团所靶定。
也可以使用通过亲电子方法将激活的PEG与赖氨酸上的氨基连接在一起的方法。醇的很多常见的离去基团可以产生胺键。例如，可以使用诸如tresylates的烷基磺酸盐(Nilsson等(1984)，酶学方法，第104卷，Jacoby,W.B.著，学术出版社：Orlando,p.56-66；Nilsson等(1987)，酶学方法，第135卷；Mosbach,K.，著；学术出版社：Orlando,p.65-79；Scouten等(1987)，酶学方法，第135卷，Mosbach,K.，著，学术出版社：Orlando,1987；p.79-84；Crossland等，(1971)，美国化学学会杂志1971,93,p.4217-4219)，甲磺酸盐(Harris,(1985)，出处同上；Harris等(1984)，聚合物科学聚合物化学杂志(J.Polym.Sci.Polym.Chem.)22版，p.341-352)，诸如甲苯磺酸盐和对硝基苯磺酸盐的芳基苯磺酸盐。
诸如Tresyl chloride的有机磺酰氯，可将多种聚合物(例如PEG)中的羟基有效转化为良好的离去基团(磺酸盐)，该基团在与诸如多肽链上的氨基的亲核试剂反应时可在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了高缀合率之外，反应条件一般是温和的(中性或弱碱性pH，以避免变性和很少或不破坏活性)，并满足对多肽的非破坏性要求。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐更活泼，但也更不稳定，分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky,(1995)，生物缀合物化学(BioconjugateChem.),6,150-165)。还可以用环氧化物产生胺键，但比上述基团的活性更小。
用碳酰氯将PEG转化成氯甲酸酯，可使赖氨酸产生氨基甲酸酯键。这一方案可以多种变形实施，用N-羟基一琥珀酰亚胺(美国专利，5,122,614,(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技术应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.),15,p100-114；Monfardini等，(1995)，生物缀合物化学，6,62-69，用咪唑(Allen等，(1991)，糖研究(Carbohydr.Res.),213,p309-319)，用对硝基苯酚，DMAP(EP632082 A1,(1993),Looze,Y.)等取代氯。所述衍生物通常是通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应制成的。所以这些基团均可使所述肽产生氨基甲酸酯键。
而且，可分别用异氰酸酯和异硫氰酸酯产生脲和硫脲。
可以用与上述相同的离去基团和环状imid throne由PEG酸获得酰胺(美国专利5,349,001,(1994),Greenwald等)。这些化合物的反应性很高，但可能导致水解过快。
还可以使用通过与琥珀酐的反应而获得的PEG琥珀酸酯。因此其包括使所述缀合物更易于水解的酯基(美国专利5,122,614,(1992),Zalipsky)。该基团可以由N-羟基琥珀酰亚胺激活。
而且，可以引入一种特殊的连接体。使用最久的连接体是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化学杂志，252,3578-3581；美国专利4,179,337,(1979),Davis等；Shafer等，(1986),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375-378)。
PEG与芳族胺偶联，随后再进行重氮化，可产生一种十分活泼的重氮盐，该盐可在原位与肽反应。还可以通过PEG的吖内酯衍生物的反应产生酰胺键(美国专利5,321,095,(1994),Greenwald,R.B.)，从而引入另一个酰胺键。
由于一些多肽不含许多赖氨酸，可能有利的是对相同赖氨酸附着一个以上的PEG。这可例如通过使用1,3-二氨基-2-丙醇来获得。
PEG还可以通过氨基甲酸酯键与酶的氨基连接(WO95/11924,Greenwald等)。还可将赖氨酸残基用作骨架。偶联的嵌段或共聚物的位置
实际上，所有离子化基团，例如赖氨酸残基的氨基，位于多肽分子的表面上(参见例如Thomas E.Creighton,(1993)，“蛋白质”，W.H.Freeman和公司，纽约)。所以，在多肽表面上的易于接近的附着基团(即，氨基)的数目等于在多肽一级结构中的赖氨酸残基与N-端氨基的数目之和。
根据本发明，1-100个聚合物、优选4-50个聚合物分子、5-35个聚合物与所述亲代多肽偶联。亲代多肽
本发明的修饰多肽可在亲代多肽的基础上采用本领域熟知的任何合适的技术来制备，所述修饰多肽的分子量典型地在1-100kDa的范围内，优选15-60kDa。
术语“亲代”多肽指任何未偶联的多肽(即，待修饰的多肽)。多肽可优选是微生物来源，例如细菌或丝状真菌或酵母来源。亲代多肽可以是天然存在(或野生类型)的多肽或可以是其变体。
优选的多肽是具有抗微生物活性的酶和多肽。在优选实施方案中，所述酶是适于护肤组合物和产品的酶，它在护肤产品所用的pH范围内具有实质性的酶活性。
当选择亲代多肽时，有利的是使用含有数目多的附着基团的多肽。
而且，在本发明的优选实施方案中，嵌段或共聚物广泛地分布于亲代多肽的表面上。对于酶，优选在接近活性点的区域内不偶联嵌段或共聚物。
在本发明的上下文中，“广泛地分布”指处于这样的位置，以使与多肽的附着基团偶联的聚合物分子屏蔽多肽表面的不同部分，优选屏蔽多肽表面的全部或接近全部表面积，以确保可识别的相关表位被屏蔽，从而不被免疫系统的抗体识别。认为多肽与抗体之间的相互作用表面积在约500平方埃(26×19埃)的范围内(参见Sheriff等，(1987)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第84卷，8075页)。
为了保证酶活性的最小损失，对于酶，优选在活性点的近距离处不偶联聚合物。一般地，优选在距离活性点5埃内、优选10埃内不附着聚合物。
另外，根据本发明认为这样的多肽也是有利的，所述多肽在可被免疫系统识别的已知表位处或接近所述表位处含有已偶联的聚合物。如果不知道表位的位置，有利的是使尽可能多的聚合物与多肽表面上附着基团偶联。优选所述附着基团在活性点的适当距离处广泛地分布在多肽的表面上。
根据本发明，满足上述对偶联聚合物在多肽表面上的分布要求的亲代多肽是优选的。
对于酶，特别是在距离活性点0-5埃内、优选0-10埃内不偶联聚合物或只偶联很少聚合物的酶是优选的。酶活性
亲代酶可具有已知用于如下定义的工业组合物和产品的任何活性。考虑的酶活性包括氧化还原酶(E.C.1，“酶命名法”，(1992)，学术出版社)，例如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶(E.C.3)，包括蛋白酶，尤其是丝氨酸蛋白酶，例如枯草菌素和脂酶；转移酶(E.C.2)，例如转谷氨酰胺酶(TGases)；异构酶(E.C.5)，例如蛋白质二硫化物异构酶(PDI)。水解酶解蛋白酶
考虑的解蛋白酶包括具有上述性能(例如，附着基团的数目、附着基团的位置等)的蛋白酶，选自酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(例如枯草菌素)、或金属蛋白酶。
含有合适数目的附着基团的合适的亲代蛋白酶的具体例子如下表1所示：
表1 酶附着基团的数目 分子量， kDa 参考文献 PD498 13 29 Seq.ID No.2 WO93/24623 Savinase 6 27 Von derOsten等，(1993)，生物技术杂志，28,p.55+蛋白酶K 9 29 Gunkel等，(1989)，欧洲生物化学杂志，179,p.185-194蛋白酶R 5 29 Samal等，(1990)，分子微生物学(Mol.Microbiol),4,p.1789-1792蛋白酶T 14 29 Samal等，(1989)，基因，85,p.329-333枯草菌素DY 13 27 Betzel等，(1993)，生物物理文献(Arch.Biophys),302,2,p.499-502 Lion Y 15 46 SEQ ID No.4 JP04197182-A Rennilase 39购自Novo Nordisk A/S Ja16 5 28 WO92/17576嗜热菌蛋白酶 12 34Titani等，(1972)自然杂志新生物学手册(Nature New Biol.)238,p.35-37，和SEQ ID No.5 Alcalase(天然枯草菌素Carlberg变体) 10 27 Von derOsten等，(1993)，生物技术杂志，28,p.55+
枯草菌素PD498的分子量为29kDa，并由SEQ ID No.2可见，含有用于在酶表面上附着聚合物的12个赖氨酸基团和1个N-端氨基。如上所述，优选的酶具有在其表面上广泛分布的赖氨酸。PD498在距离活性点0-10埃处不含赖氨酸残基，这特别适于修饰形式。另外，赖氨酸残基在酶的表面上广泛分布(即，远离活性点)。
酶-枯草菌素DY的分子量为27kDa，并在酶的表面上含有12个氨基(即，赖氨酸残基)和1个N-端氨基(参见SEQ ID No.3)。
亲代酶-Lion Y的分子量为46kDa，在酶的表面上含有14个氨基(即，赖氨酸残基)和1个N-端氨基(参见SEQ ID No.4)。
中性金属蛋白酶-嗜热菌蛋白酶的分子量约为34kDa，在其表面上含有11个氨基(即，赖氨酸残基)和1个N-端氨基(参见SEQ ID No.5)。脂解酶
考虑的脂解酶包括Humicola lanuginosa脂肪酶，如EP258 068和EP305 216所述，Humicola insolens，一种Rhizomucor miehei脂肪酶，如EP238 023所述，犁头霉属的种(Absidia sp.)脂解酶(WO96/13578)，假丝酵母属(Candida)脂肪酶，例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶，例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B，如EP214761所述，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶，如EP218272所述，洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶，如EP331376所述，假单胞菌属的种脂肪酶，如WO95/14783所公开，芽孢杆菌属脂肪酶，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)脂肪酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica acta 1131,253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。其它脂解酶包括角质酶(cutinase)。如来自Humicola insolens，门多萨假单胞菌(Psenudomonas mendocina)(WO88/09367)，或腐皮镰孢(Fusarium solanipisi)(如WO90/09446所述)。氧化还原酶漆酶
考虑的漆酶包括WO96/00290和WO95/33836Novo Nordisk所公开的漆酶。
其它氧化还原酶包括过氧化氢酶、葡糖氧化酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、超氧化物歧化酶和脂肪氧化酶。转移酶转谷氨酰胺酶
合适的转移酶包括WO96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中公开的任何转谷氨酰胺酶。异构酶蛋白质二硫化物异构酶
对其无限制，合适的蛋白质二硫化物异构酶包括WO95/01425(Novo NordiskA/S)中公开的PDI。工业组合物
本发明的另一方面涉及含有具有减弱的变应原性的修饰多肽的“工业组合物”。
在本发明的上下文中，“工业组合物”指不意在引入循环系统的组合物。换句话说，指不旨在皮内、静脉内或皮下给药的组合物。
如上所述，多肽(例如酶)用于工业应用的主要问题在于经呼吸系统吸入(例如气管内或鼻内直接接触)所引起的呼吸变态反应的潜在危险。
“工业组合物”的例子是在组合物或产品中所用的多肽，特别是酶和抗微生物多肽，这些组合物或产品例如洗涤剂(包括洗衣和洗碟剂)，家庭用品，农用化学品，个人护理用品(例如护肤品，包括化妆品和美容品)，口服和外用药品，用于处理/加工织物的组合物，用于清洗硬表面的组合物，和用于生产食物和饲料的组合物(包括食物和饲料添加剂，例如用于生产面包等的添加剂)。根据本发明特别考虑的是护肤品和洗涤剂。护肤品
在本发明的上下文中，“护肤品”包括用于清洗、护理和/或美化机体皮肤的全部个人护理用品，并进一步包括其它产品，例如护发品，这些产品在使用期间可能与皮肤或呼吸系统接触。根据本发明还考虑用于动物的相应产品。
根据本发明考虑的护肤品的特定例子是肥皂、化妆品、护肤膏、护肤胶、润肤乳、润肤露、清洗霜、清洗露、清洗乳、冷霜、皂霜、化妆底、乳霜、面膜、含锌化妆水、T区精华素、护手霜、精华粉、增白粉、粉皂、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养精华素、乳性粉底、扑面粉、眼影粉、粉底、指甲去光剂、生发油、发液、发乳、发胶、滋发剂、发定型剂、染发剂(hair dyes)、染发剂(hair colorants)、头屑处理剂、香波、香脂、洗发剂、美发喷洒剂、防晒油、防晒剂、剃须泡沫和胶、剃须膏、婴儿用油、痤疮护理用品、止汗剂、驱虫剂、除臭剂等。适于护肤的酶活性
本发明的护肤组合物包括本发明的具有减弱的变应原性的缀合物和已知用于护肤组合物的其它组分。
已知护肤组合物所用的多种酶活性。蛋白酶
蛋白酶是皮肤清洁制品的有效成分，它可清除死的角蛋白类表皮细胞上层，因而使得皮肤看上去更有光泽、更嫩。另外，蛋白酶也改进了皮肤的光滑度。
而且，蛋白酶可用于美容、洗浴和淋浴制品中，包括洗发水、调节剂、洗液、乳膏、皂条、美容香皂和液体皂。脂酶
脂酶可在化妆品中用作皮肤清洗产品和抗痤疮产品中的活性成分，以除去过量的皮脂，并在洗浴和淋洗产品(例如霜和露)中作为护肤的活性成分。
脂酶还可用在头发清洁产品中(如香波)，用于从头发表面有效去除皮脂和其它脂肪。氧化还原酶
用于个人护理目的的最常见的氧化还原酶是氧化酶(常为葡糖氧化酶)，具有能确保产生H2O2的底物(如葡萄糖)，然后由过氧化物酶(常为乳过氧化物酶)将诸如SCN-或I-氧化成抗微生物剂(SCNO-或I2)。该酶复合物自然中是已知的，如源于乳和唾液。
氧化还原酶被作为口腔护理产品(漱口水、牙粉、口香糖)的抗微生物系统加以商业化应用，其中，还可将其与淀粉葡糖苷酶混合，以产生葡萄糖。已知该系统还可用于化妆制品中，用于防腐目的。
氧化还原酶的另一种用途是用氧化酶、过氧化物酶和漆酶进行氧化性染发(参见例如Novo Nordisk的WO96/00290或WO95/33836)。
已知皮肤(和毛发)表面上所生成的自由基与皮肤的老化过程(发质受损)相关。
所述自由基可激活导致脂肪膜、胶原和细胞破坏的链式反应。将诸如超氧化物歧化酶的自由基清除剂用于化妆品是众所周知的(R.L.Goldemberg,DCI,Nov.93,p.48-52)。
蛋白质二硫化物异构酶(PDI)也是一种氧化还原酶。可将其用于烫发(waving of hair)(将毛发里的二硫键还原和再氧化)并修复受损的毛发(其中，所述损伤主要是还原现有的二硫键)。转谷氨酰胺酶
用于人体皮肤、毛发或指甲的护肤组合物含有(a)氨基官能的活性组分，(b)转谷氨酰胺酶，用于催化活性组分对皮肤、毛发或指甲的交联，和(c)从美国专利5,490,980已知的载体。
适用于哺乳动物的皮肤、毛发或指甲的化妆品组合物含有：(a)至少一种角质层包覆蛋白质，其量足以在所述皮肤、毛发或指甲上提供保护层；(b)转谷氨酰胺酶，其量足以在角质层包覆蛋白质和存在于所述皮肤、头发或指甲中外露角质层的角质层蛋白质之间形成共价键；(c)钙离子，其量足以激活转谷氨酰胺酶；和(d)化妆可接受的介质，其中该组合物包括含有两相的乳液，且其中角质层包覆蛋白包含于其中一相内，转谷氨酰胺酶包含于另一相内(参见美国专利5,525,336)。
JP3083908描述了一种皮肤化妆品，它含有用水溶性物质修饰的转谷氨酰胺酶。修饰物质是例如一种或多种聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、藻酸、羧甲基纤维素、淀粉和羟丙基纤维素。例如通过引入反应基团和与酶键接来进行修饰。用于提供对皮肤温和的物质、引起较短持续时间的脱色和产生气味，并具有护理粗糙皮肤的良好效果、保温和使皮肤更美。本发明的护肤品
在第三方面，本发明涉及含有本发明的护肤组合物的护肤品。术语护肤品”如上定义。
本发明的护肤品可含有本发明的有效量的修饰酶。本领域熟练技术人员已知的这种有效量可通常在护肤成品的0-5％的范围内。
本发明考虑的护肤品包括(但不限于)以下产品：肥皂、化妆品、护肤膏、护肤胶、润肤乳、润肤露、清洗霜、清洗露、清洗乳、冷霜、皂霜、化妆底、乳霜、面膜、含锌化妆水、T区精华素、护手霜、精华粉、增白粉、粉皂、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养精华素、乳性粉底、扑面粉、眼影粉、粉底、指甲去光剂、生发油、发液、发乳、发胶、滋发剂、发定型剂、染发剂、染发剂、头屑处理剂、香波、香脂、洗发剂、美发喷洒剂、防晒油、防晒剂、剃须泡沫、剃须膏、婴儿用油、痤疮护理用品、止汗剂、驱虫剂、除臭剂等。常用的护肤品配方
术语“用于护肤品的组分”指包括已知用于护肤品配方的所有组分。这种组分的例子可在Wilfried Umbach编辑，Ellis Horwood有限公司出版的“化妆品和美容品”，伦敦(1991)和J.Falbe编辑，Spring-Verlag出版的，化妆品中的表面活性剂”(1987)中找到。
下面给出的是非穷举性指导配方。这些配方构成了本发明涉及的重要个人护理制品配方的概览。香皂
成分 例子 ％表面活性剂 皂(钠盐) 83-87螯合剂 乙二胺四乙酸 0.1-0.3稠度调节剂 NaCl 大约0.5染料 ＜0.1荧光增白剂 ＜0.1抗氧化剂 2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚(BHT) 0.1-0.3增白剂 钛白 0.1-0.3芳香剂 1.0-2.0酶 蛋白酶/脂酶 0-5水 余量合成洗涤剂
成分 例子 ％表面活性剂 月桂基硫酸盐 30-50
月桂基磺基琥珀酸盐 1-12再脂化剂 脂肪醇 10-20增塑剂 硬脂酰单/双甘油酯 0-10填料 淀粉 0-10活性剂 水杨酸 0-1染料 ＜0.2芳香剂 0-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5水 余量泡沫洗液和淋浴洗液
成分 例子 ％泡沫洗液 ％淋浴洗液泡沫洗液 淋浴洗液 表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 10-20 10-12
可可氨丙基二甲基甜菜碱 2-4 2-4
乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -再脂化剂 脂肪醇 0.5-3
乙氧基化脂肪醇 0.5-5 0-4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5
成分 例子 ％泡沫洗液 ％淋浴洗液泡沫洗液 淋浴洗液泡沫稳定剂 脂肪酸链烷醇酰胺 0.2-2 0-4调节剂 季铵化羟丙基纤维素 - 0-0.5增稠剂 NaCl 0-3 0-3珠光剂 硬脂酸乙二醇酯 0-2 -活性剂 植物提取物 0-1 0-1防腐剂 5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1芳香剂 0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水 余量 余量护肤霜(油包水型和水包油型)成分 例子 ％油包水型 /水包油型(油包水型/水包油型)乳化剂 脱水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -
硬脂酸铝 1-2 -
三乙醇胺硬脂酸酯 - 1-2
十六烷基/十八烷醇聚乙二醇醚 - 1-3
棕榈酸异丙酯脂肪衍生物 十六烷基/十八烷醇 1-5 0-3
2-辛基十二烷醇 - 0-2
硬脂酸/棕榈酸 2-10 3-7
辛酸/癸酸甘油三酯 - 0-3
硬脂酸甘油酯 5-10 -
甘油 - 0-5湿润剂 山梨醇 1-5 1-5
多(羟基羧酸) 1-5 1-5
丙二醇 0.5-2 -
硫酸镁 - 0-3稳定剂 对羟基苯甲酸酯 0-0.8 -防腐剂 蛋白酶/脂酶 0.2-0.4 0.2-0.4酶 0-5 0-5水 余量 余量用于湿性皮肤的洁体洗液(水包油型)和护肤洗液
成分 例子 ％洁体洗液 ％护肤洗液洁体洗液 护肤洗液乳化剂 十六烷基/十八烷醇聚乙二醇醚 1-3 -
单月桂酸脱水山梨醇酯 0.5-1 -
硬脂酸钠 - 1-2
月桂基乙醚硫酸钠 - 0.5-2脂肪衍生物 2-辛基十二烷醇 1-3 0-5
石蜡油 - 20-25
蜂蜡 0.5-1 -
硬脂酸异辛酯 3-7 -
棕榈酸异丙酯 - 2-5润湿剂 甘油 3-5 5-10
山梨醇 - 0-5增稠剂 聚丙烯酸酯 0-0.3 0-1
甲基羟丙基纤维素 0-0.3 0-0.5防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水 余量 余量洗面液成分 例子 ％表面活性剂 月桂基乙醚硫酸镁 0.2-0.5再脂化剂 己二酸二正丁酯 1-2加溶剂 蓖麻油聚乙二醇醚 0.1-1清洁和更新成分 乙醇 0-15湿润剂 甘油 0-5
山梨醇 0-5防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4收敛剂 植物提取物 1-5抗刺激剂 泛酰醇 0-1
尿囊素 0-0.2
植物提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂酶 0-5水 余量洗发香波成分 例子 ％表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 12-16
可可脂肪酸氨丙基二甲基甜菜碱 2-5
脂肪酸聚乙二醇酯 0-2泡沫促进剂 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5调节剂 季铵化羟乙基纤维素 0.4-1蛋白水解产物 0.2-1再脂化剂 乙氧基化羊毛脂醇 0.2-1添加剂 抗头皮屑剂 0-1防腐剂 5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷 0.1-0.3珠光剂 硬脂酸乙二醇酯 0-2染料 ＜0.1pH调节剂 酸/碱 0.1-1芳香剂 0.3-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5水 余量润发液(hair rinse)和毛发调节液成分 例子 ％ ％
润发液 毛发调节液表面活性剂 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-0.2 1.5-2.5
十六烷基三甲基氯化铵 0.5-1 -
二甲基苄基硬脂酰基氯化铵 - 0.5-1再脂化剂 十六烷基/十八烷基 0.5-1.5 1.5-2.5
单/二甘油酯稠度调节剂 脂肪醇 1-2.5 2.5-3.5增稠剂 甲基羟丙基纤维素 0.3-0.6 0.4-0.8调节剂 季铵化羟乙基纤维素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料 ＜0.1 ＜0.1pH调节剂 酸/碱 0.1-1 0.1-1芳香剂 0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水 余量 余量染发液成分 例子 ％组分1： 碱性染色膏表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 1-4
乙氧基化蓖麻油 1-2稠度调节剂 脂肪醇 8-10还原剂 亚硫酸钠 0.8-1.2缓冲液 氯化铵 0.5-1螯合剂 1-羟基乙烷-1,1-二膦酸 0.1-0.2碱性剂 氨 1.2-2氧化染料 显色剂 1偶联剂 1酶 漆酶 0-5水 余量组分Ⅱ： 过氧化氢分散体表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 0.5-1氧化剂 过氧化氢 6-9稳定剂 1-羟基乙烷-1,1-二膦酸 1-1.5增稠剂 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶 0-5水 余量剃须膏成分 例子 ％皂 棕榈酸/硬脂酸 30-40
氢氧化钾 5-7
氢氧化钠 1-2脂肪成分 椰子油 5-10
聚乙二醇 0-2稳定剂 四硼酸钠 0-0.5
硅酸钠 0-0.5
山梨醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水 余量剃须液成分 例子 ％消毒和酚酸(phonic acid) 乙醇 40-80再脂化剂 己二酸二正丁酯 1-2增溶剂 乙氧基化蓖麻油 0.5-1收敛剂 植物提取物 1-10抗刺激剂 泛酰醇 0-0.5
植物提取物 0-2稳定剂 甘油 0-5
山梨醇 0-5
丙二醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水 余量洗发香脂成分 例子 ％稠度调节剂 脂肪醇 4-5
乙氧基化羊毛脂醇 3-6矿脂 凡士林 45-52
支链石蜡 10-18抗氧化剂 2,6-双(1,1-二甲基乙基) 0.5-1
-4-甲基苯酚(BHT)芳香剂 0.2-0.4染料 0.1酶 脂酶 0-5软化剂 甘油 余量定型液(setting lotion)成分 例子 ％溶剂 异丙醇 12-20成膜成分 乙烯基吡咯烷酮/乙烯基乙酸酯共聚物 2-3.5软化剂 乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨基乙基异丁烯酸酯 0.2-1调节剂 蛋白水解物 0.2-0.5抗静电剂 十六烷基三甲基氯化铵 0.1-0.5乳化剂 乙氧基化蓖麻油 0.1-0.5芳香剂 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂酶 0-5水 余量洗涤剂公开
本发明的洗涤剂组合物可例如配制为包括洗衣添加剂组合物的手洗和机洗洗涤剂组合物，和适用于染色织物的预处理、洗涤添加织物柔软剂组合物，和用于常用家庭硬表面清洗操作和洗碟操作的组合物。
本发明的洗涤剂组合物含有本发明的缀合物和表面活性剂。另外，该组合物可任选地含有助洗剂、另一种酶、抑泡剂、柔软剂、脱色抑制剂和其它通常用于洗涤剂的组分，例如污垢悬浮剂、去污剂、荧光增白剂、耐磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂、和/或包封或非包封的香水。
根据本发明的洗涤剂组合物可以为液体、糊剂、凝胶、条状或颗粒形式。其pH值(在水溶液中的使用浓度下检测)将通常为中性或碱性，即在7-11的范围内。根据本发明的颗粒组合物也可为“压缩形式”，例如它们可具有比传统颗粒洗涤剂更高的密度，即为550-950克/升。本发明的酶缀合物或任选引入洗涤剂组合物的另一种酶一般以该组合物的0.00001-2重量％酶蛋白质的量引入洗涤剂组合物中，优选该组合物的0.0001-1重量％酶蛋白质，更优选该组合物的0.001-0.5重量％酶蛋白质，甚至更优选该组合物的0.01-0.2重量％酶蛋白质。表面活性剂体系
表面活性剂体系可包括非离子型的、阴离子型的、阳离子型的、两性和/或两性离子型的表面活性剂。该表面活性剂体系优选含有阴离子型表面活性剂或阴离子型和非离子型表面活性剂的组合，例如50-100％的阴离子型表面活性剂和0-50％的非离子型表面活性剂。洗衣洗涤剂组合物也可含有阳离子型的、两性、两性离子型和半极性表面活性剂，以及除上述以外的其它非离子型和/或阴离子型表面活性剂。
表面活性剂的用量一般为0.1-60重量％。表面活性剂的一些例子如下所述。非离子型表面活性剂
该表面活性剂包括烷基酚的聚氧化烯(例如聚氧乙烯)缩合物。烷基可在直链或支链中含有约6-12个碳原子。环氧乙烷的用量可以等于约2-25摩尔/每摩尔烷基酚的量。
该表面活性剂也包括伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物。脂族醇的烷基链可以是直链或支链，一般含有约8-22个碳原子。
另外，非离子表面活性剂也包括烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖及其混合物。最优选的是含有3-15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和含有2-10个乙氧基的C8-C18烷基酚乙氧基化物(优选平均C10)，及其混合物。
阴离子表面活性剂
合适的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化硫酸盐，它是式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或含有C10-C24烷基组分的羟烷基，优选C12-C20烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，典型地在约0.5-6之间，更优选约0.5-3,M是H或阳离子，其可以是例如金属阳离子(例如，钠、钾、锂、钙、镁等)，铵或取代的铵阳离子。在本发明中考虑烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代的铵阳离子的特定例子包括甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子，例如四甲基铵阳离子和二甲基哌啶鎓阳离子和衍生自烷基胺类例如乙基胺、二乙基胺、三乙基胺等的那些，及其混合物等。
其它合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，它是式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24烃基，优选含有C10-C20烷基组分的烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(例如，钠、钾、锂)，或铵或取代的铵。
其它阴离子表面活性剂包括皂盐类(包括例如，钠、钾、铵和取代的铵盐，例如单、二和三乙醇胺盐)，C8-C22伯或仲烷基磺酸盐，C8-C24烯烃磺酸盐，通过柠檬酸碱土金属盐的热解产物的磺化制得的磺化多羧酸。烷基苯磺酸盐是合适的，特别是线型(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基优选含有10-18个碳原子。
洗衣洗涤剂组合物典型地含有约1-40重量％、优选约3-20重量％的这种阴离子表面活性剂。助洗剂体系
根据本发明的组合物可另外含有助洗剂体系。任何传统的助洗剂体系适用于本发明，包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸，材料例如乙二胺四乙酸盐(EDTA)，金属离子螯合剂，例如氨基多磷酸盐。此处也可使用磷酸盐助洗剂。
合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合硅铝酸盐材料，更特别是水合合成沸石，例如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
清洗助洗剂盐类的用量通常占该组合物的5-80重量％。优选用于液体洗涤剂的助洗剂用量是5-30％。其它洗涤剂酶活性
除具有特定活性的本发明的缀合物之外，洗涤剂组合物可另外含有其它酶活性，例如也是如本发明所述的酶缀合物的形式，提供清洗性能和/或织物护理益处，例如蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、氧化酶(例如，漆酶)。
所考虑的酶的具体例子如上述酶活性”一节中所列。漂白剂
所述洗涤剂组合物(特别是在颗粒洗涤剂的情况下)也可含有漂白剂，例如有氧型漂白剂或卤素型漂白剂。有氧型漂白剂可以是过氧化氢释放剂，例如过硼酸盐(例如PB1或PB4)或过碳酸盐，或可以是例如过羧酸。粒径可为400-800微米。当存在时，有氧型漂白化合物的用量将典型地为约1-25％。
过氧化氢释放剂可与漂白活化剂组合使用，漂白活化剂例如四乙酰基亚乙基二胺(TAED)，壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS),3,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS)或戊酰基葡萄糖(PAG)。
卤素型漂白剂可以是例如次卤化物漂白剂，例如三氯异氰脲酸酯和N-氯和N-溴烷磺酰胺。这种材料通常的加量为最终产品的0.5-10重量％，优选1-5重量％。织物应用蛋白酶
蛋白酶可用于丝绸的脱胶和砂洗。脂酶
在织物精整期间可以用脂酶清除含疏水酯的脂类物质(例如，甘油三酯)(例如，参见WO93/13256,Novo Nordisk A/S)。氧化还原酶
在漂白清洗织物时，可以用过氧化氢酶清除过量的过氧化氢。糖酶
纤维素分解酶被广泛应用于精整粗斜棉布服装，以使织物的颜色密度发生局部变化(酶促“石洗”)。
还可将纤维素分解酶用于生物抛光工艺。生物抛光工艺是对纱线表面的一种特殊处理，它可以改善织物加工和外观方面的品质，而不会丧失织物的可湿性。可以用诸如披露于WO93/20278中的方法进行生物抛光。
在纺织织物的过程中，纱线要承受相当大的机械张力。为了防止其断裂，通常要涂以(上浆)胶质物质(浆料)以将其加强。最常见的上浆剂是天然或修饰形式的淀粉。只有在清除织物上的浆料之后(即脱浆)才可实现均匀而又持久的精整。优选用淀粉分解酶实现用含有淀粉或修饰淀粉的浆料上浆的织物的脱浆。食品和饲料
本发明的缀合酶或多肽可有利地用于生产食品和饲料。蛋白酶
小麦面粉中的谷蛋白是决定面粉被用于焙烤食品中的能力的关键成分。为了改变面团的谷蛋白相，有时需要蛋白水解酶，例如，用蛋白酶将硬质小麦面粉软化。
Neutrase是一种市售中性金属蛋白酶，可使用其以确保均匀的面团质量和面包质地，并改善风味。将谷蛋白适度地或更彻底地降解成肽，因此，为了避免面团的过度软化，必须进行严格控制。
还可将蛋白酶用于对乳蛋白进行修饰。
在生产干酪时，为了让乳中的酪蛋白凝固，可以使用诸如粗制凝乳酶或凝乳酶的蛋白酶。
在酿酒业中，将蛋白酶用于以未发芽的谷物酿制并控制氮含量。
在动物饲料制品中，将蛋白酶用于扩大动物的消化系统。脂酶
将脂酶应用于焙烤业是相当新的事物。添加脂酶可以改善面团的特性，并改善面包生产质量，体现在具有较大的体积、改善的面包瓤结构和更白的面包瓤颜色。所观察到的效果可以由这样一种机制解释：其中，在面团混合过程中，脂酶改变了谷蛋白与某些脂质片段之间的相互作用。这样可以产生改善的谷蛋白结构。
属于某些意大利干酪类型的棕色(blue roan)干酪(如，Danablue)和其它含有乳脂肪的乳制品的风味形成取决于乳脂肪被降解成游离的脂肪酸。可将脂酶用于产生这类制品的风味。
在油类和脂肪生产业中，脂酶被用于诸如降低不希望的副产品的目的，以便通过酯交换对脂肪进行修饰，并合成酯。氧化还原酶
另外，本发明具有减弱的变应原性的氧化还原酶可用于生产食品和饲料。
适用于焙烤的几种氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、脂肪氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及其组合。通常，面包师是通过添加抗坏血酸和溴酸钾加强谷蛋白。可将某些氧化还原酶用于替代面团系统中的溴酸盐，方法是通过氧化谷蛋白中的自由硫羟基。从而形成二硫键，导致更强的、具有更大抗性的更有弹性的面团的形成。
Gluzyme(Novo Nordisk A/S)是具有过氧化氢酶活性的葡萄糖氧化酶制剂，可将其用于替代溴酸盐。面团筋力是通过更大的抗机械冲击力、更好的烘烤膨胀性和更大的面包体积等指标来衡量的。糖酶
面粉中淀粉酶含量的不同可导致焙烤质量的差异。为了使面粉统一，必须加入淀粉酶。淀粉酶和戊聚糖酶通常可提供用于酵母发酵的糖，改善面包体积，延缓老化，降低变陈速度和由戊聚糖胶形成的粘度。下面将给出糖酶的例子。
某些生麦淀粉酶(maltogenic amylase)可用于将面包的保质期延长2天或更长的时间，而不会导致产品的粘性。通过从淀粉分子、低分子量糖和糊精的非还原端裂解，对糊化淀粉进行选择性修饰。以这种方式修饰的淀粉，使发生老化作用的可能性较小。所产生的低分子量糖类可以改善焙烤食品的保水力，而不会产生可导致成品中的胶粘性的中等长度糊精。在面包焙烤期间所述酶被失活，因此，该酶可被视为不必在标签上标注的操作助剂。几乎可以排除Novamyl的过量。
用真菌α-淀粉酶可以改善面包体积，它可以进一步改善面包瓤良好而均匀的结构。所述α-淀粉酶是能产生麦芽糖、糊精和葡萄糖的内切酶。高于淀粉糊化温度的温度会使谷类和某些细菌α-淀粉酶失活，因此，在加入小麦面团中时它可导致较小的面包体积和粘性面包内部。Fungamyl具有不耐热的优点，并在刚好低于糊化温度时失活。
含有若干种戊聚糖酶(pentosanase)和半纤维素酶活性的酶制剂可以改善面团的加工和稳定性，并改善其新鲜度，面包瓤结构和面包体积。
通过水解面粉中的戊聚糖级分，可使其失去大部分水结合力，这部分水便可以供淀粉和谷蛋白使用。所述谷蛋白变得更有柔性和可延伸性，并使所述淀粉变得更易于糊化。可将戊聚糖酶与乳化剂组合使用或替代乳化剂。
另外，糖酶可用于由淀粉生产糖浆，所述糖浆被广泛用于软饮料、甜食、肉制品、乳制品、面包类产品、冰淇淋、婴儿食品、果酱等。
淀粉的转化通常是分三步进行的。
首先，用α-淀粉酶使淀粉液化。获得主要由寡糖和糊精构成的麦芽糖糊精。
然后用淀粉葡糖苷酶处理所述混合物，以便将所述寡糖和糊精水解成葡萄糖。这样可以得到增甜食品。如果需要高麦芽糖糖浆，可以单独使用β-淀粉酶或与支链淀粉酶(脱支酶)一起使用。
通过将葡萄糖混合物异构化成果糖可以使葡萄糖混合物变得更甜。因此，可使用固定化的葡萄糖异构酶。
在制糖工业中，加速蔗汁中淀粉的分解是常用的措施。由此降低粗糖中淀粉的含量，并有利于在精糖厂进行的过滤。
另外，可将葡聚糖酶用于分解粗糖汁和糖浆中的葡聚糖。
在制醇工业中，α-淀粉酶适用于稀释蒸馏的发酵液中的淀粉。
在酿酒工业中，将α-淀粉酶用于促进液化。
在乳品工业中，可将β-半乳糖苷酶(乳糖酶)用于生产低乳糖乳，以供患有乳糖吸收障碍的患者使用。
当用经乳糖酶处理过的乳生产风味奶制饮料时，可以减少糖的添加量，但不会降低该制品的甜度。
在生产炼乳时，通过乳糖酶处理可避免乳糖结晶化，并因此而降低因乳糖结晶中酪蛋白凝固而造成的稠化的危险。
在用经乳糖酶处理过的乳(或乳清)生产冰淇淋时，不会产生乳糖结晶，而且不会出现缺陷、砂粒。
另外，正如在WO94/21785(Novo Nordisk A/S)中所披露的。已知木聚糖酶可用于若干食品/饲料工业目的。
将α-淀粉酶用于动物饲料工业，将其加至含有谷物的饲料中，改善淀粉的可消化性。抗微生物多肽
在肉类加工业中，可将某些细菌分解酶用于诸如清洗胴体的目的(参见美国专利US5,354,681,Novo Industri A/S)。转移酶
本发明的具有减弱的变应原性的转谷氨酰胺酶适用于生产食品和饲料。
转谷氨酰胺酶具有交联蛋白质的能力。
可将上述特性用于含有蛋白质的水相的胶凝。可将其用于生产涂抹食品(Novo Nordisk A/S的WO96/08156)。
可将转谷氨酰胺酶用于改善面粉的烘烤品质，例如，通过对小麦面粉进行修饰将其用于制成具有改进的特性的饼，如改善的风味、口劲、口感和较大的体积(参见JP1-110147)。
另外，可用于生产糊类食品材料，用于食品(诸如冰淇淋、糕点表面装饰物(toppings)、冷冻甜食、蛋黄酱和低脂肪涂抹食品)中的脂肪替代物(参见WO93/22930,Novo Nordisk A/S)。
另外，可以由乳和乳类制品制成用于酸牛乳、木斯、干酪、布丁、橙汁的凝胶，并与碎肉末结合，改善食品蛋白的口味和结构(参见WO94/21120和WO94/21129,Novo,Nordisk A/S)。肌醇六磷酸酶
本发明的肌醇六磷酸酶适用于生产食品，如早餐谷物食品、饼、甜食、饮料、面包或汤等，以及动物饲料。
肌醇六磷酸酶可用于利用植物蛋白源中所存在的肌醇六磷酸酯/肌醇六磷酸中所结合的磷，或用于利用结合于肌醇六磷酸复合物中的重要营养价值的矿物质。
可将微生物的肌醇六磷酸酶加入单胃动物的饲料中，以免为其饲料添加无机磷(参见US专利3,297,548)。
还可将肌醇六磷酸酶用于大豆加工。大豆粉可以含有高含量的抗营养因子肌醇六磷酸，它使得这种蛋白源不适用于婴儿食品、和鱼、牛犊和其它非反刍动物的饲料，因为肌醇六磷酸可以螯合其中所存在的必需矿物质(参见EP0420358)。
肌醇六磷酸酶同样可用于烘烤目的，通过烘烤分开的含有小麦面粉等和肌醇六磷酸酶的面团，可以制成具有较高质量的面包(参见JP-0-3076529-A)。
已知具有高肌醇六磷酸酶活性的日本酒曲(koji mold)可用于生产精制日本清酒(参见JP-0-6070749-A)。
在另一方面，本发明涉及本发明的修饰多肽用于减弱工业组合物的变应原性的用途和上述产品。材料和方法材料酶：
Neutrase：衍生自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶，Neutrase的序列如SEQ ID NO:6所示。
PD498：枯草菌素型蛋白酶，如WO93/24623所示。PD498的序列如SEQ ID NO:1和2所示。
枯草菌素DY：枯草菌素型蛋白酶，如从芽孢杆菌属的种之变体分离出的SEQ ID NO:3所示(Betzel等，(1993)，生物物理文献(Archives of Biophysics)，第302卷，2,p.499-502)。ELISA试剂：
辣根过氧化酶标记的猪抗兔-Ig(Dako,DK,P217，稀释1∶1000)
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀释1∶100)。小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀释1∶200)。
生物素-标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed03-9140；稀释1∶1000)。
生物素-标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体(Serotec MCA336B；稀释1∶2000)。
抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶，(Kirkegard & Perry14-30-00；稀释1∶1000)。缓冲液和溶液：
-PBS(pH7.2(1升))
NaCl 8.00克
KCl 0.20克
K2HPO4 1.04克
KH2PO4 0.32克
-洗涤缓冲液PBS,0.05％(体积/体积)Tween20
-封闭缓冲液PBS,2％(重量/体积)脱脂乳粉
-稀释缓冲液PBS,0.05％(体积/体积)Tween20,0.5％(重量/体积)脱脂乳粉
-柠檬酸盐缓冲液(0.1M,pH 5.0-5.2(1升))
柠檬酸钠 20.60克
柠檬酸 6.30克
-终止液(DMG-缓冲液)
-硼酸钠，borax(Sigma)
-3,3-二甲基戊二酸(Sigma)
-CaCl2(Sigma)-Tween20：聚氧乙烯失水山梨单月桂酸盐(Merck cat,822184)-N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)-光气(Fluka art.79380)-乳糖(Merck7656)-购自Sigma公司的PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物)-琥珀基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基N-酰苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma S-7388，分子量624.6克/摩尔。-mPEG(Fluka)着色底物OPD：邻-亚苯基二胺，(Kementec cat4260)试验动物
Brown Norway大鼠(购自Charles River,DE)设备
XCELⅡ(Novex)
ELISA读数器(UVmax，分子设备)
HPLC(Waters)
PFLC(Pharmacia)
Superdex-75色谱柱，购自Pharmacia,SW的Mono-Q,Mono-S
SLT：购自SLT实验设备公司的光学仪(Fotometer)
体积排阻色谱(Spherogel TSK-G2000 SW)
体积排阻色谱(Superdex 200,Pharmacia,SW)
Amicon Cell方法：Brown Norwav大鼠的气管内(IT)刺激
对于分子的IT给药，使用带有2 1/2”长金属针的一次性吸管。将针注入位于会厌下约1厘米处的大鼠气管中，注入0.1毫升分子溶液。
试验动物是10组Brown Norway大鼠(BN)。起始重量大于200克，结束时的重量约为450克。用于确定Brown Norway大鼠中IgE抗体的相对浓度的ELISA方法
用三层夹心ELISA方法确定特定IgE血清抗体的相对浓度。
1)用10毫克小鼠抗大鼠IgE缓冲液1(50微升/孔)涂覆ELISA板，并在4℃下培养过夜。
2)清空该板，并用封闭缓冲液在室温下对该板进行至少半小时的封闭(200微升/孔)。轻轻摇动，并用洗涤缓冲液洗涤该板3次。
3)用大鼠血清(50微升/孔)培养，开始时未稀释，然后用2倍稀释液稀释。在一些孔中仅仅加入缓冲液4(空白)。在室温下培养30分钟。轻轻摇动，并在洗涤缓冲液中洗涤该板3次。
4)将稀释缓冲液中的酶稀释至适当的蛋白质浓度。
将50微升/孔在室温下培养30分钟。轻轻摇动，并在洗涤缓冲液中洗涤该板3次。
5)稀释特定的多克隆抗酶抗血清血清(pIg)，以检测在稀释缓冲液中结合的抗体。将50微升/孔在室温下培养30分钟。轻轻摇动，并在洗涤缓冲液中洗涤该板3次。
6)在稀释缓冲液中稀释辣根过氧化物酶-缀合的抗-pIg-抗体。将50微升/孔在室温下培养30分钟。轻轻摇动，并在洗涤缓冲液中洗涤该板3次。
7)在底物缓冲液中混合0.6毫克ODP/毫升+0.4微升H2O2/毫升。恰好在使用之前制备该溶液。培养10分钟。50微升/孔。
8)为终止反应，加入50微升终止溶液/管。
9)以620纳米为参照，在492纳米处对该板读数。
计算数据，并由Lotus表示。分子量的确定
通过标准方法用4-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质的电泳分离(Novex)。通过银染色法检测蛋白质。用相对于Novex的Mark-12宽泛围分子量标准的迁移率测量分子量。蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析：
蛋白酶切断了肽和对硝基苯胺之间的键，在405纳米处给出可见的黄色吸收。
缓冲液：例如Britton和Robinson缓冲液，pH为8.3。
底物：将100毫克suc-AAPF-pNa溶解于1毫升二甲亚砜(DMSO)中。用Britton和Robinson缓冲液将100ml该溶液稀释成10毫升。
分析
将底物和蛋白酶溶液混合，监测在405纳米处的吸收，它是时间和ABS405纳米/分钟的函数。应该控制温度(20-50℃，取决于蛋白酶)。这是检测样品中的酶活性的方法。实施例实施例1用碳酸N-琥珀酰亚胺基酯活化聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900(50重量％乙二醇)
将购自ALDRICH的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900(50重量％乙二醇)溶解于甲苯中(5毫升/克聚合物)。在常压下蒸馏掉约20％，以共沸干燥反应剂。将该溶液冷却至20℃，并加入在甲苯中的光气(1.93M,7摩尔/摩尔聚合物)。然后于室温将该混合物搅拌过夜。真空除去溶剂和过量的光气，获得油状的中间体双(氯甲酸酯)。
加入甲苯(干燥的4毫升/克聚合物)以再次溶解油状物。加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.4摩尔/摩尔聚合物)，并用冰浴冷却该混合物。于0℃逐滴加入三乙胺(2.2摩尔/摩尔聚合物)。可观察到盐酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。然后于室温将该混合物搅拌过夜。用玻璃料(G5)过滤该混合物，以除去Et3N.HCl。减压蒸发滤液直至干燥状态，以生成97％(摩尔/摩尔)油状物。NMR显示大于90％的活化和小于8％(摩尔/摩尔)的未结合的NHS。聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900双(碳酸琥珀酰亚胺基酯)(50重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫兹)(CDCl3),δ:1.15bs(I=330,PPG中的-CH3),2.69s(I=1.7，未反应的NHS),2.83s(I=41琥珀酰亚胺)，3.41m(I=110,PPG中的CH-CH2),3.55m(I=220,PPG中的CH-CH2),3.61m(I=440，主峰)，4.46t(I=19,PEG中的CH2-O-CO-)。实施例2用碳酸N-琥珀酰亚胺基酯活化聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)2.900(约40重量％乙二醇)
将购自ALDRICH的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)2.900(约40重量％乙二醇)溶解于甲苯中(4.4毫升/克聚合物)。在常压下蒸馏掉约15％，以共沸干燥反应剂。将该溶液冷却至0℃，并加入在甲苯中的光气(1.93M,7摩尔/摩尔聚合物)。然后于室温将该混合物搅拌19小时。真空除去溶剂和过量的光气，并获得油状的中间体双(氯甲酸酯)。
加入甲苯(干燥的2.5毫升/克聚合物)以再次溶解油状物。室温下加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.4摩尔/摩尔聚合物)。逐滴加入三乙胺(2.2摩尔/摩尔聚合物)。可观察到盐酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。然后于室温将该混合物搅拌21小时。用玻璃料(G5)过滤该混合物，以除去不溶解的Et3N.HCl。减压蒸发滤液直至干燥状态，以生成96％(摩尔/摩尔)油状物。NMR显示大于70％的活化和小于26％(摩尔/摩尔)的未结合的NHS。聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)2.900双(碳酸琥珀酰亚胺基酯)(约40重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫兹，CDCl3),δ:1.15bs(I=1000，丙二醇中的-CH3),2.68s(I=10.6，未反应的NHS),2.84s(I=61.7，琥珀酰亚胺)，3.40m(I=318，丙二醇中的-CH-CH2),3.55m(I=668，丙二醇中的-CH-CH2-),3.61m(I=1022主峰，乙二醇中的-CH2-CH2-),4.46t(I=25.7,-CH2-O-CO-)。实施例3用碳酸N-琥珀酰亚胺基酯活化聚(乙二醇)-共聚-(丙二醇)单丁基醚970(约50重量％乙二醇)
将购自ALDRICH的聚(乙二醇)-共聚-(丙二醇)单丁基醚970(约50重量％乙二醇)溶解于甲苯中(4毫升/克聚合物)。在常压下蒸馏掉约25％，以共沸干燥反应剂。将该溶液冷却至0℃，并加入在甲苯中的光气(1.93M,5摩尔/摩尔聚合物)。然后于室温将该混合物搅拌21小时。真空除去溶剂和过量的光气，并获得油状的中间体氯甲酸酯。
加入甲苯(干燥的2毫升/克聚合物)以再次溶解油状物。于室温加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1.2摩尔/摩尔聚合物)。于0℃逐滴加入三乙胺(1.1摩尔/摩尔聚合物)。可观察到盐酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。于室温将该混合物搅拌过夜。然后用玻璃料(G5)过滤该混合物，以除去不溶解的Et3N.HCl。减压蒸发滤液直至干燥状态，以生成89％(摩尔/摩尔)油状物。NMR显示大于72％的活化和小于5％(摩尔/摩尔)的未结合的NHS。聚(乙二醇)-共聚-(丙二醇)单丁基醚970碳酸琥珀酰亚胺基酯(约50重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫兹，CDCl3),δ:0.91t(I=1000，丁基的-CH3),1.15bs(I=8744，丙二醇中的-CH3),1.39m(I=1320，丁基的CH3-CH2-CH2-),1.55m(I=656，丁基的-CH2-O-),2.68s(I=60.8，未反应的NHS),2.83s(I=963.2，琥珀酰亚胺)，3.40m(I=3059，丙二醇中的CH-CH2),3.55m(I=2678，丙二醇中的CH-CH2),3.61m(I=1764主峰，乙二醇中的-CH2-CH2-),4.46m(-CH2-O-CO-)。实施例4用共聚物和嵌段聚合物修饰的蛋白酶的变应原性潜力的评价
将各样品稀释成0.015毫克蛋白质/毫升，并等分为1.5毫升。将这些级分在使用前于-20℃保存。另外，将100微升的各级分在实验室冰箱中于-20℃在研究开始时、中途和结束时进行免疫化学分析。对每次免疫和每次分析使用新的级分。
用100微升上述蛋白质稀释液进行20次气管内免疫。这样，第1组为未修饰的PD498，第2组为PD498-EO50PO50970，第3组为未修饰的枯草菌素DY(CDJ31)，第4组为枯草菌素DY(CDJ31)-EO50PO50970，第5组为枯草菌素DY(CDJ31)-EO40PO602900，第6组为Neutrase，第7组为Neutrase-EO50PO50970。各组包括10只大鼠。对照大鼠接受100微升0.9％NaCl。每2次免疫后一星期从眼睛中收集血样(2毫升)。通过血凝集获得血清，并离心。
特定IgE水平通过ELISA方法测定。图中显示，与未修饰的酶相比，修饰酶的IgE反应减弱。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>多肽-聚合物缀合物<130>seq<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>840<212>DNA<213>芽孢杆菌属的种PD498<400>1tggtcaccga atgaccctta ctattctgct taccagtatg gaccacaaaa cacctcaacc 60cctgctgcct gggatgtaac ccgtggaagc agcactcaaa cggtggcggt ccttgattcc 120ggagtggatt ataaccaccc tgatcttgca agaaaagtaa taaaagggta cgactttatc 180gacagggaca ataacccaat ggatcttaac ggacatggta cccatgttgc cggtactgtt 240gctgctgata cgaacaatgg aattggcgta gccggtatgg caccagatac gaagatcctt 300gccgtacggg tccttgatgc caatggaagt ggctcacttg acagcattgc ctcaggtatc 360cgctatgctg ctgatcaagg ggcaaaggta ctcaacctct cccttggttg cgaatgcaac 420tccacaactc ttaagagtgc cgtcgactat gcatggaaca aaggagctgt agtcgttgct 480gctgcaggga atgacaatgt atcccgtaca ttccaaccag cttcttaccc taatgccatt 540gcagtaggtg ccattgactc caatgatcga aaagcatcat tctccaatta cggaacgtgg 600gtggatgtca ctgctccagg tgtgaacata gcatcaaccg ttccgaataa tggctactcc 660tacatgtctg gtacgtccat ggcatcccct cacgtggccg gtttggctgc tttgttggca 720agtcaaggta agaataacgt acaaatccgc caggccattg agcaaaccgc cgataagatc 780tctggcactg gaacaaactt caagtatggt aaaatcaact caaacaaagc tgtaagatac 840<210>2<211>280<212>PRT<213>芽孢杆菌属的种PD498<400>2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln 1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr
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130 135 140Met Thr His Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn145 150 155 160Gln Pro Gly Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe
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290 295 300