蛋白质 【发明背景】
本发明涉及蛋白质。
具体地讲，本发明涉及存在于小麦面粉中的内源性内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂的分离和鉴定，及其对不同木聚糖酶的影响。本发明还涉及通过用所述抑制剂进行筛选所鉴定的木聚糖酶，并涉及由此而鉴定的新型木聚糖酶。背景技术
木聚糖酶被用于面包烘烤业已有若干年时间。
就此而言，已知小麦面粉含有源于胚乳细胞壁的阿糖基木聚糖。面粉中阿糖基木聚糖含量因为面粉的来源而不同-例如，参见Rouau等，谷类科学杂志(1994)19，259-272含有戊聚糖的酶制剂对面粉的面包生产质量的影响与戊聚糖特性的改变相关；Fincher和Stone，(1986)谷类技术进展，8卷(Why Pomeranz著)AACC，StPaul，明尼苏达，207-295；和Meuser和Suckow(1986)，烘烤化学和物理学(J.M.V.Blanchard，P J Frasier和T Gillard著)皇家化学协会，伦敦，42-61。通常，阿糖基木聚糖的含量可以在2-5％((w/w)以面粉的干重为基础)范围内波动。
据Fincher和Stone(1986)报导，胚乳细胞壁中的70％的多糖是阿糖基木聚糖。阿糖基木聚糖的一个特征是它能与水结合。阿糖基木聚糖的一部分是水不溶性的戊聚糖(WIP)，并且部分是水溶性的戊聚糖(WSP)。实验结果业已证实了高分子量(HMW)水溶性聚合物的WIP的降解，与面包体积之间的相关性。
在生产烘烤食品期间，已知使用适当剂量的木聚糖酶可以得到更稳定的面团系统(它通常包括盐、面粉、酵母和水)以及更好地发起的面包体积。
在这一方面，用于增加面包体积的好的木聚糖酶应当能溶解WIP，以便提高面团液体的粘性，而不会将WSP进一步降解成木糖寡聚体。据信WIP降解成低分子量(LMW)WSP会损害面团的性质并会产生粘性(Rouau等和McCleary(1986)国际生物大分子杂志，8，349-354)。
US-A-5306633披露了一种获自枯草芽孢杆菌菌株的木聚糖酶。很显然，这种木聚糖酶能改善含有这种酶的面包和烘烤食品地均匀性并增加其体积。
业已分离了源于枯草芽孢杆菌的另一种木聚糖酶并进行了测序。参见Paice，M.G.，Bourbonnais，R.，Desrochers，M.，Jurasek，L.和Yaguchi，M.源于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因：核苷酸序列以及与短小芽孢杆菌基因的比较。Arch.Microbiol.144，201-206(1986))。
现在，有时候会考虑到这样的问题，细菌木聚糖酶有可能产生很粘的面团。因此，人们通常预期枯草芽孢杆菌的木聚糖酶-如US-A-5306633中的木聚糖酶-能产生非常粘的面团。
能够产生粘性的现有的酶必须以小心控制的量使用，以便其粘性对操作性的负面影响不会达到损害有效的商业操作的程度。不过，小心控制剂量的必要性，阻止了在生产面团之前将木聚糖酶直接添加到面粉中。因此，对于现有系统来说，有必要在生产面团期间以高度受控制的方式添加木聚糖酶。
迄今为止，真菌木聚糖酶-直通常被用于食品烘烤。例如，J Maat等(木聚糖和木聚糖酶，J Visser等著，349-360，木聚糖酶及其在面包烘烤中的应用)披露了由黑曲霉(Aspergillus Nigervar.awarmor)菌株产生的β-1，4-木聚糖酶。根据该作者的介绍，所述真菌木聚糖酶能有效增加面包的比体积，而不会对面团的操作能力产生负面的副作用(面团的粘性)，正如用源于其他真菌或源于细菌的木聚糖酶所能观察到的结果那样。
W Debyser等(美国酿酒协会杂志55(4，153-156，1997，在糖化期间用小麦全粉佐剂溶解阿糖基木聚糖并抑制大麦麦芽糖木聚糖裂解系统：小麦中新型酶抑制剂的证据)认为，小麦中可能存在木聚糖酶抑制剂。没有分离到由W Debyser等所披露的抑制剂。另外，WDebyser等也没有披露所述抑制剂是内源性的或者是微生物的。另外，不存在有关该抑制剂的化学资料。
最近，X Rouau和A Surget也披露了木聚糖酶抑制剂在小麦面粉中的存在(谷类科学杂志28，(1998)63-70，戊聚糖酶抑制剂在小麦面粉中存在的证据)。与Debyser等相似，X Rouau和A Surget认为，他们证实了一种不耐热的化合物在小麦面粉的可溶性部分中的存在，它限制了所添加的戊聚糖酶的作用。同样与Debyser等相似，上述作者没有分离到一种抑制剂，并且不能够得出所述抑制剂是内源性的或是来源于微生物的结论。类似地，也不存在该抑制剂的化学资料。
因此，现有技术中一个公知的问题是，如何用不存在负面的操作特性的面团制备烘烤食品。更具体的问题是，如何提供一种非粘性的面团-即一种不会粘到会导致操作和加工问题的面团。
本发明试图提供上述问题的解决方案。本发明概述
本发明的有关方面在权利要求书和以下说明中提供。
简单地讲，本发明的某些方面涉及：
1.内源性内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂-包括编码它的核苷酸序列及其氨基酸序列，及其变体、同系物或片段。
2.测定β-1，4-木聚糖酶抑制剂对不同木聚糖酶的作用的测定方法。
3.测定面团中不同木聚糖酶的作用的测定方法。
4.测定葡聚糖酶对含有木聚糖酶的不同面团的作用的测定方法。
5.新型木聚糖酶-包括编码它的核苷酸序列及其氨基酸序列，及其变体、同系物或片段。
6.木聚糖酶的新用途。
7.用木聚糖酶制备的食品。
其他方面涉及本发明的氨基酸序列和/或本发明的核苷酸序列，包括：含有或能够表达本发明序列的结构；含有或能够表达本发明序列的载体；含有或能够表达本发明序列的质粒；含有或能够表达本发明序列的组织；含有或能够表达本发明序列的器官；含有或能够表达本发明序列的转化宿主；含有或能够表达本发明序列的转化生物。本发明还包括表达所述序列的方法，如在微生物中表达；包括转化所述序列的方法。
本发明与WO-A-98/49278的内容的不同之处特别在于，所述PCT专利申请包括有关其所披露的蛋白质抑制剂的很少的序列信息。
下面将在适当的部分标题下面对本发明的有关方面进行说明。为方便起见，本发明有关方面的一般性应用说明可以参考题为“一般定义”和“一般介绍”部分。不过，在每一部分下面的说明并不一定局限于每一个特定的部分。一般定义
本文所使用的“小麦面粉”一词是磨的很细的小麦粉的同义词。不过，该名词优选表示获自小麦本身的面粉而不是获自其他谷物。因此，除非另有说明，本文所提到的“小麦面粉”优选表示小麦面粉本身，并表示存在于一种介质，如面团中的小麦面粉。
本文所使用的术语“木聚糖酶”具有其普通含义-例如，特别是一种能够催化可能存在于小麦中的阿糖基木聚糖解聚的酶(例如，一种特别能够催化可能存在于小麦中的WIP溶解，并催化WSP解聚的酶)。
用于测定内切-β-1，4木聚糖酶活性的测定方法随后提供。为方便起见，该测定方法被称为“木聚糖酶测定”。
本发明所涉及的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、重组DNA(即：使用重组DNA技术制备的DNA)、合成DNA、和RNA-及其组合。
术语“核苷酸序列”优选表示DNA。
本发明的核苷酸序列可以是单链的或双链的。
本发明的核苷酸序列上可以包括合成的或修饰过的核苷酸。有多种不同类型的对寡核苷酸的修饰为本领域所公知。其中，包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端添加丫啶或多赖氨酸链。对本发明来说，可以这样理解，本文所披露的核苷酸序列可以通过本领域现有的任一种方法修饰。进行所述修饰可以是为了提高本发明核苷酸序列的体内活性或存活周期。
与本发明核苷酸序列和本发明氨基酸相关的术语“变体”或“同系物”是所述序列的等位变体的同义词。
具体地讲，本文所使用的术语“同源性”可能与术语“相同性”等同。在这里，与本发明核苷酸序列和本发明氨基酸相关的序列同源性可以通过将任一种或多种序列与其他序列进行简单的“肉眼”比较(即严格比较)来测定，以便了解其他序列与所述序列是否至少具有75％的相同性。相对序列同源性(即序列相同性)也可以通过商业化的计算机程序测定，该程序能计算两种或多种序列之间的百分同源性。所述计算机程序的一个典型例子是CLUSTAL。
因此，同源性比较可以用肉眼完成。不过，更常见的是，这种同源性比较是借助于很容易获得的序列比较程序完成的。所述商业化计算机程序可以计算两种或两种以上序列之间的百分同源性。
可以在连续的序列上计算百分同源性，即将一种序列与另一种序列进行排比，并将一种序列上的每一个氨基酸与另一个序列上的相应的氨基酸进行直接比较，每次比较一个残基，这被称为“无缺口”排比。通常，所述无缺口排比只能用于较短数量的残基(例如，低于50个连续氨基酸)。
尽管这是一种十分简单、并且可靠的方法，但它的不足之处在于，例如，在一对相同的序列上，一个插入或缺失将会导致随后的氨基酸残基被排出排比之外，因此，在进行总体排比时，很有可能导致百分同源性的大规模降低。因此，大多数序列比较方法被设计成能产生兼顾到可能的插入和缺失的最佳排比，而不会过分地破坏总的同源性等级。这一目的是通过在序列排比中插入“缺口”以便增加局部同源性而实现的。
不过，这些更复杂的方法为出现在所述排比中的每一个缺口规定了“缺口限度”，以便对于相同数量的相同氨基酸来说，一种序列排比具有尽可能少的缺口-表示在两种比较的序列之间具有较高的相关性-可以比具有多个缺口获得更高的得分。通常使用“Affine缺口代价”，它让缺口的存在承担较高的代价，而让该缺口中每一个后续残基承担较小的份额。这是最常用的缺口评分系统。高缺口份额理所当然地会产生具有较少缺口的优化排比。大多数排比程序可以对缺口份额进行改变。不过，在将所述软件用于序列比较时优选使用预设值。例如，在使用GCG Wisconsin Bestfit包(见下文)时，氨基酸序列的预设缺口额度为-一个缺口12和-每一个延长4。
因此，计算最大百分同源性首先产生考虑到缺口额度的最佳排比。用于进行所述排比的合适的计算机程序是GCG WisconsinBestfit包(Wisconsin大学，美国；Devereux等，1984，核酸研究12：387)。可以进行序列比较的其他软件的例子包括，但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999，同上-第18章)，FASTA(Atschul，1990，分子生物学杂志，403-410)和比较工具的GENEWORKS组件。BLAST和FASTA可用于脱机和联机检索(参见Ausubel等，1999，同上，7-58至7-60页)。不过，优选使用GCG Bestfit程序。
尽管最终的百分同源性可以以相同性形式衡量，所述排比过程本身通常不是基于有或无的成对比较。相反，通常使用一定程度的相似性得分基质，它根据化学相似性或进化距离为每一个成对的比较评分。常用的所述基质的例子是BLOSUM62基质-程序BLAST组件的预设基质。GCG Wisconsin程序通常使用公开的预设值或定制的符号比较表(如果提供了的话)(进一步的细节参见用户手册)。对于GCG包来说，优选使用公开的预设值，而对于其他软件来说，使用诸如BLOSUM62的预设基质。
一旦所述软件产生了最佳比较，就有可能计算出百分同源性，优选百分序列相同性。所述软件通常是作为序列比较的一部分实现这一目的的，并产生多种结果。
序列比较是使用由http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单的BLAST检索程序使用预设的参数进行的。
本发明还包括互补于本文所提供序列的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或衍生物。如果所述序列互补于其一个片段，则该序列可以用一种探针鉴定其他生物中的相似的编码序列等。
本发明还包括能够与本文所提供序列杂交的核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物。
本发明还包括能够与互补于本发明所提供序列的序列杂交的核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物。
术语“互补”还包括能够与所述编码序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
术语“变体”还包括互补于能够与本文所述提供的核苷酸序列杂交的序列的序列。
术语“变体”优选包括互补于能够在严格条件下(例如，65℃和0.1XSSC{1XSSC＝0.15M NaCl，0.015柠檬酸钠，pH7.0})与本发明所提供的核苷酸序列杂交的序列的序列。
本发明还涉及能够与本发明核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文所提供序列的互补序列)。
本发明还涉及互补于能够与本发明核苷酸序列(包括本文所提供序列的互补序列)杂交的序列的核苷酸序列。
本文所使用的术语“杂交”包括“一股核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”(Coombs J(1994)生物技术词典Stockton出版社，纽约)，以及在聚合酶链式反应技术中所进行的扩增过程，如Dieffenbach CW和GS Dveksler所述(1995，PCR引物，实验室手册，冷泉港出版社，Olainview NY)。
本发明的范围还包括能够在中等到最高严格性条件下与本文所提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。杂交条件基于核酸结合复合体的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel所述(1987，分子克隆技术指南，酶学方法，152卷，学术出版社，San Diego CA)，并给予特定的“严格性”，如下文所述。
最高严格性通常出现在大约Tm-5℃(低于探针Tm5℃)；高严格性出现在低于Tm大约5℃-10℃；中等严格性出现在低于Tm大约10℃-大约20℃；而低严格性出现在低于Tm大约20-25℃。正如本领域技术人员所了解的，最高严格性杂交可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交可用于鉴定或检测相似的或相关的多核苷酸序列。
在一个优选方面，本发明包括能够在严格条件(例如，65℃和0.1XSSC)下与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。内源内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂
一方面，本发明提供了一种获自小麦面粉的内源内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂。
在我们的研究中，我们业已发现这种抑制剂是一种二肽，分子量为大约40kDa(通过SDS或MS测定)，并且其pI为大约8-大约9.5。
在本发明的一个方面，所述抑制剂为分离形式和/或大体上纯化的形式。在本文中，术语“分离的”表示所述抑制剂不是处在其天然环境中。
迄今为止所进行的序列分析业已证实，所述抑制剂具有序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的至少一种或多种序列。
因此，本发明包括一种内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂，它包括序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示序列的至少一种或多种，或其变体、同系物或其片段。
与本发明抑制剂相关的术语“变体”、“同系物”或“片段”包括对所述序列进行一个(或多个)氨基酸的取代、改变、修饰、置换、缺失或添加的任一种，前提是所得到的氨基酸序列具有木聚糖酶抑制作用，优选至少具有与至少包括序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的一种或多种序列相同的活性。具体地讲，术语“同系物”包括结构和/或功能方面的同源性，其前提是所得到的抑制剂具有木聚糖酶抑制作用，优选至少具有与至少包括序列13、序列14、序列1 5、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的至少一种或多种序列相同的活性。就序列同源性而言(即序列相似性或序列相同性)，优选与序列表所示序列具有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％的同源性，更优选与所附序列表所示序列具有至少95％，更优选至少98％的同源性。
本发明抑制剂的变体的一种推测性例子具有序列1和序列2所示序列中的至少一种或多种。
本发明的抑制剂方面因为多种原因是有利的。
举例来说，通过了解内源内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂的化学性质，工作者可以测定该抑制剂在诸如小麦面粉中的含量。为方便起见，我们将该方法称作“抑制剂含量测定方法”。
所述抑制剂含量测定方法使得工作者能够筛选用于添加到小麦面粉中的一种或多种合适的木聚糖酶和/或筛选用于添加到小麦面粉中的合适量的一种或多种木聚糖酶。
因此，本发明提供了一种方法，包括：(a)测定小麦面粉中抑制剂的含量或类型；(b)筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶和/或筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)将合适的木聚糖酶和/或合适量的木聚糖酶添加到小麦面粉中。
本发明还提供了一种方法，包括：(a)测定小麦面粉中抑制剂的含量或类型；(b)筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶和/或筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)将合适的木聚糖酶抑制剂和/或合适量的木聚糖酶抑制剂添加到小麦面粉中。
本发明还提供了一种方法，包括：(a)测定小麦面粉中抑制剂的含量或类型；(b)筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶和/或筛选适于添加到小麦面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)将合适的木聚糖酶和合适的木聚糖酶抑制剂和/或合适量的木聚糖酶抑制剂添加到小麦面粉中。
抑制剂含量的检测可以用标准化学技术，如通过分析固态NMR光谱分析测定。抑制剂的含量甚至可以通过使用已知能受到该抑制剂的负面影响的木聚糖酶测定。在后一种情况下，可以采取小麦面粉的样品并将它添加到已知量的所述木聚糖酶中。在特定的时间点上可以测定木聚糖酶的活性，所得到的活性可能与小麦面粉中抑制剂的量相关。
因此，本发明还包括使用木聚糖酶及其抑制剂的组合来校正和/或测定小麦面粉样品中抑制剂的含量。
可将所述抑制剂的抗体用于筛选小麦面粉样品，以便证实本发明抑制剂的存在。所述抗体甚至可用于从小麦面粉样品中分离一定数量的抑制剂。用于测定β-1，4-木聚糖酶抑制剂对不同木聚糖酶的作用的测定方法
本发明的抑制剂具有另一种重要用途。
就此而言，所述抑制剂可用于测定/筛选，以便鉴定受该抑制剂影响的木聚糖酶。
例如，在某些场合下，可能需要筛选具有低耐受性-即不能耐受-所述抑制剂的木聚糖酶。
在一个方面，所述抑制剂可用于测定/筛选具有一般(中等)耐受性-即合理的耐受-所述抑制剂的木聚糖酶。
在一个方面，所述抑制剂可用于测定/筛选，以便鉴定对所述抑制剂具有高的耐受性的木聚糖酶。
用于测定本发明抑制剂的抑制程度的合适的方法将在下文提供。为方面起见，我们将称该方法为“抑制剂测定方法“。
因此，本发明提供了一种用于测定木聚糖酶对木聚糖酶抑制剂的耐受程度的方法，其中，该方法包括：(a)让感兴趣的木聚糖酶与所述抑制剂接触；和(b)测定该抑制剂是否能抑制所述感兴趣的木聚糖酶的活性。为方便起见，我们将该方法称为“抑制剂测定方法“。
在本文中，术语“耐受“表示木聚糖酶的活性没有受到所述抑制剂的全面抑制。换句话说，所述抑制剂可用于测定/筛选，以便鉴定不受该抑制剂的负面影响的木聚糖酶。
因此，与木聚糖酶和木聚糖酶抑制剂相关的术语“耐受程度“是所述木聚糖酶抑制剂对木聚糖酶活性的非抑制作用的程度的同义词。因此，对所述木聚糖抑制剂具有高度耐受性的木聚糖酶是与所述木聚糖酶抑制剂对木聚糖酶的高度的非抑制作用同类的。
本发明还包括一种方法，包括以下步骤：(a)实施所述抑制剂测定方法；(b)鉴定对所述抑制剂具有高(或中或低)度耐受性的一种或多种木聚糖酶；和(c)制备一定量的所述一种或多种鉴定的木聚糖酶。
然后可以将合适的鉴定的木聚糖酶用于制备食品，特别是用来生产烘烤食品的面团。
另外，通过鉴定对所述抑制剂具有一定程度耐受性的木聚糖酶(即不会像其他木聚糖酶那样受到抑制的木聚糖酶)，可以将较少的所鉴定的木聚糖酶添加到一种介质中，以便随后使用。所述木聚糖酶的最终用途可以包括食品制备、蛋白质和淀粉生产、造纸和纸浆加工等的任一种或多种。
因此，本发明还包括一种方法，包括以下步骤：(a)实施所述抑制剂测定方法；(b)鉴定对所述抑制剂具有高(或中或低)度耐受性的一种或多种木聚糖酶；和(c)制备含有所述鉴定的木聚糖酶的一种或多种的面团。
在进行与本发明相关的实验的过程中，我们惊奇地发现，细菌木聚糖酶能够耐受所述抑制剂，就是说其活性没有被完全破坏。在某些情况下，所述木聚糖酶表现出非常理想的对所述抑制剂的耐受性。测定面团中不同木聚糖酶作用的测定方法
当用所述抑制剂测定方法鉴定的某些合适的细菌木聚糖酶存在于一种面团混合物中时，我们惊奇地发现，该面团混合物不像含有真菌木聚糖酶的面团混合物那样粘。从现有技术角度考虑，以上结果完全是出人意料的。
因此，本发明提供了另外一种用于鉴定适用于制备烘烤食品的细菌木聚糖酶或其变体的方法，该方法包括：(a)将感兴趣的细菌木聚糖酶掺入面团混合物中；和(b)测定所得面团混合物的粘性；以便所述细菌木聚糖酶或其变体适用于制备烘烤食品，如果所得到的面团混合物的粘性低于含有真菌木聚糖酶的类似面团混合物的粘性的话。为方便起见，我们将该方法称为“粘性测定方法”。
因此，本发明还提供了一种方法，包括以下步骤：(a)实施所述粘性测定方法；(b)鉴定适用于制备烘烤食品的一种或多种木聚糖酶；(c)制备一定量的所述一种或多种鉴定的木聚糖酶。
适用于测定面团粘性的方法将在下面提供。为方便起见，我们将该方法称为“粘性方法”。根据本发明，不如含有真菌木聚糖酶的面团粘的含有本发明木聚糖酶的面团，有时可以被称为“非粘性面团”。
如果一种细菌木聚糖酶具有有利的特征-就是说它不会产生像含有真菌木聚糖酶的面团那样粘的面团-那么该木聚糖酶可被用于制备食品，如被用于制备烘烤食品的面团。
因此，本发明还提供了一种方法，包括以下步骤：(a)实施所述粘性测定方法；(b)鉴定适用于制备烘烤食品的一种或多种木聚糖酶；和(c)制备含有所述一种或多种鉴定的木聚糖酶的面团。用于测定葡聚糖酶对有可能含有木聚糖酶的面团的面团的特性的影响的测定方法
在进行与本发明相关的实验的过程中，我们还发现一定量的葡聚糖酶的存在对木聚糖酶具有负面影响。
因此，在一方面，在木聚糖酶制剂-如用于制备或提取木聚糖酶的介质中没有有害含量的葡聚糖酶是有利的。另外，在某些方面，在用于制备食品的介质中没有有害含量的葡聚糖酶是有利的，所述介质含有木聚糖酶。在本文中，术语“有害含量”表示存在一定量的葡聚糖酶，因而使得木聚糖酶的优点被葡聚糖酶的负面影响所掩盖。
因此，本发明提供了另一种用于鉴定适用于制备烘烤食品的木聚糖酶组合物(如木聚糖酶制剂)或制备木聚糖酶的介质或添加了木聚糖酶的介质的测定方法，该方法包括(a)提供一种含有感兴趣的木聚糖酶的组合物或用于制备木聚糖酶的介质或被添加了木聚糖酶的介质；和(b)测定所述组合物或介质中活性葡聚糖酶的存在；这样，如果在所述组合物或介质中存在至多为低水平的活性葡聚糖酶的话，该组合物或介质适用于制备烘烤食品。为方便起见，我们将该方法称为“葡聚糖酶测定方法”。
本发明还提供了一种方法，包括以下步骤：(a)实施葡聚糖酶测定方法；(b)鉴定适用于制备烘烤食品的一种或多种组合物或介质；(c)制备一定量的所述一种或多种鉴定的组合物或介质。
适用于测定葡聚糖酶活性的方法将在下面提供。为方便起见，我们将该方法称为“葡聚糖酶方法”。
如果所述组合物或介质表现出有利特征-就是说与木聚糖酶相关的有利效果没有因为有害量的葡聚糖酶的存在而受到完全掩盖-那么，该组合物或介质就可用于制备食品，优选被用于生产面包制品的面团。
因此，本发明还包括一种方法，包括以下步骤：(a)实施葡聚糖酶测定方法；(b)鉴定适用于制备烘烤食品的一种或多种鉴定的组合物或介质；(c)制备含有所述一种或多种鉴定的组合物或介质的面团。
因此，本发明包括木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶制剂基本上不含葡聚糖酶。
就此而言，所述木聚糖酶制剂可以从一种原始制剂中制备，该原始制剂中有可能存在的所有葡聚糖酶至少基本上被除去或者甚至其中的葡聚糖酶活性受到抑制或消除。用于达到这一目的的技术可以包括使用能够识别并结合葡聚糖酶的抗体，在这样做的时候，使得葡聚糖酶的活性失活。或者，可以将葡聚糖酶的专一性抗体结合在一种支持物上，以便当所述原始制剂通过所述结合的抗体时能够将葡聚糖酶从其中除去，从而形成一种基本上不含葡聚糖酶的木聚糖酶制剂。在另一种实施方案中，甚至是在其他的实施方案中，所述木聚糖酶制剂可以从具有极低或没有葡聚糖酶活性的宿主生物中制备。就此而言，可以使存在于该宿主生物中的葡聚糖酶的活性失活。在另一方面，可以使所述葡聚糖酶基因的表达沉默或剔除。用于实现这一目的的技术可以包括使用葡聚糖酶编码序列的反义序列。在另一种实施方案中，使用没有或至多具有很低葡聚糖酶表达的宿主生物。Ki测定
在某些场合下，测定木聚糖酶的Ki值(我们称之为“Ki测定”)可能是有用的。就此而言，我们业已发现，在某些场合下Ki值有时表示木聚糖酶对某些用途的合适度。对Ki值的了解本身可能是有用的。组合测定
本发明还包括本发明测定的适当组合。
就此而言，本发明包括一种组合方法，包括以下步骤的两个或两个以上：构成抑制剂含量测定方法的步骤；构成抑制剂测定方法的步骤；构成粘性测定方法的步骤；构成葡聚糖酶测定方法的步骤；构成Ki测定的步骤。在所述组合方法，所述步骤可以任何顺序出现，并且不一定同时或连续出现。新型木聚糖酶
如上文所述，本发明提供了一种用于鉴定可用于制备食品，特别是用于制备面包制品的面团的木聚糖酶的合适的测定方法。
就此而言，我们业已鉴定了三种适用于制备食品，特别是适用于制备烘烤食品的面团的新型木聚糖酶。
因此，本发明还包括含有序列7、序列9或序列11所示任一种氨基酸序列或其变体、同系物或片段的氨基酸序列。
与本发明木聚糖酶相关的术语“变体”、“同系物”、或“片段”可以包括对该序列进行的一个(或多个)氨基酸的取代、改变、修饰、置换、缺失或添加，其前提是所得到的氨基酸序列具有木聚糖酶活性，优选至少具有与含有序列7、序列9、或序列11所示氨基酸序列的任一种的序列相同的活性。
具体地讲，术语“同系物”包括结构和/或功能方面的同源性，所得到的蛋白具有木聚糖酶活性，优选至少具有与含有序列7、序列9、或序列11所示氨基酸序列的任一种的序列相同的活性。就序列同源性(即序列相似性或序列相同性)而言，与所附序列表所示序列的同源性优选至少为75％，更优选至少85％，更优选至少90％。与所附序列表中所示序列的同源性优选至少为95％，更优选至少98％。
所述木聚糖酶优选包括序列7或序列11所示序列，或其变体、同系物或片段。
本发明还包括编码本发明氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列优选选自：
(a)含有序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一种或其变体、同系物或片段的核苷酸序列；
(b)序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一种或其互补物；
(c)能够与序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一种或其片段杂交的核苷酸序列；和
(d)能够与序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一种或其片段的互补物杂交的核苷酸序列；和
(e)由于遗传密码的简并性作为(a)、(b)、(c)或(d)所定义的核苷酸的简并物的核苷酸序列。
与本发明核苷酸序列相关的术语“变体”、“同系物”或“片段”包括在该序列上取代、改变、修饰、置换、缺失或添加一个(或多个)核酸的任一种，只要所得到的核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有木聚糖活性即可，优选至少具有包括序列7、序列9或序列11所示任一种氨基酸序列的相同活性。具体地讲，术语“同系物”包括结构和/或功能方面的同源性，只要所得到的表达蛋白具有木聚糖活性即可，优选至少具有序列7、序列9或序列11所示任一种氨基酸序列的相同活性。就序列同源性(即序列相似性或序列相同性)而言，与所附序列表中序列8、序列10或序列12所示序列的同源性优选至少为75％，更优选至少85％，更优选至少90％。与所附序列表中所示序列的同源性更优选至少为95％，更优选至少为98％。
本发明的核苷酸序列优选包括序列8或序列12所示的序列或其变体、同系物或其片段。木聚糖酶的新型用途
如上文所述，本发明还提供了一种用于鉴定木聚糖酶的合适的测定方法，所述木聚糖酶可被用于制备非粘性面团(如本文所定义的)，以便用于制备烘烤食品。
就此而言，我们业已鉴定了某些木聚糖酶，包括已知的和新型的细菌木聚糖酶，这些酶适用于制备食品，特别是用于制备烘烤食品的面团。
因此，本发明包括非粘性面团(如本文所定义的)，该面团含有能通过本发明测定方法鉴定的木聚糖酶。所述木聚糖酶优选具有序列3、5、7、9、11中任一种所示的氨基酸序列，或其衍生物或同系物。更具体地讲，所述木聚糖酶具有序列5、7、9、11中任一种所示的氨基酸序列，或其变体、衍生物或同系物。
与现有系统相反，本发明提供了在生产面团之前将木聚糖酶直接添加到面粉中的可能性。因此，可以将面粉/木聚糖酶混合物的批料供应给面团生产者。另外，所述面团生产者不需要剂量设备就能获得便于操作的面团。用木聚糖酶制备的食品
本发明提供了一种鉴定适用于食品生产的木聚糖酶的方法。典型的食品(也包括动物饲料)包括乳制品、肉制品、禽制品、鱼制品和烘烤制品。
所述食品优选为烘烤食品。包括在本发明范围之内的典型的烘烤制品包括面包-如方面包、面包圈、小甜面包、意大利面包等-椒盐卷饼、玉米薄饼、蛋糕、曲奇饼、饼干、薄脆饼干等。一般介绍
在以下说明中所提到的“本发明的核苷酸序列”和“本发明的氨基酸序列”分别指本发明所提供的任一种或多种核苷酸序列和本发明所提供的任一种或多种氨基酸序列。氨基酸序列/多肽序列
术语“本发明的氨基酸序列”是术语“本发明的多肽序列”的同义词。在这里，所述氨基酸序列可以是木聚糖酶或木聚糖酶抑制剂的氨基酸序列。
本发明的多肽还包括本发明氨基酸序列及其变体的片段。合适片段的大小至少为5个，例如，至少10个、12个、15个或20个氨基酸。
还可以对本发明的多肽进行修饰，以便包括取代、缺失或插入，包括保守性取代在内的一种或多种(例如，至少2、3、5或10个)。
可以按下表进行保守性取代，表中表示的是保守性取代，其中，第2栏同一个方框中的氨基酸，优选第3栏同一行中的氨基酸可以彼此取代： 脂族 非极性 GAP ILV 极性-无电荷 CSTM NQ 极性-有电荷 DE KR 芳族 HFWY 其他 NQDE
本发明的多肽可以为大体上分离的形式。应当理解的是，所述多肽可以与载体或稀释剂混合，所述载体或稀释剂不会影响该多肽的预期用途，并仍然被视为大体上分离的。本发明的多肽还可以为大体上纯化的形式。在这种情况下它通常是指这样的多肽制剂：其中，有90％以上，例如，95、98％或99％的多肽是本发明的多肽。可以对本发明的多肽进行修饰，例如，通过添加组氨酸残基以便有利于其纯化，或通过添加信号序列以便促进其从细胞中分离，如下文所述。
本发明的多肽可以通过合成方法(例如，Geysen等所述，1996)或重组方法生产，如下文所述。
合适的宿主细胞-如酵母、真菌和植物宿主细胞-的使用可以在需要的时候进行如下翻译后修饰(例如，肉豆蔻酸化、糖基化、截短、lapidation和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，以便赋予本发明重组表达产物最佳的生物学活性。核苷酸序列/多核苷酸序列
术语“本发明的核苷酸序列”与术语“本发明的多核苷酸序列“同义。
本发明的多核苷酸包括编码本发明多肽的核苷酸序列。应当理解的是，由于遗传密码的简并性，有多种不同的多核苷酸编码一种特定的氨基酸序列。
通过了解本文所提供的氨基酸序列，可以设计出编码本发明多肽的部分和完整长度的核酸序列，如cDNA和/或基因组克隆。例如，可以用简并PCR获得本发明的多核苷酸，所述PCR使用针对编码本发明氨基酸序列的目标序列而设计的引物。所述引物通常包括多个简并位点。不过，为了降低简并性，应当选择编码含有诸如甲硫氨酸的氨基酸的本发明所提供的氨基酸序列的片段的序列，它仅由一个三联体编码。另外，序列的选择要考虑其核酸被用作PCR生产的模板DNA的生物中的密码子使用。PCR所使用的严格条件低于克隆序列所使用的条件，具有针对已知序列的单一序列(非简并)引物。
通过PCR获得的编码本发明多肽片段的核酸序列可用于通过杂交文库筛选技术获得较大的序列。例如，可以用放射性原子标记PCR克隆，并用于从其他物种中筛选cDNA或基因组文库，优选从其他植物物种或真菌物种中筛选。杂交条件通常为中等至高等严格性的条件(例如，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约50℃-大约60℃)。
编码所述氨基酸序列的全部或部分的简并性核酸探针还可被用于从其他物种中检测cDNA和/或基因组文库，优选从其他植物物种或真菌物种中检测。不过，首先优选实施PCR技术，以便获得用于进一步筛选过程的单一序列。
用上文所述技术所获得的本发明的多核苷酸序列，可被用于通过上文所述的技术获得其他的同源序列和变体。还可对其进行修饰，以便用于在多种宿主细胞系统中表达本发明的多肽，例如，优化表达所述多核苷酸序列的特定宿主细胞中的密码子偏倚性。为了引入限制酶识别位点，或者改变由该多核苷酸所编码的多肽的特性或功能，可能需要进行其他序列改变。
本发明的多核苷酸可用于生产一种引物，例如，PCR引物、可变扩增反应的引物、探针，例如，通过常规方法用放射性或非放射性标记物标记过的探针，或者可以将所述多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其他片段的长度至少为15，优选至少20，例如，至少25、30或40个核苷酸，它们仍然包括在本文所使用的术语本发明多核苷酸的范围内。
本发明的多核苷酸或引物可以携带一种显像标记，合适的标记包括放射性同位素，如32P或35S，酶标记、或其他蛋白标记，如生物素。所述标记可以添加到本发明的多核苷酸或引物中，并可以用本身已知的技术检测。
本发明的多核苷酸，如DNA多核苷酸和引物可以通过重组、合成、或本领域技术人员所知的任何方法生产。还可以用标准技术对其进行克隆。
一般，引物是通过合成方法生产的，包括逐步生产所需要的核酸序列，每次生产一个核苷酸。用于实现这一目的的、使用自动化技术的技术在本领域中很容易获得。
较长的多核苷酸通常是用重组方法生产的，例如，使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。该方法包括制备针对需要克隆的内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂基因的一个片段的引物对(例如，大约15-30个核苷酸)，让所述引物与从真菌、植物或原核细胞中获得的mRNA或cDNA接触，在能够发生所需要片段扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，以及回收扩增的DNA。所述引物可以被设计成含有合适的限制酶识别位点，以便扩增的DNA可以扩增到合适的克隆载体上。调控序列
优选将本发明的多核苷酸可操作地连接到一种调控序列上，该序列能够进行编码序列的表达，如由所选择的宿主细胞表达。举例来说，本发明包括含有可操作地连接在所述调控序列上的本发明多核苷酸的载体，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指并列连接，其中，所述成分的连接关系使得它们能够以其预期的方式起作用。“可操作地连接”与编码序列上的调控序列是以这种方式连接的，该编码序列的表达是在与调控序列兼容的条件下实现的。
术语“调控序列”包括启动子和增强子，以及其他表达调控信号。
术语“启动子”使用的是本领域的普通含义，例如，RNA聚合酶结合位点。
还可以通过筛选异源调控区，例如，启动子、分泌前导和终止区实现编码本发明多肽的多核苷酸的增强表达，所述调控区起着增强表达的作用，并且，如果需要还可以增强从选择的表达宿主中分泌感兴趣的蛋白的水平和/或提供对本发明多肽表达的诱导型控制。
本发明的核苷酸序列优选可操作地与一个启动子连接。
除了编码本发明多肽的基因所固有的启动子之外，还可以用其他启动子指导本发明多肽的表达。还可以筛选启动子的效率，以便指导本发明多肽在希望的表达宿主中表达。
在另一种实施方案中，可以筛选一种组成型启动子，以便指导本发明需要的多肽的表达。所述表达结构可以提供其他优点，因为它避免了在含有诱导底物的培养基上培养表达宿主的必要性。
优选用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可以从编码木聚糖酶(xlnA)，植酸酶，ATP合成酶、亚基9(oliC)，磷酸三糖异构酶(tpi)，醇脱氢酶(AdhA)，α淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-来自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因中获得的启动子。
强酵母启动子的例子是可以从编码醇脱氢酶、乳酸酶、3-磷酸甘油酸激酶和磷酸三糖异构酶的基因中获得的启动子。
强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SP02启动子，以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。
还可以将杂合启动子用于改善所述表达结构的诱导型调控。
所述启动子还可以包括能确保或提高在合适宿主中表达的特征。例如，所述特征可以是诸如Pribnow框或TATA框的保守区。所述启动子甚至可以含有能影响(如维持、增强、减弱)本发明核苷酸序列表达水平的其他序列。例如，合适的其他序列包括Sh1-内含子或ADH内含子。其他序列包括诱导因子-如温度、化合物、光照或胁迫诱导因子。另外，可以存在能增强转录或翻译的合适因子。上述因子的一个例子TMV5’信号序列(参见Sleat基因217[1987]217-225；和Dawson植物分子生物学23[1993]97)。分泌
通常，希望本发明的多肽能从表达宿主中分泌到培养基中，这样，更有利于从培养基中回收本发明的多肽。根据本发明，分泌前导序列可以根据需要的表达载体进行选择。对于本发明来说还可以使用杂合的信号序列。
异源分泌前导序列的典型例子是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的形式，例如，来自曲霉属)、α因子基因(酵母，例如，酵母属和克鲁维酵母属)或α淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的分泌前导序列。结构
术语“结构”-是诸如“接合体”、“框”和“杂合体”的术语的同义词-包括直接或间接与启动子连接的本发明的核苷酸序列。间接连接的例子是提供一个合适的间隔基团，如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子，使其介于本发明的启动子和核苷酸序列之间。与本发明相关的术语“融合”的情况也是如此，它包括直接或间接连接。在每一种情况下，该术语不包括编码正常情况下与野生型基因启动子结合的核苷酸序列的天然组合，并且它是处在其天然环境中。
所述结构甚至还可以包括或表达一种标记，该标记可用于从在转入了该结构的诸如细菌，优选芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌或植物，如马铃薯、甜菜等的生物中筛选该基因结构。可以使用各种现有的标记，如编码甘露糖-6-磷酸异构酶(特别是植物的)的标记，或能产生抗生素抗性的标记-例如，针对G418潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。
本发明的结构优选至少包括可操作地连接在一个启动子上的本发明的核苷酸序列。载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体，以及穿梭载体。
术语“表达载体”表示一种能进行体内或体外表达的结构。
术语“转化载体”表示一种能够从一种实体转移到另一种实体-它可以是相同的物种或不同的物种中的结构。如果所述结构能够从一个物种转移到另一个物种-如从大肠杆菌质粒转移到细菌中，优选转移到芽孢杆菌属中，该转化载体有时被称为穿梭载体。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到农杆菌属再转移到植物中的结构。
如下文所述，本发明的载体可以转入合适的宿主细胞，以便实现本发明多肽的表达。因此，本发明的另一方面提供了一种用于制备本发明多肽的方法，该方法包括在能表达所述载体的编码所述多肽的编码序列的条件下，用表达载体转化或转染过的宿主细胞，以及回收表达的多肽。
例如，所述载体可以是具有一个复制起点、并选择性地具有一个用于表达所述多核苷酸的启动子，以及选择性地具有一个所述启动子的调控子的质粒、病毒或噬菌体载体。
本发明的载体可以包括一个或多个选择标记基因。用于工业微生物的最合适的筛选系统是不需要在宿主生物中突变的一类筛选标记构成的。真菌筛选标记的例子是编码乙酰胺(amdS)、ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清苷-5’磷酸-脱羧酶(pvrA)、腐草霉素和benomyl抗性(benA)的基因。非真菌筛选标记的例子是细菌G418抗性基因(它还可用于酵母，而不是真菌中)，氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)，新霉素抗性基因(芽孢杆菌属)和大肠杆菌uidA基因，编码β-葡糖醛酸酶(GUS)。
载体可以体外使用，例如用于生产RNA，或用于转染或转化所述细胞。
因此，本发明的多核苷酸可以整合到重组载体(通常为复制型载体)上，例如，克隆或表达载体。所述载体可用于在兼容的宿主细胞中复制所述核酸。因此，在另一种实施方案中，本发明提供了一种通过以下方式制备本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸导入一种复制型载体，将所述载体导入兼容的宿主细胞，并在能复制该载体的条件下生长所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收所述载体。合适的宿主细胞在下文结合表达载体介绍。组织
本文所使用的术语“组织”包括组织本身和器官。宿主细胞
与本发明相关的术语“宿主细胞”包括能够含有编码本发明重组蛋白和/或由它所获得的产物的核苷酸序列的所有细胞，其中，一个启动子使得本发明的核苷酸序列能在宿主细胞中表达。
因此，本发明的另一种实施方案提供了用本发明多核苷酸转化或转染过的宿主细胞。所述多核苷酸优选携带在用于复制和表达所述多核苷酸的载体上。应当选择与所述载体兼容的细胞，并且，举例来说可以是原核(例如，细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
革兰氏阴性细菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。不过，大量的异源蛋白倾向于积累在所述细胞里面。随后要从大量的大肠杆菌细胞内部蛋白中纯化所需要的蛋白有时可能是困难的。
与大肠杆菌相反，来自芽孢杆菌属的细菌非常适合作为异源宿主，因为它具有将蛋白分泌到培养基中的能力。适于作为宿主的其他细菌是来自链霉素或假单胞菌属的宿主。
根据编码本发明多肽的多核苷酸的性质和/或对进一步加工表达蛋白的需要，诸如酵母或真菌的真核宿主可能是优选的。一般，酵母细胞优于真菌细胞，因为它更有利于操作。不过，某些蛋白要么很少从酵母细胞中分泌，要么在某些情况下不能正确加工(例如，在酵母中高糖基化)。在这种情况下，应当选择真菌宿主生物。
本发明范围内的优选表达宿主的例子是真菌，如曲霉菌(如，在EP-A-0184438和EP-A-0284603中所披露的)和木霉菌；细菌，如芽孢杆菌(如在EP-A-0134048和EP-A-0253455所披露的)，链霉菌和假单胞菌；以及酵母，如克鲁维酵母(如EP-A0096430和EP-A-00301670中所披露的)和酵母菌。
典型的表达宿主可选自黑曲霉、塔宾黑曲霉、泡盛黑曲霉、棘孢曲霉、构巢曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、枯草芽孢杆菌、地衣型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母。生物
与本发明相关的术语“生物”包括可以含有编码本发明的重组蛋白和/或由它所获得的产物的核苷酸序列的所有生物，其中，一个启动子使得本发明的核苷酸序列能够在所述生物中表达。对于本发明的木聚糖酶抑制剂方面来说，优选的生物可以包括真菌、酵母或植物。对于本发明的木聚糖酶方面来说，优选的生物可以是细菌，优选芽孢杆菌属、更优选枯草芽孢杆菌。
与本发明相关的术语“转基因生物”包括含有编码本发明的重组蛋白和/或由它所获得的产物的核苷酸序列的所有生物，其中，所述启动子能够在所述生物内表达本发明的核苷酸序列。所述核苷酸序列优选整合到该生物的基因组中。
术语“转基因生物”不包括存在于其天然环境中的本发明的天然核苷酸编码序列，在这种情况下，它受同样也处在天然环境中的天然启动子的控制。另外，本发明不包括本发明的天然蛋白，在这种情况下，它处于其天然环境中，并且它是由同样处在其天然环境中的天然核苷酸序列表达的，并且该核苷酸序列是由同样处在其天然环境中的天然启动子控制的。
因此，本发明的转基因生物包括编码本发明氨基酸序列的核苷酸序列，本发明结构(包括其组合)、本发明载体、本发明质粒、本发明细胞、本发明组织或其产物的任一种或其组合。所述转化细胞或生物能够制备可接受数量的理想化合物，这些化合物可以从所述细胞或生物中方便地回收。宿主细胞/宿主生物的转化
如上文所述，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合适原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。现有技术对原核宿主转化的介绍相当充分，例如，Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)和Ausubel等，当代分子生物学方法(1995)，John Wiley&Sons公司。
如果使用原核宿主，可能需要在转化之前对核苷酸序列进行适当的修饰-如除去内含子。
如上文所述，优选的宿主生物是芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌。
在另一种实施方案中，所述转基因生物可以是酵母。就此而言，酵母还可以被广泛用作异源基因表达的载体。酿酒酵母具有很长的工业应用历史，包括其作为异源基因表达的用途。Goodey等(1987，酵母生物技术，D R Berry等著，401-429页，Allen和Unwin，伦敦)和King等(1989，酵母分子和细胞生物学，E F Walton和G TYarronton著，107-133页，Blackie，Glasgow)业已对异源基因在酿酒酵母中的表达做过综述。
由于若干种原因，酿酒酵母很适合于异源基因表达。首先，它不是人类的病原体，并且它不能够产生某些内毒素。其次，它在几个世纪的各种目的的商业利用中，具有很长的安全使用历史。这导致了普遍的公众认可。第三，对这种生物进行的深入的商业应用和研究导致了对酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特征的深入了解。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作为异源基因表达的载体”，酵母，5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison著，第2版，学术出版有限公司)对在酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理做过综述。
现有若干种类型的酵母载体，包括整合载体，这种载体需要与宿主基因组重组以便其保持；以及自主性复制的质粒载体。
为了制备转基因酵母，通过将本发明的核苷酸序列插入为了在酵母中表达而设计的结构上，制备表达结构。业已开发了若干种类型的用于异源表达的结构。所述结构含有与本发明核苷酸序列融合的、在酵母中有活性的启动子，通常使用源于酵母的启动子，如GAL1启动子。通常使用源于酵母的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。该表达系统的末端是在酵母中有活性的终止子。
为了转化酵母，业已开发了若干种转化方法。例如，本发明的转基因酵母可以按照以下文献所披露的方法制备：Hinnen等(1978，美国科学院院报75，1929)；Beggs，J D(1978，自然，伦敦，275，104)；和Ito，H等(1983，细菌学杂志153，163-168)。
转化的酵母细胞用各种筛选标记筛选。用于转化的标记包括多种营养缺陷型标记，如LEU2，HIS4和TRP1，以及显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷抗生素标记，例如，G418。
另一种宿主生物是植物。构建遗传修饰的植物的基本原理是将遗传信息插入植物基因组，以便实现插入遗传材料的稳定保持。
现有若干种插入遗传信息的技术，两种主要的方法是直接导入所述遗传信息，以及利用载体系统导入遗传信息。对有关总体方法的综述可以参见以下文章：Potrykus(植物生理学植物分子生物学年度综述[1991]42：205-225)和Christou(农业食品工业高技术3月/4月，1994，17-27)。
因此，本发明一方面涉及一种载体系统，它携带有本发明的核苷酸序列或结构，并且能够将所述核苷酸序列或结构导入诸如植物的生物中。
所述载体系统可以包括一种载体，但也可以包括两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常被称为二元载体系统。在GynheungAn等的文章中对二元载体系统有更详尽的说明(1980，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19)。
一种用特定核苷酸序列转化植物细胞的被广泛采用的系统基于源于根癌农杆菌的Ti质粒的使用或源于毛根农杆菌的Ri质粒的使用，An等(1986)，植物生理学81，301-305和Butcher D.N.(1980)，植物病理学家的组织培养方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，203-208。
业已构建了若干种不同的Ti和Ri质粒，它们适于构建上述植物或植物细胞结构。所述Ti质粒的一种非限制性例子是pGV3950。
本发明的核苷酸序列或结构优选被插入Ti质粒的T-DNA的末端序列之间，或者靠近一个T-DNA序列，以避免破坏紧靠T-DNA臂的序列，因为至少有一个所述片段似乎对于将修饰过的T-DNA插入植物基因组很重要。
通过以上说明可以理解，如果生物是植物，那么本发明的载体系统优选包括感染植物所必需的序列(例如vir片段)以及至少一个T-DNA序列的边界部分，该边界部分与所述遗传结构位于同一个载体上。所述载体系统优选是根癌农杆菌Ti质粒或毛根农杆菌Ri质粒或其衍生物，因为这些质粒是众所周知的，并被广泛应用于构建转基因植物，现有的很多种载体系统就是基于所述质粒或其衍生物的。
在构建转基因植物时，首先在一种微生物中构建本发明的核苷酸序列或结构，所述载体可以在这种微生物中复制，并且在插入植物中之前容易操作。有用的微生物的例子是大肠杆菌，不过，也可以使用具有上述特征的其他微生物。当在大肠杆菌中构建了上文所述载体系统的一种载体之后，如果需要将其转入合适的农杆菌属菌株中，例如根癌农杆菌。因此，优选将具有本发明核苷酸序列或结构的Ti质粒转入合适的农杆菌属菌株，例如，根癌农杆菌，以便获得本发明核苷酸序列或结构的农杆菌细胞，然后将所述DNA转入待修饰的植物细胞。
这样，可将本发明的核苷酸或结构导入所述载体上的合适的限制位点。将所述包含的质粒用于转化大肠杆菌。在合适的营养培养基上培养所述大肠杆菌细胞，然后收获并裂解。然后回收质粒。作为分析方法，通常使用序列分析、限制分析、电泳和进一步的生化-分子生物学方法。在每次操作之后，可以对所使用的DNA序列进行限制，并与下一个DNA序列连接。可以将每一个序列克隆到相同的或不同的质粒上。
在每一次将需要的本发明的核苷酸序列导入植物之后，可能需要其他DNA序列的存在和/或插入。例如，如果用Ti或Ri质粒转化植物细胞，可以连接至少Ti和Ri质粒T-DNA的右侧边界，不过，通常是右侧和左侧作为导入基因的旁侧区。业已对T-DNA在转化植物细胞方面的应用做过深入研究，并且披露于以下文献中：EP-A-120516；Hoekema，二元植物载体系统，Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley等，植物科学评论综述，4：1-46；和An等，EMBO(1985)4：277-284。
用农杆菌直接感染植物组织是一种简单的方法，该方法业已被广泛采用，并且披露于以下文献中：Butcher D.N.(1980)，植物病理学家的组织培养方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，293-208。对这一问题的进一步介绍可以参见Potrykus(植物生理学植物分子生物学年度综述(1990)42：205-225)和Christou(农业食品工业高技术3月/4月，1994，17-27)。采用这种技术可以对植物的特定部分或组织进行感染，即对叶片、根、茎的一部分或植物的其他部分进行感染。
通常，在用携带有所述核苷酸序列的农杆菌直接感染植物组织时，要创伤待感染的植物，例如，通过用刀片切割植物或者用针头穿刺植物或者用刷子摩擦植物。然后用所述农杆菌接种所述创面。然后在合适的培养基上生长所述接种过的植物或植物部分，并让其发育成成熟的植株。
在构建植物细胞时，可以按照众所周知的组织培养方法生长并保持所述细胞，如在补充了诸如氨基酸、植物激素、维生素等的必需生长因子的合适的培养基中培养所述细胞。可以用从细胞或组织培养物再生植株的已知方法，将所述转化细胞再生成遗传上修饰过的植物，例如，用一种抗生素筛选转化过的幼苗，并在含有合适营养成分、植物激素等的培养基上对所述幼苗进行继代培养。
对植物转化的进一步介绍可以参见EP-A-0449375。多肽的生产
根据本发明，本发明多肽的生产可以通过在一种常规应用发酵培养基中培养业已用本发明的一种或多种多核苷酸转化过的诸如微生物的表达宿主而实现。合适培养基的选择可基于表达宿主和/或基于该表达结构的调控要求。对本领域技术人员来说，所述培养基是众所周知的。如果需要，所述培养基可以含有有利于转化的表达宿主的其他成分，它超过了其他潜在的污染微生物。抗体
本发明的氨基酸序列还可用于制备抗该氨基酸序列的抗体-如通过使用标准技术制备。为了生产抗体，可以通过注射所述抑制剂或具有免疫原特性的它的任何部分、变体、同系物、片段或衍生物或寡肽，对包括山羊、兔子、大鼠、小鼠在内的各种宿主进行免疫。根据宿主的种类，可以使用各种佐剂，以便增强免疫反应。所述佐剂包括，但不限于Freund’s矿物凝胶，如氢氧化铝和表面活性物，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔嘁血蓝蛋白、和二硝基苯酚。卡介苗(BCG)和小棒杆菌是潜在的有用的人类佐剂，也可以使用它们。
所述氨基酸序列的单克隆抗体甚至可以用任何技术制备，这种技术能通过培养基中连续的细胞系生产抗体分子。其中包括，但不限于最初由Koehler和Milstein(1975，自然256：495-497)披露的杂交瘤技术，人类B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)今日免疫学4：72；Cole等(1983)美国科学院院报80：2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)单克隆抗体和癌症治疗(Alan R Liss公司，77-96页)。另外，可以使用为了生产“嵌合抗体”而开发的技术，该技术将小鼠抗体基因剪接到人类抗体基因上，以便获得具有合适的抗原专一性和生物学活性的分子(Morrison等(1984)美国科学院院报81：6851-6855；Neuberger等(1984)自然312：604-608；Takeda等(1985)自然314：452-454)。另外，可以采用所公开的用于生产单链抗体的技术(US-A-4946779)生产抑制剂专一性单链抗体。
还可以按如下方法生产抗体：通过在淋巴细胞群体中诱导体内生产或通过筛选重组免疫球蛋白文库或具有高度专一性结合试剂的类型，如在以下文献中所披露的：Orlandi等(1989，美国科学院院报86：3833-3837)，和Winter G和Milstein C(1991)；自然349：293-299)。
方法
方法1
木聚糖酶测定
(内切-β-1，4-木聚糖酶活性)
在柠檬酸(0.1M)-磷酸氢二钠(0.2M)缓冲液，pH5.0中稀释木聚糖酶样品，以便在最终的测定中达到大约OD＝0.7。将所述样品的三种稀释液和具有特定活性的内标在40℃下恒温培养5分钟。当时间＝5分钟时，将一个Xylazyme tab(交联的、染色的木聚糖底物)加入所述酶溶液中。当时间＝15分钟时，通过添加10毫升的2％的Tris终止反应。对反应混合物进行离心，并在590nm波长下测定上清液的OD。综合考虑稀释液和木聚糖酶的量，可以计算样品相对所述标准物的活性(TXU，总木聚糖酶单位)。
方法2
粘性方法
(粘性测定)
用SMS面团粘性仪在TA-XT2系统(稳定的微型系统)上测定面团粘性。该方法是Chen和Hoseney(1995)所述方法的改进形式。用Farinograph(AACC方法54-21)由面粉、2％氯化钠和水制备面团，使其达到400Brabender单位(BU)。将面粉和氯化钠干燥混合1分钟。加入水，并将面团再混合5分钟。所获得的面团最好在密封的容器中，在30℃下放置10、30或45分钟。
将大约4克面团放入面团粘性仪中。取出4mm的面团，以便获得均匀的挤压。然后按照稳定的微型系统方法进行5种测定(测定面团粘性的TA-XT2应用研究)。简单地讲，挤出1mm的面团，以预定的力将与所述TA-XT2系统连接的探头(25mm的介电有机玻璃筒状探头)压入挤压的面团中。将面团取出，并记录面团和探头之间的粘性。采用以下TA-XT2参数：
选项： 粘性测定
测定前速度： 2.0mm/s
测定速度： 2.0mm/s
测定后速度： 10.0mm/s
距离： 15mm
力： 40g
时间： 0.1s
触发类型 自动-5g
数据获得速度： 400pps
在该实验中所记录的结果是最大力，表示将探头从挤压的面团中拔出所需要的力。所述距离表示面团连接在探头上的距离。面积表示位于所获得的曲线下部的面积。
面团粘性取决于所使用的面粉的质量和配方。因此，非粘性面团是与对照面团相比，其粘性相差100％-200％(相对)的面团，优选在以能在烘烤实验中产生相同的体积增加的水平制备时具有低于用商业真菌木聚糖酶(即Pentopan mono BG，Novo Nordisk)所获得粘性的不到70％(相对)。
方法3
抑制剂测定方法
(抑制剂测定)
为了在分离和鉴定期间检测所述抑制剂，使用以下所述方法。混合100微升抑制剂组分、250微升木聚糖酶溶液(含有12TXU/ml)和650微升缓冲液(0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0)。在40℃下对该混合物进行5分钟恒温培养。在时间＝5分钟时，加入一个Xylazyme tab。在时间＝15分钟时，通过添加10毫升的2％Tris终止该反应。对该反应混合物进行离心(3500g，10分钟，室温)，并在550nm波长下测定上清液。以相对空白的残余活性形式计算抑制作用。所述空白是用相同方法制备的，所不同的是用100微升缓冲液(0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0)取代100微升的抑制剂。举例来说，可以认为XM-1具有对该抑制剂的高度的抗性(参见图20)。可以认为XM-2和XM-3具有对该抑制剂的中度的抗性(参见图20)。
方法4
葡聚糖酶方法1
(内切-β-1，4-葡聚糖酶活性)
在柠檬酸(0.1M)-磷酸氢二钠(0.2M)缓冲液，pH5.0中稀释葡聚糖酶样品，以便在最终的测定中达到大约OD＝0.7。将所述样品的三种稀释液和具有特定活性的内标在40℃下恒温培养5分钟。当时间＝5分钟时，将一个Glucazyme tab(交联的、染色的葡聚糖底物)加入所述酶溶液中。当时间＝15分钟时，通过添加10毫升的2％的Tris终止反应。对反应混合物进行离心，并在590nm波长下测定上清液的OD。综合考虑稀释液和葡聚糖酶的量，可以计算样品相对所述标准物的活性(BGU，β葡聚糖酶单位)。
方法5
抑制剂测定方法2
(抑制剂动力学测定)
为了研究所述抑制剂的动力学，使用一种可溶性底物(叠氮木聚糖，Megazyme)。按照生产商的方法用20mM NaPi，pH6.0制备所述底物的2％(w/v)溶液。该测定是在40℃下预热底物、木聚糖酶和抑制剂5分钟完成的。
为了进行初步抑制剂鉴定，将使用的木聚糖稀释到40TXU/ml。为了进行Ki测定，将木聚糖酶稀释到40TXU/ml。
当时间＝0分钟时，在40℃下混合0.5毫升底物、0.1毫升木聚糖酶和0.1毫升抑制剂。当时间＝125分钟时，通过添加2毫升的乙醇(95％)，然后涡旋搅拌10秒钟终止该反应。通过离心(3500Xg，10分钟，室温)除去沉淀的未水解的底物。在590nm下测定上清液相对水的OD。
用相同方法制备空白。唯一的改进是用20mM NaPi，pH6.0取代所述抑制剂。
为了用降低的底物浓度进行动力学实验，通过用20mM NaPi，pH6.0稀释制备以下底物浓度：2％、1％、0.5％和0.25％可溶性叠氮木聚糖(w/v)。
为了进行Ki测定，使用上述木聚糖酶和底物浓度。在该测定中与以下浓度的抑制剂提取物组合：0，2，5，10，25，50和100微升。使用微升抑制剂而不是摩尔浓度的抑制剂，Ki以微升抑制剂形式表示。
总结
总而言之，本发明特别提供了：
a.从小麦面粉中分离内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂。
b.鉴定从小麦面粉中分离的内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂。
c.鉴定内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂对不同木聚糖酶的作用。
d.一种筛选不会受到内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂负面影响的木聚糖酶的方法。
e.一种筛选不会受到内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂的负面影响的木聚糖酶的方法。
f.与含有真菌木聚糖酶的面团相比能提供具有有利的体积和可接受的粘性的木聚糖酶。
g.一种用于筛选木聚糖酶和/或用一种内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂诱变该木聚糖酶的方法，并将所述木聚糖酶或其突变体用于生产面团。
h.用本发明的木聚糖酶制备的食品。
保藏物
根据布达佩斯条约将以下样品保存在被认可的保藏机构国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，AB2 1RY，1998年12月22日：
DH5α：：Pcr2.1-BS木聚糖酶 NCIMB编号NCIMB40999
BL21(DE3)：：pET24A-XM1 NCIMB编号NCIMB41000
BL21(DE3)：：pET24A-XM3 NCIMB编号NCIMB41001
DH5α：：Pcr2.1-BS木聚糖酶含有野生型木聚糖酶。
BL21(DE3)：：pET24A-XM1含有XM1木聚糖酶。
BL21(DE3)：：pET24A-XM3含有XM2木聚糖酶。
本发明还包括可以由所述保藏物衍生和/或表达的序列，以及含有它的实施方案。
对实施例部分和附图的介绍
下面仅以举例形式结合附图对本发明进行说明，其中：
图1表示曲线；
图2表示曲线；
图3表示曲线；
图4表示曲线；
图5表示曲线；
图6表示曲线；
图7表示曲线；
图8表示曲线；
图9表示曲线；
图10表示曲线；
图11表示SDS PAGE实验的图象结果；
图12表示曲线；
图13表示曲线；
图14表示曲线；
图15表示曲线；
图16表示曲线；
图17表示IEF实验的图象结果；
图18表示曲线；
图19表示曲线；
图20表示曲线；
图21表示曲线；
图22表示曲线；
图23表示曲线；
图24表示曲线；
图25表示曲线；
图26表示曲线；
图27表示曲线；
图28表示曲线；
图29表示曲线；
图30表示曲线；和
图31表示曲线。
更详细地讲：
图1-木聚糖酶、剂量和驻留时间对粘性的影响。
图2-木聚糖酶、剂量和驻留时间对粘性的影响。
图3-75毫升抑制剂提取样品的凝胶过滤层析。柱：500毫升Superdex G-25F，流速：10毫升/分钟，级份大小：30毫升。
图4-240毫升凝胶过滤的抑制剂提取样品阳离子交换层析。柱：50毫升Sepharose SP，流速：5.0毫升/分钟，级份大小：10毫升。
图5-添加硫酸铵到1.0M的147毫升离子交换的抑制剂提取样品的HIC层析。柱：10毫升Phenyl HIC，流速：2.0毫升/分钟，级份大小：2.5毫升。
图6-25毫升浓缩抑制剂样品的制备凝胶过滤层析。抑制剂在176毫升时洗脱。柱：330毫升Superdex 75PG(Pharmacia)。洗脱液50mM乙酸钠，200毫升氯化钠，pH5.0。流速：1毫升/分钟，级份大小：5.5毫升。
图7-木聚糖酶+煮沸的抑制剂提取物的阳离子交换层析谱。样品：1毫升脱盐的980601+煮沸的抑制剂提取物。柱：1毫升SourceS15。缓冲系统：A：50mM乙酸钠，pH4.5，B：A+1M氯化钠。流速：2毫升/分钟。
图8-纯木聚糖酶在与抑制剂提取物培养3小时之后的阳离子交换层析谱。样品：1毫升脱盐的980601+煮沸的抑制剂提取物。柱：1毫升Source S15。缓冲系统：A：50mM乙酸钠，pH4.5，B：A+1M氯化钠。流速：2毫升/分钟。
图9-100微升浓缩抑制剂样品的分析凝胶过滤层析。抑制剂在10.81毫升时洗脱。柱：24毫升Superdex 75 10/30(Pharmacia，瑞典)。洗脱液50mM乙酸钠，100毫升氯化钠，pH5.0。流速：0.5毫升/分钟，级份大小：2.0毫升。
图10-通过Superdex 75 10/30的标准蛋白的Kav对Log(MW)的影响。
图11-来自制备凝胶过滤的级份31、32和33SDS PAGE。泳道1和3是分子量标记(Pharmacia’s MLW标记，瑞典)。泳道2和4是分别以10微升和25微升加样的级份32。泳道6和8是分别以10和25加样的级份31。泳道7和9是分别以10和25加样的级份33。
图12-是来自凝胶过滤层析级份33的反向层析谱。层析谱上出现了4个不同的峰。峰3是木聚糖酶抑制剂。对峰4、5和6进行测序，并表现出与小麦蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂具有极高的同源性。
图13-来自RP-层析的级份3的MS。图谱表示一种分子量为39503Da的分子。
图14-来自级份33的反向层析谱(参见图12)的羧基甲基化级份3的反向层析。该层析谱出现了两个独立的峰(级份2和3)，表示一种二肽。
图15-来自羧基甲基化反向层析(参见图14)的级份的MS。图谱表示一种分子量为12104Da的肽。
图16-来自羧基甲基化反向层析(参见图14)的级份3的MS。图谱表示一种分子量为28222Da的肽。
图17-来自制备凝胶过滤层析的级份33和34的IEF。泳道2是pI3-10标准物，泳道3是pI2.53-6.5标准物泳道4和5分别是级份33和34，泳道6是Trysin抑制剂(pI4.55)，泳道7是乳球蛋白(pI5.20)，而泳道8和9分别是级份33和34。箭头表示级份33中不同的带。
图18-来自木聚糖酶抑制剂层析聚焦层析的级份对pH和相对OD(来自抑制剂测定)的影响。从该图可以看出，在级份7中相对OD降低，表示有抑制剂活性。它与pH9.4相应。
图19-抑制剂浓度对四种木聚糖酶的百分残余活性的影响。所使用的四种木聚糖酶是--◆-X1，-■-X3，-x-BX，-▲-Novo。
图20-980601(coli-1)、980603(Belase)和980601的三种突变型(SM1、SM2和SM3)这与面粉提取物培养之后的残余活性。
图21-木聚糖酶(980601)+/-抑制剂的Line-weaver-Burk图。底物浓度为叠氮木聚糖的百分比。V是来自测定的相对OD590(其中100为S＝2％)。
图22-不同木聚糖酶Ki，以微升抑制剂表示。
图23-pH对三种木聚糖酶(980601＝枯草芽孢杆菌wt，980801＝X1和980901＝Thermomyces)的抑制作用的影响。数据是比较相关的空白而获得的。
图24-三种木聚糖酶(980601＝BX，980801＝X1和980901＝Novo)的最佳pH。
图25-比体积＝f(木聚糖酶X剂量)。
图26-比体积增加＝f(木聚糖酶X剂量)。
图27-粘性＝f(木聚糖酶X剂量)。
图28-在驻留时(-10)和(-45)分钟之后，测定的不同木聚糖酶制剂和对照对粘性的影响。980603是纯化的Rohm木聚糖酶，XM1是木聚糖酶突变体1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
图29-在驻留时(-10)和(-45)分钟之后，三种木聚糖酶制剂对粘性增加的影响。980603是纯化的Rohm木聚糖酶，XM1是木聚糖酶突变体1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
图30-在驻留时(-10)和(-45)分钟之后，两种木聚糖酶制剂对粘性的影响。XM1是木聚糖酶突变体1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
图31-添加的内切-β-1，4-木聚糖酶对粘性增加的影响。1：没有木聚糖酶的对照面团，2：7500TXU纯的Rohm木聚糖酶/kg面粉，3：7500TXU纯的Rohm木聚糖酶/kg面粉+158PGU/kg面粉，4：15000TXU纯的Rohm木聚糖酶/kg面粉，5：15000TXU纯的Rohm木聚糖酶/kg面粉+316PGU/kg面粉。在10(Stik-10)和(Stik-45)分钟之后，测定的面团。实施例例1不同木聚糖酶、剂量和驻留时间对面团粘性的影响
测定了以下木聚糖酶产生面团粘性的能力。
(同样参见Chen，W.Z.和Hoseney，R.C.(1995)。一种评价面团粘性的客观方法的开发。Lebensmittel Wiss u.-Technol.，28，467-473)。
酶
“X1”相当于源于黑曲霉的内切-β-1，4-木聚糖酶的纯化样品。该木聚糖酶的活性为8400TXU(15000TXU/毫克)
“Novo”相当于源于Thermomyces的Novo Nordisk’s BentopanMono BZ。这种木聚糖酶的活性为350.000TXU(56000TXU/毫克)
“BX”相当于新型细菌木聚糖酶的纯化样品。该样品的活性为2000TXU(25000TXU/毫克)
“Rohm”相当于Rohm GmbH’s细菌木聚糖酶，Veron Speviel。该样品的活性为10500TXU(35000TXU/毫克)
木聚糖酶测定
木聚糖酶测定是按方法1进行的。
面粉
在该实验中使用了两种面粉：丹麦面粉，批号为98022，德国面粉，批号为98048。这两种类型的面粉在400BU的条件下的吸水量分别为58％和50％。
面团制备
按方法2制备面团。在混合面团之后，在30℃下在密封的容器中分别放置10分钟和45分钟。
粘性测定
按方法2测定粘性。
结果和讨论
真菌木聚糖酶与新型细菌木聚糖酶。
制备以下面团，并在10分钟和45分钟之后测定面团粘性，使用的面粉是98048。
表1
用不同剂量的两种真菌木聚糖酶和一种细菌木聚糖酶制备的面团
(剂量是以每千克面粉计算的) 酶 TXU/kg 空白 0 X1(980801) 1500 10000 Novo(#2165) 500 60000 BX(980802) 1500 15000
表1中的面团所产生的面团粘性结果表示在表2和图1中。
表2
用不同剂量的不同木聚糖酶和空白制备的面团。
面团分别放置10分钟和45分钟。粘性以g×s形式给出。粘性数字是5次测定的平均值 面团 粘性，g×s 标准误差标准误差，％ 对照，10分钟 5.533 0.16 2.89 对照，45分钟 8.103 0.277 3.42 1500×1，10分钟 7.275 0.204 2.80 1500×1，45分钟 8.675 0.134 1.54 10000×1，10分钟 9.295 0.802 8.63 10000×1，45分钟 13.339 1.264 9.48 5000Novo，10分钟 6.757 0.218 3.23 5000Novo，45分钟 7.23 0.337 4.66 60000Novo，10分钟 10.972 0.519 4.73 60000Novo，45分钟 16.559 1.626 9.82 1500BX，45分钟 4.372 0.358 8.19 1500BX，10分钟 6.567 0.639 9.73 1500BX，45分钟 5.545 0.518 9.34
来自表2的数据表示在图1中。
从表2和图1可以看出，真菌木聚糖酶X1和Novo产品中的木聚糖酶能增加面团粘性。新型细菌木聚糖酶不能增加同一种面团的粘性。另外，粘性似乎比对照低。
新型细菌木聚糖酶与Rohm’s细菌木聚糖酶
为了实验新型细菌木聚糖酶与Rohm制品：Veron Special中的细菌木聚糖酶相比的功能，用面粉98022制备以下面团(参见表3)
表3用不同剂量的两种细菌木聚糖酶制备的面团
(剂量是以每千克面粉计算的) 酶 TXU/kg 空白 0 BX 5000 15000 Rohm 5000 15000表3中面团所产生的面团粘性结果在表4和图2中表示。
表4
用不同剂量的不同木聚糖酶和空白物制备的面团
粘性以g×x形式给出。粘性数字是5次测定的平均值 面团粘性，g×s 标准误差标准误差，％ 对照，10分钟 5.269 0.16 3.04 对照，45分钟 5.484 0.277 5.05 5000BX，10分钟 4.443 0.204 4.59 5000BX，45分钟 4.474 0.134 3.00 15000BX，10分钟 4.791 0.352 7.35 15000BX，45分钟 6.288 0.599 9.53 5000Rohm，10分钟 5.077 0.218 4.29 5000Rohm，45分钟 6.757 0.337 4.99 15000Rohm，10分钟 7.749 0.519 6.70 15000Rohm，45分钟 10.98 0.907 8.26
表4的数据在图2中示出。
以上结果表明，BX(新型细菌木聚糖酶)所产生的粘性远远低于实验的真菌木聚糖酶所产生的粘性。另外，发现所述新型木聚糖酶所产生的面团粘性远远低于Rohm细菌木聚糖酶的。例2抑制剂纯化、鉴定和对木聚糖酶的影响面粉
在该实验中使用三种不同类型的面粉(批号为98002、98026和98058)。面粉批号98002和98058是丹麦面粉。面粉批号98026是德国面粉。抑制剂提取
使用冰镇的蒸馏水并搅拌，从所述面粉中提取抑制剂。将1等份的面粉添加到2等份的冰镇蒸馏水中。在该混合物中放入一个磁力棒，并放在冰浴中，搅拌20分钟。在搅拌之后将面糊注入离心管，并离心(10000g，4℃，10分钟)。上清液中含有木聚糖酶抑制剂。抑制剂测定
按方法3进行抑制剂测定。抑制剂分离
在对100克面粉样品(98026)进行提取之后，通过以下层析技术纯化木聚糖酶抑制剂。凝胶过滤层析(该方法进行2次)
以10毫升/分钟的速度，将75毫升提取物加样到用20mM乙酸，pH4.25平衡的500毫升Superdex G-25F(Pharmacia，瑞典)柱上。用相同的流速以30毫升的级份收集洗脱液。所有级份都含有抑制剂。阳离子交换层析(该方法进行2次)
以5毫升/分钟的速度将从凝胶过滤中收集的抑制剂峰(240毫升)加样到50毫升SP Sepharose(Pharmacia，瑞典)柱上。在加样之后，用缓冲液(200mM乙酸钠，pH4.25)将该柱洗脱到本底水平。用线性梯度的A-B缓冲液(B：A+350mM氯化钠)以10倍柱体积，以相同的流速洗脱抑制剂。以10毫升的级份收集洗脱液。每隔1个级份对木聚糖酶抑制剂进行抽样检查。疏水性相互作用层析(该方法进行2次)
向来自阳离子交换层析的抑制剂峰(110毫升)中添加硫酸铵至1.0M，并以2毫升/分钟的速度加样到10毫升Phenyl Sepharose HIC(Pharmacia，瑞典)柱中。用12倍柱体积的从A(20mM NaPi，1M硫酸铵，pH6.0)至B(20mM NaPi，pH6.0)的线性梯度将所述抑制剂从柱中洗脱。洗脱液以2.5毫升的级份收集，每隔1个级份对木聚糖酶抑制剂进行抽样检查。制备凝胶过滤层析
用旋转蒸发器将来自HIC层析的5毫升抑制剂峰进行向上浓缩至2毫升。将该样品以1毫升/分钟的速度加样到330毫升Superdex 75PG(Pharmacia，瑞典)柱上。所使用的缓冲系统是50mM乙酸钠，0.2M氯化钠，pH5.0。以5.5毫升的级份收集洗脱液。每隔1个级份对木聚糖酶抑制剂进行抽样检查。
蛋白酶活性分析
为了确定发现的抑制剂作用是由于抑制剂还是由于蛋白酶水解了木聚糖酶，进行了以下实验。培养试验
在40℃下将2毫升纯的木聚糖酶980601(参见内切-β-1，4-木聚糖酶)与0.25毫升抑制剂提取物一起培养3小时。作为对照，与煮沸的(5分钟)抑制剂提取物进行相同的培养。在培养之后向该样品中添加50mM乙酸钠，pH4.5，达到2.5毫升，并在PG-10柱(Pharmacia，瑞典)上通过凝胶过滤脱盐，获得存在于50mM乙酸钠，pH4.5中的3.5ml样品。水解分析
在SOURCE 15S柱上，对来自所述培养试验的纯木聚糖酶的两个样品进行分析。以2毫升/分钟的速度将1毫升凝胶过滤样品加样到所述柱上(用A缓冲液平衡：50mM乙酸钠，pH4.5)。所述样品用从A-B(B：A+1M氯化钠)的线性梯度，用20倍柱体积洗脱，并以2毫升级份收集。用OD280nm检测木聚糖酶，并在级份中对木聚糖酶活性进行抽样检查(100微升级份+900微升缓冲液(0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0)+1个Xylazyme tab，10分钟，40℃。用10毫升2％Tris终止反应。兰色＝木聚糖酶活性)。抑制剂鉴定分析凝胶过滤层析
以0.5毫升/分钟的速度将来自HIC层析的100微升(在旋转蒸发器上浓缩2次)抑制剂峰加样到24毫升Superdex75 10/30(Pharmacia，瑞典)上。所使用的洗脱缓冲液是50mM乙酸钠，0.1M氯化钠，pH5.0。以2毫升的级份收集洗脱液。抽样检查所述级份的抑制剂。
为了能够确定该抑制剂的大小，将一系列已知的蛋白加样到24毫升Superdex10/30柱上。进行洗脱的条件与上文所述相同。所使用的标准蛋白为：
蛋白 大小，KDa
BSA 67
卵清蛋白 43
胰凝乳蛋白酶 25
核糖核酸酶A 13.7
在280nm波长下检测所述蛋白。
SDS PAGE
向来自制备凝胶过滤层析的级份中添加SDS样品缓冲液(按照NOVEX方法制备)，煮沸3分钟，并加样到8-16％PAGE凝胶(NOVEX)中。按照NOVEX’s方法对所述凝胶进行银染色。用Pharmacia’s LMW标记作为分子量标记。等电聚焦(IEF)
为了测定天然抑制剂的pI，将纯化抑制剂(来自330毫升Superdex 75PG的级份33)的样品加样到pH3-10的IEF GEL(NOVEX)上。按照生产商的方法对所述凝胶进行电泳。使用Pharmacia’s(瑞典)宽pI试剂盒，3.5-9.3作为标准物。按照生产商的方法用考马斯亮兰对所述凝胶进行染色。层析聚焦层析
将来自制备凝胶过滤层析的级份33的样品凝胶过滤到水中。将100微升脱盐样品加样到Mono P HR5/5(Pharmacia，瑞典)柱上。起始条件是用25mM乙醇胺-HCl，pH9.4获得的。用1∶10的Poly缓冲液96：水洗脱该柱。将pH调整到6.0(流速：0.5毫升/分钟；级份大小：0.5毫升)。在用Po1y缓冲液96洗脱之后，进一步用1∶10的Poly缓冲液74：水洗脱该柱。将pH调整到3.80(流速：0.5毫升/分钟；级份大小：0.5毫升)。
测定所有级份的pH，并用方法3对木聚糖酶抑制剂进行抽样检查。氨基酸序列
使用制备纯化的纯抑制剂的样品(从330毫升Superdex75PG的级份33获得)。将200微升加样到C4反向柱(应用生物系统)上。所使用的缓冲液缓冲系统为A：用水制备的0.1％TFA，和B：用100％乙腈制备的0.1％的TFA。对来自该层析的抑制剂峰进行羧甲基化，并再次通过C4柱。这样，获得了两种感兴趣的抑制剂肽。对这些肽进行N-末端测序。另外，用Lys-C消化所述肽。用反向层析方法回收所获得的肽，并进行氨基酸测序。
为了证实通过氨基酸测序所获得的序列，用MS(Voyager)对感兴趣的样品的一小部分进行分析。
抑制剂动力学
按照方法5进行抑制剂测定。就此而言，为了进行初步抑制剂鉴定研究，所使用的木聚糖酶是980601，稀释到40TXU/毫升，并且抑制剂是从面粉98002中提取的。为了进行Ki测定，使用以下木聚糖酶：980601、980603、980801、980901、980903、980906、和980907，稀释到大约40TXU/毫升。用于Ki测定的抑制剂是从面粉98058中提取的。
测定pH对抑制作用的影响
这些实验是按照方法3所述方法完成的，进行了以下改进。在该测定中除了使用650微升缓冲液(0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠)pH5.0之外，该测定还用pH为4、6和7的相同的缓冲系统进行。
内切-β-1，4-木聚糖酶
使用以下木聚糖酶制剂：
980601(BX)：在大肠杆菌中表达的Danisco’s新型细菌木聚糖酶的纯化制剂(1225TXU/毫升)。
980603(Rohm)：Frimond’s Belase木聚糖酶(与Rohm’s相同)的纯化制剂(1050TXU/毫升)。
980801(X1)：来自黑曲霉的纯化X1(8400TXU/克)。
980801(Rohm)：Frimond’s Belase木聚糖酶(与Rohm’s相同)的纯化制剂(26TXU/毫升)。
980901(Novo)：来自Novo’s Pentopan mono BG的Thermomyces木聚糖酶的纯化制剂(2900TXU/毫升)。
980903(XM1)：在大肠杆菌中表达的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶的突变体(1375TXU/毫升)。
980906(XM1)：在大肠杆菌中表达的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶的突变体(1775TXU/毫升)。
980907(XM2)：在大肠杆菌中表达的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶的突变体(100TXU/毫升)。
9535(X1)：来自黑曲霉的纯化木聚糖酶X3(6490TXU/毫升)。结果和讨论
用于分离和鉴定的抑制剂提取
对100克面粉(98026)进行提取。在离心之后获得150毫升上清液。检查抑制剂在该提取物中的存在(表5)并发现呈阳性。
表5+/-添加来自小麦面粉(98026)的抑制剂提取物对残余活性的影响。
所使用的木聚糖酶是980601。 -抑制剂 +抑制剂 残余活性，％ OD590 0.675 0.165 24.44抑制剂分离
将75毫升抑制剂提取物加样到500毫升凝胶过滤柱(图3)上。在进行抑制剂的抽样检查之后，可以确定其存在于级份[4-11]中(表6)。
表6对来自凝胶过滤层析的75毫升抑制剂提取物的级份进行木聚糖酶抑制剂测定。OD处理1和2分别相应于在该柱上进行的两种处理。发现抑制剂存在于级份[4-11]中。在每一轮处理中收集这些级份，得到两个240毫升。 级份编号 OD处理1 OD处理2 1 0.674 2 0.665 3 0.652 4 0.618 0.476 5 0.388 0.166 6 0.186 0.126 7 0.188 0.18 8 0.277 0.217 9 0.381 0.231 10 0.406 0.246 11 0.395 0.435 12 0.725 13 0.683 14 0.762 15 0.737
两轮凝胶过滤柱处理的抑制剂峰收集物大约为240毫升。
将来自凝胶过滤的两个240毫升的收集物加样到阳离子交换器上。发现流通液中的抑制剂呈阴性。从图4和表7中可以看出，所述抑制剂结合在所述柱上，并被大约750mM氯化钠洗脱。
表7分析来自240毫升凝胶过滤抑制剂提取物的阳离子交换层析的级份中木聚糖酶抑制剂的存在。OD处理1和2分别相应于在所述柱上进行的两轮处理。发现抑制剂存在于级份[44-54]中。 级份编号 OD处理1 OD处理2 40 0.476 0.624 42 0.407 0.58 44 0.404 0.398 46 0.22 0.137 48 0.144 0.107 50 0.198 0.126 52 0.302 0.208 54 0.395 0.435 56 0.457 0.495 58 0.463 0.606
来自每一轮离子交换处理的抑制剂收集物为110毫升。向这两种收集级份中添加硫酸铵至1.0M，并分两次处理加样到HIC柱上。对流通液中的抑制剂进行抽样检查，并发现呈阴性。从图5和表8中可以看出，所有抑制剂结合在所述柱上，并获得了良好的分别。
对来自HIC层析的级份进行的分析如表8所示。
表8分析来自147毫升抑制剂提取物的HIC层析的级份。OD处理1和2分别相应于在该柱上进行的两轮处理。发现抑制剂存在于级份[15-23]中。 级份编号 OD处理1 OD处理2 空白 0.469 0.659 12 0.462 0.622 14 0.486 0.555 16 0.202 0.188 18 0.1 0.118 20 0.102 0.146 22 0.242 0.193 24 0.392 0.502 26 0.485 0.6
将来自HIC层析的级份17和18浓缩大约2倍，并加样到制备凝胶过滤柱上(图6)。
对来自制备凝胶过滤的级份所做的分析如表9所示。
表9分析来自2毫升浓缩制剂样品的制备凝胶过滤层析的级份中木聚糖酶抑制剂的存在。发现抑制剂存在于级份[31-33]中。 级份编号 OD590 26 0.738 28 0.774 30 0.645 32 0.117 34 0.705 36 0.749 38 0.754 40 0.761 42 0.769
蛋白酶活性分析
根据对木聚糖酶抑制剂所做的以上测定，不能排除在与淀粉提取物混合时木聚糖酶活性的降低不是由于木聚糖酶的蛋白水解作用。因此，将纯化的木聚糖酶与一种“抑制剂”提取物培养。从图7和8可以看出，似乎没有发生水解。在采用活性抑制剂的层析谱上存在很少的背景(图8)。不过，该背景相当于所述仅有所述抑制剂的层析谱(抑制剂的层析谱没有示出)。背景的差别一定是由于在煮沸的抑制剂样品中的沉淀作用。
抑制剂鉴定
分析凝胶过滤层析
将来自第2个HIC处理的级份18的100微升浓缩2倍的抑制剂样品加样到24毫升分析Superdex75 10/30(Pharmacia，瑞典)上(图9)。以2毫升的级份收集洗脱液。测定所述级份中的木聚糖酶抑制剂(表10)。
表10分析来自100微升浓缩抑制剂样品的分析凝胶过滤层析级份中木聚糖酶抑制剂的存在。发现抑制剂存在于级份[6-7]中。 级份编号 OD590 空白 0.613 6 0.233 7 0.304 8 0.51 9 0.569 10 0.565 11 0.652
在对向上浓缩的抑制剂样品进行凝胶过滤之后，用完全相同的方法将四种标准分子量蛋白的混合物加样到所述柱上(层析谱未示出)。在表11中归纳了所述蛋白的分子量和洗脱时间。
表11用于测定所述抑制剂分子量的标准蛋白。所使用的缩写和公式在下面的表中解释。 标准蛋白 Ve，ml Kav＊ MW，kDa Log(MW) BSA 9.46 0.059508 67 1.826075 卵清蛋白 10.38 0.119017 43 1.633468胰凝乳蛋白酶 12.49 0.255498 25 1.39794核糖核酸酶A 13.49 0.320181 13.7 1.136721
＊)Kav＝(Ve-Vo)/Vt-Vo)
其中：Ve＝驻留时间，ml＝
Vo＝间隙体积，ml＝8.54
Vt＝24ml＝24
用log(MW)作为Kav的函数作图。可以获得一个公式，并估算一种未知分子的分子大小(图10)。
使用在图10中获得的公式和所述抑制剂的驻留时间，可以计算出该抑制剂的分子大小：
(-2,2248×kav+1.9602)
MW.kDa＝10
(-2,4485×0.173559+1.9602)
＝ 10
1.5352
＝ 10
＝ 34.29
发现该抑制剂的分子量高于我们按照Rouvu和Surget(1998，戊聚糖酶抑制剂在小麦面粉中存在的证据。谷类科学杂志，28：63-70)的方法预计的分子量。该分子的分子量为大约8KDa。通过凝胶过滤所获得的分子量可以通过若干抑制剂分子的聚合来解释。为了进一步研究这一问题，对来自制备凝胶过滤层析的级份31、32和33进行SDS PAGE凝胶处理(图11)。从该凝胶上可以看出，在用纯化抑制剂样品加样的泳道上出现了三条带。这些带相当于分子量为大约40、30和10KDa的蛋白。
用MS测定分子量
用Presob系统和5倍体积的20mM乙酸对来自制备凝胶过滤的抑制剂的级份33的样品进行脱盐。将200微升样品加样到C4反向柱(应用生物系统)上。在该处理中获得了三个峰。其中的一个峰(峰3)明显占有优势，并被认为是所述抑制剂(图12)。对来自该处理的其他峰也进行了测序。从所获得的序列可以断定，这些峰都源于相同的小麦蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且与所述抑制剂(峰3)不同。因此，峰3被认定为感兴趣的木聚糖酶抑制剂。还用MS(Voyager)对该峰作进一步鉴定。用芥子酸作基质进行的MS谱分析发现了与一种39503Da的蛋白相应的信号。
如上文所述，SDS PAGE凝胶揭示了三条带。一条带大约为10KDa，一条带大约为30KDa，而另一条带为大约40KDa。为了解释在SDS PAGE中观察到的结果，收集纯的占优势的级份，裂解并进行羧甲基化，然后再一次用C4柱处理，所使用的条件与上文所述相同。
用MS分析通过该再次处理所获得的级份(图54)。从图15和16可以看出，所述多肽的分子量为12104和28222Da。
并不受理论的约束，我们认为所述木聚糖酶抑制剂要么是一种天然的二肽(分子量为39503Da)，要么就是在分子过程中变性并降解(分子量分别为12104和28222Da的两种肽)。
用IEF和层析聚焦层析测定所述木聚糖酶抑制剂pI
IEF凝胶在碱性部位(分别为大约9.3、8.6和8.2)表现出三条带，并且在酸性部位(分别为大约5.1、5.3和5.5)表现出三条带(图17)。仅仅根据以上结果，不容易确定所述天然木聚糖酶抑制剂的pI。就此而言，我们从测序结果了解到，所述样品仅含有所述木聚糖酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂的三个分子量大约为4500Da的片段。理论计算的丝氨酸蛋白酶抑制剂的pI为5.58，而根据我们通过测序所获得的片段所计算的pI为5.46(使用Swiss Prot程序)。这可以表明，在所述凝胶上所出现的三条酸性带是在反向层析中所观察到的丝氨酸蛋白酶抑制剂的三个峰(图12)，而三条碱性带是所述木聚糖酶抑制剂的三种不同的形式，即天然的二肽形式和所述两种肽(通过测序证实)。
从图18中的层析聚焦层析结果可以看出，所述木聚糖酶抑制剂在所给定的条件下不与柱结合。这意味着，天然木聚糖酶抑制剂的pI为8.5甚至更高。因此上文所提出的假设可能是正确的，就是说在IEF凝胶上有三条碱性带，并且可能存在三种形式的木聚糖酶抑制剂。
总之，我们认为所述天然木聚糖酶抑制剂的pI在8.0-9.5的范围内。在该范围内有三条带。这三条带可能是相当于可能是以三种形式存在的木聚糖酶抑制剂(参见用IEF测定的结果)。就此而言，在使用IEF时，所述蛋白以天然蛋白形式运行，但是某些二肽蛋白可能被该技术部分破坏，因此产生了一条以上的带。
序列资料
对构成所述抑制剂的两种肽进行测序，得到N-末端和内部序列。所得到的结果以序列13-19的形式提供在所附序列表中。
构成第1条链(链A)的序列用序列13和14表示。构成第2条链(链B)的序列用序列15-19表示。
对测序的多肽所作的数据库同源性检索呈阴性。以前尚没有对所述多肽的任一种进行过测序或披露。
抑制剂对不同木聚糖酶的作用
进行了若干实验，以便研究不同木聚糖酶的抑制作用。首先，我们认为木聚糖酶活性的降低是由于提取物中的蛋白降解活性。因此，让不同的木聚糖酶与不同体积的“抑制剂”提取物一起培养(图19)。发现所述木聚糖酶受到了不同程度的抑制。我们还发现似乎作用的增强受“抑制剂”浓度的影响。
图19所示结果表明，所述降低是由于蛋白水解或抑制剂。不过，用稳定的木聚糖酶和抑制剂浓度进行的时间进程实验以及上述在“分析蛋白酶活性”条件下获得的结果未能证实降低的活性受时间影响。为了能够区分蛋白酶和抑制剂，必须进行真实的动力学(参见“抑制剂动力学)。
对两种枯草芽孢杆菌木聚糖酶的有关烘烤的特性进行了相关性研究。这两种木聚糖酶在其作用方面差别不大，这表明其中的一种在以相同的剂量烘烤时能达到略微高一些的比体积。一种解释是，可能其活性在面粉中受到不同的抑制。因此，进行了一种实验来证实这一观点。重复该实验两次，使用两种不同类型的面粉作为抑制剂的来源(表14)。
表14从两种面粉(98002和98020)中提取的抑制剂对两种木聚糖酶(9806001和980603)的抑制作用。抑制作用是以与空白相比较的百分抑制作用和百分残余活性形式计算的。 面粉 98002 98026 抑制，％ 980601 67.03 75.04 980603 60.76 61.33 98002 98026 平均 残余活性，％ 980601 32.97 24.96 28.96 980603 39.24 38.67 38.96 相差，％ 25.65
以上实验证实，这两种木聚糖酶受到所述抑制剂的不同程度的抑制。所述木聚糖酶仅有6个氨基酸的差别。
基于980601，制备了三种木聚糖酶突变体(XM1、XM2和XM3)。分析了这三种突变型的抑制作用(图20)。
从图20可以看出，这三种突变体的残余活性不同，这表明它们受到所述木聚糖酶抑制剂的不同程度的抑制。五种木聚糖酶中的四种(BX，Rohm，XM1和XM2)具有相同的比活性(大约25000TXU/毫克蛋白)。预计XM2具有相同的比活性。
XM1和XM2之间抑制作用的差别为大约250％(XM1的残余活性比XM2的残余活性高2.5％)，这种差别是由于一个氨基酸而造成的。XM2上的氨基酸122从精氨酸变成了天冬酰胺，在靠近其活性位点的部位引入了较弱的正电荷。
抑制剂动力学
进行了简单的初步动力学研究。仅能够确定所述抑制剂是竞争性的还是非竞争性的。
用不同量的底物与相同量的木聚糖酶-和抑制剂浓度培养(图21)。从图21可以看出，有和没有抑制剂的木聚糖酶的Vmax均大约为1.19。这表明抑制作用是竞争性的。
由于上述初步抑制剂实验证实了研究过的木聚糖酶之间Ki的差别。测定了若干种木聚糖酶的实际Ki。从图22中的数据可以看出，所述木聚糖酶之间的Ki值没有明显差别。这证实了通过所述简单的初步抑制剂鉴定所得出的结果。
pH对抑制作用的影响
在不同pH下对木聚糖酶抑制剂所做的简单的估样检查发现，pH似乎能影响木聚糖酶的抑制作用。因此，设计了一种实验来验证这种作用。从图23可以看出，对木聚糖酶的抑制作用受pH的影响。图24说明了所述木聚糖酶的最佳pH。如果比较以上两条曲线，我们可以看出，对木聚糖酶的最大抑制作用出现在最佳pH处，唯一的另外是Novo木聚糖酶(980901)的pH4测定。
为了确定本文所披露的在所述测定中测定的抑制作用的比例与面团相关，可以进行某些计算：
抑制剂
提取
克 6
面粉：
毫升：水 12
g 0.5
面粉/毫升：
测定的面粉g： 0.05
木聚糖酶溶液
TXU/ml 12
测定的TXU/ml： 3
抑制剂：木聚糖酶
比例
TXU/kg面粉： 60000抑制剂测定
TXU/kg面粉： 3000 烘烤应用
根据以上计算，在该测定中抑制剂：木聚糖酶的比例可以计算为比在面团中的比例低20倍。这仅仅意味着木聚糖酶在面团中必须受到更强的抑制。不过，在面团中的迁移性和水活性也更低，并且这会影响其抑制作用。
一般讨论
小麦面粉含有内源内切-β-1，4-木聚糖酶抑制剂。这种抑制剂可以通过用水进行简单的提取从小麦面粉中提取，这表明该抑制剂是水溶性的。用凝胶过滤、离子交换、和疏水性相互作用层析计算对该抑制剂进行纯化。
用分析凝胶过滤层析、SDS PAGE、反向层析和MS鉴定纯化抑制剂，发现了一种大约为40KDa的多肽。这种多肽是一种二肽，它含有分子量分别为12104和28222的两种肽。对纯化的抑制剂(更确切的讲是以上两种肽)进行N-末端测序，然后消化获得肽的序列。
用所述抑制剂进行的初步实验证实，木聚糖酶活性的降低可能是由蛋白水解作用。不过，对该抑制剂所做的培养实验(木聚糖酶+抑制剂)和动力学分析证实，所观察到的木聚糖酶活性的降低是由于竞争性抑制剂。
用若干种木聚糖酶进行的抑制剂实验证实了对该抑制剂敏感性的差别。某些木聚糖酶几乎能受到该抑制剂100％的抑制(抑制剂：木聚糖酶的比例低于在面粉中的比例。通过改变抑制剂测定中的pH，发现其抑制作用高度依赖于测定中的pH。检验木聚糖酶的突变体发现，改变一个氨基酸能够导致抑制作用有250％的降低。
为了证实以上结果，测定了若干种木聚糖酶的Ki值。结果证实，不同的Ki取决于所使用的木聚糖酶。证实了对该抑制剂承受能力的差别受木聚糖酶的影响，正如在初步结果中所观察到的。
例3
烘烤试验
以下的数据来自用XM1突变体进行的烘烤试验。这些数据表明，这种新型木聚糖酶突变体在体积方面明显优于BX(枯草芽孢杆菌野生型)。根据粘性测定，在这两种木聚糖酶之间没有明显差别。
酶
980902(BX)：在大肠杆菌中表达的纯化的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶(2000TXU/毫升)。
980903(XM1)：在大肠杆菌中表达的纯化的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶(1375TXU/毫升)。
面粉
丹麦面粉，批号98022。
烘烤实验(硬面包圈)
在Hopart混合妻中用钩子糅合面粉2000克，干酵母4000克，糖32克，盐32克，GRINDSTEDTMPANODAN A20204克，水400Brabender单位+4％，低速揉合，并高速揉合9分钟。面粉温度为26℃。称量面团的重量为1350克。在30℃下放置10分钟，然后用一个Fortuna模具进行模塑。在34℃，85％RH条件下烘烤45分钟。在Bago炉中以220℃的温度烘烤18分钟，并用蒸汽蒸12秒。
在面包圈冷却之后，进行称量，并通过菜籽排出方法测定其体积。
粘性测定
粘性测定是按照方法2进行。
从表15中可以看出，新型的木聚糖酶突变体(XM1)与BX相比能产生明显较大的面包体积增加。
表15以不同剂量使用的两种木聚糖酶(BX和XM1)对面包体积增加
(毫升/克)和粘性(g×s)的影响。 样品 剂量 TXU/kg 粘性 g×s 比体积 ml/g比体积增加 ％ BX 2000 6.00 6.03 2.55 BX 5000 6.60 6.49 10.37 BX 8000 5.00 6.77 15.14 BX 12000 7.00 6.72 14.29 XM1 2000 4.30 6.60 12.24 XM1 5000 6.20 6.88 17.01 XM1 8000 6.20 7.06 20.07 XM1 12000 6.90 7.32 24.49 对照 0 4.50 5.88 -
以上数据表示在图25、26和27中。
例4
XM1、Rohm VERON特种木聚糖酶和Rohm VERON特种木聚糖酶的纯化形式对面团粘性的影响
为了确定新型木聚糖酶XM1所产生的面团粘性比Rohm VERON特种木聚糖酶(及其纯化形式)是高还是低，制备了面团，并测定木聚糖酶对粘性的影响。
面粉
使用丹麦面粉98022。
面团制备
按方法2所述制备面团。在混合之后，在粘性测定之前，在密封的容器中分别放置面团10分钟和45分钟。
粘性测定
粘性测定是按方法2进行的。
酶
980903(XM1)：在大肠杆菌表达的纯化的枯草芽孢杆菌野生型木聚糖酶的突变体(1375TXU/毫升)。
#2199：Rohm VERON特种木聚糖酶(10500TXU/克)。
980603(Rohm)：Frimond’s Belase木聚糖酶的纯化制剂(与Rohm’s相同)(1050TXU/毫升)。
制备以下面团(表16)。
表16
为了测定粘性而制备的面团 木聚糖酶 剂量，TXU/kg面粉980603(纯化的Rohm木聚糖酶) 15.000 对照 0 XM1 15.000#2199(Rohm’s Veron Special) 15.000
表16中的面团所得到的粘性结果在表17中示出。
表17对用纯化的Rohm木聚糖酶、对照、XM1和Rohm VERON特种木聚糖酶制备的面团进行粘性测定得到的结果。木聚糖酶 TXU/kg面粉放置时间，分钟粘性，g×s粘性增加，g×s 980603 15.000 10 7.22 2.22 980603 15.000 45 10.15 4.08 对照 0 10 5.00 0 对照 0 45 6.09 0 XM1 15.000 10 6.61 1.61 XM1 15.000 45 9.64 3.55 #2199 15.000 10 8.67 3.57 #2199 15.000 45 12.14 6.05
以上数据表示在图28、29和30中。使用XM1所导致的粘性增加低于使用纯化的Rohm木聚糖酶所导致的粘性增加。用未纯化的Rohm木聚糖酶所获得的粘性增加更高。
例5
细菌内切-β-1，4-葡聚糖酶对面团粘性的影响
以下结果来自为了研究细菌内切-β-1，4-葡聚糖酶产生粘性的能力而设计的实验。
酶
981102-1(Xy1)：相当于来自产品Veron Special的Rohm’s细菌木聚糖酶的纯化制剂。该制剂是纯的木聚糖酶，并且不含有任何内切-β-1，4-葡聚糖酶(350TXU/毫升)。
981102-2(Xy1+Glu)：相当于来自产品Veron Special的Rohm’s细菌木聚糖酶的纯化制剂，含有内切-β-1，4-葡聚糖酶(900TXU/毫升+19BGU/毫升)。
木聚糖酶测定
木聚糖酶测定是按方法1进行的。
葡聚糖酶测定
葡聚糖酶测定是按方法4进行的。
面粉
使用丹麦面粉，批号为98058。在400BG下的吸水率为60％。
面团制备
按方法2所述制备面团。在混合之后，在30℃下，在密封的容器中将面团分别放置10分钟和45分钟。
粘性测定
粘性测定按方法2进行。
制备表18中所列举的面团，并检测其粘性。
表18为了检测粘性而制备的面团 面团编号 面团 TXU/kg面粉 TXU/kg面粉 1 对照 0 0 2 TXU 7500 0 3 TXU+BGU 7500 158 4 TXU 15000 0 5 TXU+BGU 15000 316
表18所列举的面团的粘性结果如表19所示。
表19粘性结果来自使用木聚糖酶和木聚糖酶+葡聚糖酶的面团
面团编号是指表18中的面团编号
Stik-10表示10分钟之后得到的粘性测定结果
Stik-45在放置45分钟之后的测定结果面团编号 Stik-10，g×s标准误差 Stik-45，g×s 标准误差 1 4.5 0.342 5.11 0.552 2 5.29 0.619 8.62 0.607 3 5.47 0.663 9.38 0.832 4 8.61 0.408 9.15 0.418 5 8.73 0.35 10.19 0.857
从表19可以看出，向面团中添加内切-β-1，4-葡聚糖酶可以提高面团的粘性。表19的结果表示在图31中。
总结
总而言之，本发明特别提供了：
a.从小麦面粉中分离内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂。
b.鉴定从小麦面粉中分离的内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂。
c.鉴定内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂对不同木聚糖酶的作用。
d.一种筛选不会受到内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂负面影响的木聚糖酶的方法。
e.一种筛选不会受到内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂的负面影响的木聚糖酶的方法。
f.与含有真菌木聚糖酶的面团相比能提供具有有利的体积和可接受的粘性的木聚糖酶。
g.一种用于筛选木聚糖酶和/或用一种内源内切-β-1，4木聚糖酶抑制剂诱变该木聚糖酶的方法，并将所述木聚糖酶或其突变体用于生产面团。
h.用本发明的木聚糖酶制备的食品。
在以上说明中所提到的所有文献被收作本文参考。在不脱离本发明范围和构思的前提下，对所述本发明和系统所做的各种改进和改变对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管业已结合特定的优选实施方案对本发明进行了说明，应当理解的是，要求保护的本发明不受所述特定实施方案的限定。实际上，对所述实施本发明的方案所做的在生物化学和生物技术或相关领域技术人员看来显而易见的各种改进都包括在以下权利要求书的范围内。