3-(氨基-或氨基烷基)吡啶酮衍生物 和它们在HIV相关疾病治疗中的用途 本发明涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶的3-(氨基-或氨基烷基)吡啶酮衍生物。
进而涉及这类化合物用于治疗HIV相关疾病的用途。
进而，本发明涉及这些化合物的制备方法。
已知有些嘧啶酮和吡啶酮衍生物抑制HIV逆转录酶。
特别是，来自1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)胸腺嘧啶(HEPT)的衍生物的HIV1逆转录酶抑制性质是为人所熟知的。
欧洲专利申请EP-0 462 800(Merck and Company Inc.)公开了3位被芳基或杂环基取代的吡啶酮，它们通过一条链连接到吡啶酮环上。
不幸的是，存在耐受这些化合物的毒株。因此，它们在临床治疗中的应用是值得怀疑的。
4-芳基-硫代-吡啶酮最近已经被DOLLE等人公开(1995，《医药化学杂志》(J.Med.Chem.)38，4679-4686)，见于相应的PCT专利申请WO 97/05113。
不过，它们的活性仍然是中等的，它们在人疗法中的应用也可能导致耐药毒株的出现。
其中所公开的活性最高的硫代吡啶酮对奈韦拉平耐药性毒株的病毒倍增50％抑制浓度(IC50)约为260nM。
本发明人已经发现一类新颖地吡啶酮衍生物，显示出较好的HIV抑制性质。
他们还发现了得到这些化合物的新方法。
本发明涉及具有下列通式Ⅰ的化合物，
其中
-Q代表-NR1R2或-R0NR1R2，其中：
*R0代表C1-6亚烷基；
*R1和R2各自独立地代表C1-6烷基或C3-6烯基；所述C1-6烷基和C3-6烯基可以被一个、两个或三个选自羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、芳氧基、芳硫基、氨基、单-或二(C1-4烷基)氨基和芳基的取代基取代；或者
*R1和R2共同可以形成一个二价基-R1-R2-，其中-R1-R2-代表-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)2-NR7-(CH2)2、
-(CH2)2-CH(NHR7)-(CH2)2-或-(CH2)n，其中R7代表氢或C1-4烷基，n代表2、3、4、5或6；
-R3代表芳基或者单环或二环杂环，选自吡啶基、嘧啶基、噻唑啉基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基；所述单环或二环杂环可以可选地被一个、两个或三个各自独立地选自羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代、三氟甲基、二亚甲氧基或苯基的取代基取代；
-R4和R5各自独立地代表氢、C1-6烷基、C3-6烯基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基，C1-4烷基、氨基、单-或二(C1-4烷基)氨基、甲酰基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基或C1-4烷基氨基羰基；其中C1-6烷基和C3-6烯基可以被一个、两个或三个选自羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、芳氧基、芳硫基、氨基、单-或二(C1-4烷基)氨基和芳基的取代基取代；或者
-R4和R5共同形成一个式-R4-R5-的二价基，其中-R4-R5-代表-CH=CH-CH=CH-或-(CH2)t-，其中t代表3或4；
-R6代表氢、羟基、C1-4烷氧基、C1-6烷基、C3-6烯基、芳基、C1-4烷基、氨基、单-或二(C1-4烷基)氨基或烷基芳基；
-Y代表O或S；
-X代表下式原子团：
-(CH2)p-
-(CH2)q-Z-(CH2)r-或-CO-
其中p代表1、2、3、4或5；
q代表0、1、2、3、4或5；
r代表0、1、2或3；
-Z代表NR8、C(=O)、CHOH、CHNR8R9；CF2、O、S或CH=CH；其中R8和R9各自独立地代表氢或C1-4烷基；
或其N-氧化物、立体化学上的异构形式或药学上可接受的加成盐。
关于上文和下文所用的定义，卤代定义氟代、氯代、溴代和碘代；C1-4烷基定义具有1至4个碳原子的直链和支链饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基等；C1-6烷基包括C1-4烷基，和其含有5至6个碳原子的高级同系物，例如戊基、己基等；C3-6烯基定义含有一条双键并具有3至6个碳原子的直链或支链烃基，例如2-丙烯基、3-丁烯基、2-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；所述C3-6烯基的与氮原子连接的碳原子优选是饱和的；C1-6亚烷基定义具有1至6个碳原子的二价直链和支链饱和烃基，例如亚甲基、1,2-亚乙基、1,3-亚丙基、1,4-亚丁基、1,5-亚戊基、1,6-亚己基等。术语“C(=O)”指羰基。芳基是苯基或者被一个、两个或三个选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代和三氟甲基的取代基取代的苯基。
优选的根据本发明的化合物是其中X代表-CH2-或C(=O)且R3代表被两个甲基取代的苯基的那些，最优选的化合物是其中R3代表在每个间位被两个甲基取代的苯基的那些。
优选地，在根据本发明的化合物中，R1和R2各自代表甲基，R4代表乙基，R5代表甲基和/或R6代表氢原子。
最优选的本发明化合物是3-二甲氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮。
通过流程1中代表的一般方法，可以得到其中X是-CH2-、R3代表可选被取代的苯基、Y代表O且R6代表氢原子的化合物。
该第一种方法包括下列步骤：
a)使2位被烷氧基取代且3位被酰氨基烷基取代的吡啶(2)与C1-C6烷基锂反应，生成所述吡啶的锂化衍生物(3)，
b)使锂化衍生物(3)与由Cu I和二甲硫形成的配合物反应，将其转化为有机铜试剂，
c)使有机铜试剂与可选被取代的苄基卤反应，得到吡啶酮(4)，
d)水解被保护的吡啶酮(4)，得到去保护的吡啶酮(5)，
e)取代吡啶酮(5)的3-胺基，得到吡啶酮(6)。
该第一种方法总结在下列反应流程Ⅰ中：
反应流程Ⅰ
该方法中，R10和R11独立地代表C1-C6烷基。在优选的实施方式中，R10是甲基，R11是叔丁基。
与吡啶(2)反应的C1-C6烷基锂可以是正丁基锂。
用在步骤c)中的可选被取代的苄基卤优选为苄基溴。
被保护的吡啶酮(4)水解而去保护的有利方法是向吡啶酮(4)中加入氢氯酸并使混合物回流。
在优选的实施方式中，在步骤(d)中去保护的吡啶酮环3位氨基通过烷基化作用、通过Eschweiler-Clarke反应被取代。
通过类似方法可以得到其中X代表-(CH2)q-Z-(CH2)r-、Y代表O、R3代表可选被取代的苯基且R6是氢原子的化合物。
通过第二种方法可以得到其中X代表C(=O)或-CH2-、Y代表O、R3代表可选被取代的苯基且R6是氢原子的化合物。
该第二种方法中，使锂化衍生物(3)与可选被取代的苯甲醛反应，生成式(7)中间体。
中间体(7)氧化为中间体(8)。
中间体(8)然后通过水解去保护，如同第一种方法，生成通式Ⅰ的吡啶酮(9)。
该第二种方法总结在下列反应流程Ⅱ中。
反应流程Ⅱ
优选地，中间体(7)的氧化作用是在二氧化锰的存在下进行的。
中间体(7)也可以转化为相应的酯(10)，其中R12代表C1-C4烷基，酯的氢解以更高的产率提供吡啶酮(4)。优选地，其中R12是CH3的酯(10)是将中间体(7)用乙酸酐处理而制备的。随后在氢气氛下和在一种催化剂、尤其是30％披钯木炭的存在下进行氢解。该方法总结在反应流程Ⅲ中。
反应流程Ⅲ
本领域技术人员利用这些方法，并作适当调整，可以得到其他通式Ⅰ化合物，其中X是(CH2)p或(CH2)q-Z-(CH2)r或C(=O)，R3不是苯基，R6不是氢。
其中X是S的根据本发明的化合物可以通过DOLLE等人的文章(1995，出处同上)或相应的专利申请WO 97/05113中所述方法得到，其内容包括在本申请中。
化合物也可以通过其他本领域技术人员已知的方法得到。
本发明进而涉及上文所公开的方法的中间体。特别是涉及式(3)的锂化衍生物。
本发明化合物可用于抑制HIV逆转录酶、特别是HIV-1逆转录酶，以及预防或治疗由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的感染和HIV相关疾病、如AIDS。
为此，本发明化合物可以口服、肠胃外(包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注工艺)、吸入喷雾或直肠给药，所用剂量单位制剂含有药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。
因此，本发明的另一个目的是用于治疗HIV相关疾病、HIV感染、特别是AIDS的方法和药物组合物。
本发明也涉及这些组合物作为药物的用途和在药物制备中的用途，该药物用于HIV相关疾病、HIV感染、特别是AIDS的治疗。
这些药物组合物可以是可口服给药的悬浮液或片剂、鼻用喷雾剂、无菌可注射制剂或栓剂的形式。
下列实施例非限制性地阐述本发明。
实施例：
实施例1
3-二甲氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮的制备
1)5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶
该化合物已如DOLLE等人所示(1997，《四面体》(Tetrahedron)53(37),12.505-12.524)制备。该文章的内容引用在此作为参考。
将如HOFFMAN等人所示(1993，《医药化学杂志》36,953-966)得到的3.68g 3-氨基-5-乙基-2-甲氧基-6-甲基吡啶(22.14mmol)溶于二氯甲烷(260ml)与三乙胺(3.39ml)的混合物。混合物在0℃下冷却，滴加3.00ml三甲基乙酰氯。溶液在0℃下搅拌15分钟，然后用100ml水洗涤。含水层用3×200ml二氯甲烷萃取。合并后的有机层经硫酸镁干燥，减压浓缩。残余物用柱色谱法纯化，洗脱剂为二氯甲烷，得到5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶(5.31g,96％)。C14H22N2O2的元素分析计算值为C,67.17；H,8.86；N,11.19；O,12.78；实测值为C,67.11；H,8.56；N,10.91；O,12.67。
2)4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶
ⅰ)通过5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶的锂化作用：
在五氧化二磷的存在下，将5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶和3,5-二甲基苄基溴在室温真空下干燥24小时。在五氧化二磷的存在下，将碘化铜(CuII)在50℃真空下干燥24小时。将5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶(1.06g)和新近蒸馏的四甲基乙二胺(TMEDA)(2.24ml)溶于无水四氢呋喃(THF)(26ml)，混合物在-78℃氮气氛下冷却。滴加正丁基锂(1.6M己烷溶液，9.26ml)。混合物在0℃下搅拌1小时。
在-78℃、N2气氛下，向碘化铜(2.82g)的无水THF(52ml)悬浮液中加入二甲硫(14ml)，制得CuII：二甲硫配合物，然后在-78℃下滴加到上述混合物中。混合物在0℃下搅拌30分钟，再次在-78℃下冷却，加入3,5-二甲基苄基溴(3.81g)的THF(4ml)溶液。所得混合物在0℃下搅拌3小时，在室温下搅拌12小时。加入16ml水和20ml28％氢氧化铵水溶液。含水层用3×80ml乙醚萃取。合并后的有机层用40ml盐水洗涤，经硫酸镁干燥，减压浓缩。残余物用柱色谱法纯化，洗脱剂为环己烷-乙酸乙酯(1∶0至8∶2)，得到4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶(577mg,37％)mp138-139℃。
ⅱ)通过(±)-(5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶-4-基)-(3,5-二甲基苯基)甲基乙酸酯的氢解作用：
(+,-)(5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶-4-基)-(3,5-二甲基苯基)甲基乙酸酯
将8.34g如下所述制备的(+,-)-(3,5-二甲基苯基)-(5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶-4-基)甲醇溶于吡啶(200ml)，加入到乙酸酐(10.24ml)中，溶液在室温下搅拌1.5小时，在60℃下搅拌60小时。另加入10.24ml乙酸酐(108.51mmol)，继续在60℃下加热24小时。减压蒸发吡啶，将残余物溶于500ml乙酸乙酯。有机层用170ml碳酸氢钠饱和水溶液、170ml水和170ml盐水洗涤，经硫酸镁干燥，蒸发溶剂。残余物用柱色谱法纯化，使用二氯甲烷-乙醇(1∶0至95∶5)，得到标题化合物(8.78g,95％)mp 70-71℃。
将该化合物(850mg)与Pd-C(30％,850mg)在乙酸-水-二噁烷(42.5ml,2∶1∶2,v/v/v)中的混合物在室温10atm氢气下搅拌24小时。过滤除去催化剂，用乙醇洗涤。减压蒸发合并后的滤液的溶剂，得到4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶(726mg,99％)，与实施例1.2.i)中制备的化合物相同。
3)3-氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮
向4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-2-甲氧基-6-甲基-3-新戊酰氨基吡啶(2.36g)的水(300ml)悬浮液中加入3M氢氯酸水溶液(150ml)。混合物回流3.5小时，然后在室温下搅拌12小时。向溶液中加入浓氢氧化铵进行碱化，用3×800ml乙酸乙酯萃取。合并后的有机层用110ml盐水洗涤，经硫酸镁干燥，减压浓缩，得到3-氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮(1.79g,100％)。mp 204-205℃。
4)3-二甲氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮
向搅拌着的3-氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮(200mg)与37％含水甲醛(0.60ml)的5ml乙腈溶液中加入139mg氰基硼氢化钠。滴加冰醋酸(0.07ml)，反应混合物在室温下搅拌2小时。另加入0.07ml冰醋酸，继续搅拌30分钟。蒸发溶剂，向所得残余物中加入15ml乙醚。有机层用3×30ml 1N氢氧化钾水溶液和3ml盐水洗涤，经硫酸镁干燥，减压浓缩，得到3-二甲氨基-4-(3,5-二甲基苄基)-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮(200mg,91％)mp 229-230℃。
实施例2：1)根据实施例1的化合物的生物学活性
1．材料和方法
如WO 97/05113所述评价抗病毒活性、重组HIV-RT酶的表达与纯化、逆转录酶活性和RT的抑制作用。
如下所述测量杀逆转录病毒作用和逆转录。
1.1．杀逆转录病毒作用
将长期被HIV-ILai分离物感染的MT4细胞和H9细胞共同培养，得到HIV-1病毒悬浮液。将200μl含有病毒颗粒(HIV-ILai:100TCID50)的细胞上清液在室温下用各种浓度的不同抑制剂培养。3小时后，在5000g下，将病毒颗粒在1.5ml Vectaspin试管(Whatman)中通过0.02μm anopore膜洗涤。向病毒浓缩液补充500μl RPMI培养基后，再洗涤三次，每次条件同上。然后，将病毒浓缩液用RPMI加10％胎牛血清(FCS)重新调整至最初体积。如CHARNEAU等人所述(1994，《分子生物学杂志》241,651-662)测定对P4细胞的残留感染性。简单来说，将P4细胞用100μl DMEM培养基加10％FCS铺在96孔板中，浓度为20×105个细胞/ml。在37℃下培养过夜后，弃去上清液，加入病毒制剂(200μl)。一天后，将孔在PBS中洗涤三次。每孔补充200μl反应缓冲液，缓冲液含有50mM Tris-HCl pH8.5、100mM 2-巯基乙醇、0.05％Triton X-100和5mM 4-甲基伞形酰β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)。在37℃下3小时后，在荧光微板读数器中测量反应水平。
1.2)逆转录
含有pSP64内的50-997 HIV-1核苷酸片段(MAL株)的质粒pAY64在噬菌体T7启动子的控制下，该质粒获赠于J.L.DARLIX博士(INSERM-Lyon,France)。使用大肠埃希氏菌HB 101 recA-用于质粒扩增。该克隆用PstⅠ消化并用T7 RNA聚合酶体外转录后，得到从MAL序列+50位开始的HIV-1基因组RNA片段。如下用T7 RNA聚合酶进行体外转录。在100μl 40mM Tris-HCl pH8.0、8mM MgCl2、10mM亚精胺、25mM NaCl、10mM二硫苏糖醇、0.5mM每种核糖核苷三磷酸中，在20单位人胎盘核糖核酸酶抑制剂的存在下，将3μg线性化的质粒DNA用100单位T7 RNA聚合酶在37℃下转录2小时。用12单位无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理(37℃下10分钟)后，RNA转录物用1体积苯酚/氯仿/异戊醇(24∶24∶1)和用氯仿提取，在2.5体积乙醇和0.3M乙酸铵(pH 5.5)中沉淀。
在总体积为50μl的50mM Tris-HCl pH8.0、6mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇、12mM NaCl、150nM HIV-1 RNA和200nM与HIV-1 RNA的PBS互补的合成寡脱氧核苷酸引物(18-聚体ODN)或200nM tRNALys3中进行逆转录。当使用18-聚体ODN作为引物时，用模板和300nM RT在37℃下进行培养。30分钟后，加入10μCi[α-32P]dGTP(3000Ci/mmol)和0.1mM每种dNTP，在37℃下培养30分钟。使用tRNALys3作为引物时，使用相同的条件，但是对tRNA和DNA进行预杂交，方法是在90℃下加热2分钟，然后缓慢冷却。样品用苯酚-氯仿萃取，通过乙醇沉淀进行收集。在8％聚丙烯酰胺-TBE(90mM Tris pH8.3、90mM硼酸盐、2mM EDTA)-7M尿素凝胶上对反应产物进行分析。
结果
已经试验了根据实施例1的化合物对不同毒株的抗病毒活性。
对HIV-LAI野生型，该化合物显示下列活性：IC50=0.2nM；CC50＞105nM(S.I.＞33.333)。
对HIV-1奈韦拉平耐药性毒株，实施例1化合物的活性如下：
IC50＞104nM；
CC50＞104nM。
还已经试验了实施例1化合物对不同HIV毒株和原代细胞培养物的活性。表1阐述了该化合物对这些毒株的活性。
已经试验了根据实施例1的化合物的杀逆转录病毒作用。表2阐述了该化合物在不同剂量下的这种作用。
实施例1化合物抑制逆转录酶的IC50是20nM。
表1：实施例1化合物对不同HIV毒株和原代细胞培养物的抗HIV-1活性，IC50(nM)/CC50(nM) 化合物 HIV-1IIIIB/MT4 HIV-1 AZTres. /MT4 HIV-1 IIIB/PBMC HIV-2D 194 /PBMC HIV-1 Bal/Mono/巨噬细胞实施例12.4/＞1000 0.2/＞1000 0.58/＞1000 ＞1000 /＞1000 0.004 /＞1000
表2：实施例1化合物的感染性抑制作用 实施例1化合物的剂量 感染性的抑制％ 10nM 26％ 100nM 46％ 1μm 83％ 10μm 99％
实施例3：其他3-(氨基-或氨基烷基)吡啶酮衍生物和它们对两种不同HIV-1毒株的杀逆转录病毒活性
3.1化合物
已经合成了其它根据通式(Ⅰ)的化合物(化合物n°1-25、27-108、110-125、127-145和147-203)以及四种用于合成的中间体化合物(化合物n°26、109、126和146)，列在下表3中。
对每种举例的吡啶酮衍生物分别定义了各基团Y、Q和R3-R6的含义。
3.2杀逆转录病毒作用
列在表3中的各吡啶酮衍生物的杀逆转录病毒作用已经按照实施例2的教导进行了测定，但是对下列两种HIV-1毒株试验抗病毒作用：
a)HIV-1毒株IIIB(见实施例2)；
b)HIV-1毒株103N，它是在逆转录酶基因中具备点突变的突变型毒株，使该酶中最初的Lys-103残基被Asn残基代替。
HIV-1 103N毒株对逆转录酶抑制剂TIBO R82913表现出耐药性(BALZARINI J.等，1993，《病毒学》(Virology)192:246-253)。HIV-1 103N毒株也被SAHLBERG等人(1998，《抗病毒研究》(Antiviral Res.)37(3):ASS)和BALZARINI等人(1996，《抗微生物剂和化疗》(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)40(6):1454-1466)描述过。
结果以各化合物关于HIV-1毒株IIIB和103N每一个的pIC50(pIC50=-log IC50)表示。于是，化合物n°1关于HIV-1 IIIB的pIC50值为7,6999,IC50可以直接推断等于10-7,6999M。
如此高的杀逆转录病毒活性在以前使用现有技术的逆转录酶抑制剂时还没有观察到过。
因此，根据本发明的新颖的吡啶酮衍生物对HIV相关疾病、特别是对HIV-1相关疾病具有高治疗价值。
表3