3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物，其制备方法和应用 【发明领域】
本发明涉及一种新的由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物，LTB-4[白细胞三烯-B-4；5(S)，12(R)-二羟基-6，14-顺-8，10-反-二十碳四烯酸]受体拮抗剂，其制备方法，以及作为LTB-4受体拮抗剂或骨质疏松症的治疗剂的应用。式I(其中n是3-5的整数)。
LTB-4，一种天然产物，是花生四烯酸酯的代谢产物，产生于5-脂肪氧化酶途径中[Ford-Hutchison，A.W.等，Nature(London)，286，264-265，1980]。LTB-4诱导嗜中性粒细胞的凝聚和脱粒，并促进白细胞的化学排序和运动，LTB-4收缩平滑肌，参与过氧化物的产生，并在很多患者的炎症损伤中检测到，例如，牛皮癣，肠炎，风湿症，支气管哮喘，成人呼吸窘迫综合症。
因而，用作LTB-4受体拮抗剂的化合物可被有效地用作上述疾病的抑制剂和治疗药物(Clint，D.W.等，J.Med.Chem.39，2629-2654，1996；Suh，H.，USP 5455274，1995)。
普通的LTB-4受体拮抗剂是SM-9064(Namiki，M.等，Biochem.Siophys.Res.Comm.138，540-546，1986)；U-75302(Morris，J.等，TetrahedronLett.29，143-146，1988)；LY-255283(Herron，D.K.等，FASEB J.2，A1110，1988)；SC-41930(Djuric，S.W.等，J.Med.Chem.32，1145-1147，1989)；LY-223982(Gapinski，D.M.等，J.Med.Chem.33，2807-2813，1990)；ONO-LB457(Konno，M.等，Adv.Prostaglandin，Thromboxane LeukotrieneRes.21，411-414，1991)；CP-105696(Showell，H.J.等，J.Pharmacol.Exper.Ther.273，176-184，1995)；CGS-25019C(Morrissey，M.M.，Suh，H.USP5451700；Brooks，C.D.等，J.Med.Chem.39，2629-2654，1996)；等等。
已有报道称CGS-25019C在其最高临界等级在普通的拮抗剂中对胃和小肠的刺激具有毒性。因而，需要开发一种新的LTB-4受体拮抗剂。
骨架需要物理支撑身体的骨质和结构，并作为钙贮存在保持血液中钙离子浓度中起着重要的作用。
为履行上述功能，骨吸收和重造是不断循环的，并且是在骨的吸收和重造代谢的动态之中。当骨的重造不能平衡骨的吸收时，骨的吸收高于骨的重造，造成骨密度和骨质的降低和骨质疏松，从而使骨强度得不到保持。骨质疏松常发生于中年和老年妇女。
截至目前，对骨质疏松的治疗是通过抑制破骨细胞的活性来抑制骨地吸收。由骨质的降低造成的脆性可能不能仅通过抑制骨的吸收来补偿。对于骨质疏松的理想治疗是防御脆性，需要抑制骨吸收和促进骨重造的药物。
本发明的发明人已合成出各种化合物，并对它们在拮抗LTB-4受体和促进骨形成中的效能进行了检测，从而抑制并治疗与LTB-4相关的疾病和骨质疏松。结果发明人完成了本发明，合成出了由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异恶唑衍生物，并鉴定了它们在拮抗LTB-4受体和促进骨形成中的效能。发明概述
本发明的目的是提供一种由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物。
本发明的另一个目的是提供一种制备由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物的方法。
本发明的再一个目的是提供一种含有可有效拮抗LTB-4受体的量的由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物之一的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供一种含有可有效促进骨形成的量的由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物之一的药物组合物。
从本发明的详细描述中，本领域普通技术人员可清楚地看出本发明的其它目的和应用。发明详细描述
下文将对本发明进行详细描述。
本发明的由式I表示的化合物是N，N-二异丙基-4-[4-(3-氨基-苯并[d]异噁唑-6-基氧)丁氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1141)，由式II表示；式II
N，N-二异丙基-4-[3-(3-氨基苯并[d]异噁唑-6-基氧)丙氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1151)，由式III表示；式III
N，N-二异丙基-4-[5-(3-氨基苯并[d]异噁唑-6-基氧)戊氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1132)，由式IV表示；式IV
由下述试验所示，本发明的式II至式IV的化合物可被用作与LTB-4相关的疾病或骨质疏松的抑制剂和治疗剂，因为这些化合物具有LTB-4受体拮抗剂和促进骨形成的效能。
本发明的化合物可以以抑制LTB-4受体或治疗骨质疏松的有效量通过各种施用途径施用；其形式和剂量可由本领域的普通技术人员按照施用目的，施用途径，患者的状况和体重来确定。
LTB-4受体拮抗剂或骨质疏松的治疗剂最好同时含有由式I表示的3-氨基-1，2-苯并异恶唑衍生物和药学上可接受的载体。这些载体可选自标准的药物可接受的载体，这些载体通常用于巴斯德灭菌溶液，片剂，包衣片剂，和胶囊。这些载体通常包括增体积剂，例如，淀粉，牛奶，糖，特殊粘土，明胶，硬脂酸，滑石，植物脂或油，树脂，乙二醇等，或其它种类的增体积剂。而且，载体中也可含有甜味剂，色素添加剂和其它的成分。
含有这些载体的组合物可通过已知的方法进行配制。但是，用作LTB-4受体拮抗剂和骨质疏松治疗剂的含有3-氨基-1，2-苯并异恶唑衍生物的组合物还未见报道。
在本发明中，用作LTB-4受体拮抗剂和骨质疏松治疗剂的含有3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物之一的组合物可通过已知的方式施用，例如口服，静脉内，肌肉内，和皮下注射等。但并不限于这些方式。
在实施本发明时，3-氨基-1，2-苯并异噁唑衍生物可以以很宽范围内的量存在于该药物组合物中。用作LTB-4受体拮抗剂和骨质疏松治疗剂的含有3-氨基-1，2-苯并异噁唑的组合物的有效量为10-1000mg/天。本领域的普通技术人员按照施用方式的特点，患者的状态和体重，炎症损伤的大小，施用的途径和频率，以及所使用的特定的衍生物的特点可容易地确定组合物的剂量和施用频率。
制备本发明的化合物的方法包括由图解I表示的步骤，用下述的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(1)作为初始材料，特定的条件示于实施例中。图解I其中I是二异丙基胺；II是二溴丁烷(a)，二溴丙烷(b)，二溴戊烷(c)；III是碘化钠(NaI)；IV是2-氟-4-羟基氰苯；V是丙酮肟；VI是盐酸；和VII是碳酸钾。
下面将通过为说明的目的而挑选的实施例对本发明进行描述，显然，本发明并不限于本文特别公开的内容。
本文中使用的缩写的含义如下：
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
GF/C：C型玻璃纤维滤膜
HBSS介质：Hank’s平衡盐溶液
TMS：四甲基硅烷(NMR谱的参照材料)
本发明的化合物通过使用NMR分光机(由Varian Co.制造)的质谱和NMR谱，按照Lambert(Lambert等，Organic Structural Analysis，MacmillanPub.Co.，NY，1993)的方法进行鉴定。实施例1N，N-二异丙基-4-[2-异亚丙基硝基氧-氰苯-4-基氧]丁氧基]-3-甲氧基苯酰胺[化合物(6a)]的制备(步骤1)N，N-二异丙基-4-羟基-3-甲氧基苯酰胺[化合物(2)]的制备
将4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，化合物(1)，(5克，29.6毫摩尔)溶解于二氯甲烷(200ml)，然后向其中加入亚硫酰氯(20ml，272毫摩尔)和DMF(1ml，12.8毫摩尔)，回流1小时，并在低压下浓缩。将产物溶解于二氯甲烷中(200ml)，并向其中加入二异丙胺(20ml，142.8毫摩尔)。搅拌2小时，在乙酸乙酯中稀释(500ml)，并用盐酸水溶液洗涤(100ml，1N)两次，并用饱和的氯化钠水溶液(130ml)洗涤。将得到的有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝2∶3)，得到5.23克的化合物(2)[Rf：0.32，产率：70％]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ1.20(d，12H，J＝2.6Hz)，3.69(m，2H)，3.79(s，3H)，6.74(m，3H)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ20.5，47.8，55.6，110.1，115.0，118.4，129.9，147.0，147.3，169.8。(步骤2)N，N-二异丙基-4-羟基-3-甲氧基苯酰胺[化合物(3a)]的制备
将上述步骤1得到的N，N-二异丙基-4-羟基-3-甲氧基苯酰胺(2.0克，7.96毫摩尔)溶解于DMF(30ml)，向其中加入碳酸钾(1.32克，9.55毫摩尔)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中加入二溴丁烷(1.14ml，9.55毫摩尔)，回流5小时。将该反应混合物在乙酸乙酯中稀释(20ml)后，用盐酸水溶液(1N)，氯化钠水溶液和蒸馏水洗涤。将有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)，得到1.9克的化合物(3a)[Rf：0.26，产率：62％]。(步骤3)N，N-二异丙基-4-(4-碘丁氧基)-3-甲氧基苯酰胺[化合物(4a)]的制备
将上述步骤2得到的N，N-二异丙基-4-(4-溴丁氧基)-3-甲氧基苯酰胺(1.9克，4.92毫摩尔)溶解于丙酮(30ml)，向其中加入碘化钠(NaI；1.87克，9.84毫摩尔)。将反应混合物回流10小时，除去溶剂。将产物溶解在二乙基醚中，并将有机层用氯化钠水溶液和蒸馏水洗涤。将有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)，得到1.41克的化合物(4a)[Rf：0.24，产率：66％]。(步骤4)N，N-二异丙基-4-[(2-氟氰苯-4-基氧)丁氧基]-3-甲氧基苯酰胺[化合物(5a)]的制备
将2-氟-4-羟基氰苯(0.403克，2.98毫摩尔)溶解于DMF(20ml)，然后在0℃向其中加入氢化钠(0.16克，3.58毫摩尔)，搅拌20分钟。将化合物(4a)(1.41克，3.28毫摩尔)溶解于DMF(10ml)，并将其加入上述混合物中。将反应混合物在在室温下搅拌2小时，在乙酸乙酯中稀释(20ml)，用蒸馏水洗涤4次。将有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)，得到0.69克的化合物(5a)[Rf：0.32，产率：56％]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ 1.25-1.45(m，12H)，2.00(m，2H)，3.72(br，2H)，3.83(s，3H)，4.09(m，4H)，6.72(m，2H)，6.85(d，2H)，7.48(t，1H，J＝7.8Hz)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ20.6，25.4，25.7，48.1，55.8，68.4，92.4，102.5，109.9，111.7，112.2，114.3，118.1，131.6，134.0，148.5，149.1，161.8，164.2，166.9，170.6。(步骤5)N，N-二异丙基-4-[2-异亚丙基硝基氧-氰苯-4-基氧)丁氧基]-3-甲氧基苯酰胺[化合物(6a)]的制备
将丙酮肟(0.52克，7.15毫摩尔)溶解于DMF(20ml)，向其中加入叔丁氧化钾(0.80克，7.15毫摩尔)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中加入化合物(5a)(0.586克，1.43毫摩尔)，并搅拌5小时。将产物倒入氯化铵的水溶液和二乙基醚的混合溶液中，然后分离有机层，用蒸馏水洗涤3次。将有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)，得到0.636克的化合物(6a)[Rf：0.32，产率：96％]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ1.20-1.45(m，12H)，2.00-2.10(m，4H)，2.05(s，3H)，3.74(br，2H)，3.86(s，3H)，4.11(t，4H，J＝5.78Hz)，6.54(dd，1H，J＝2.32Hz，8.60Hz)，6.86(m，3H)，7.08(d，1H，J＝2.32Hz)，7.43(d，1H，J＝8.60Hz)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ15.9，20.2，21.0，25.1，25.3，47.8，55.4，67.5，67.9，90.2，100.1，108.1，109.5，112.0，115.9，117.8，131.1，133.2，148.3，148.8，160.7，162.0，163.4，170.1。实施例2N，N-二异丙基-4-[4-(3-氨基-苯并[d]异噁唑-6-基氧)丁氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1141)的制备
将实施例1得到的化合物(6a)(0636克，1.37毫摩尔)加入乙醇(10ml)和盐酸水溶液(5％，10ml)的混合溶液中，然后加热至50℃并放置10小时。将该反应混合物在低压下浓缩，除去乙醇，将得到的水溶液用碳酸钾水溶液转变成碱性。用乙酸乙酯抽提3次，并将有机层用蒸馏水洗涤。将得到的有机层在无水硫酸镁上干燥，除去溶剂。将产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)，得到0.401克的所需的化合物[Rf：0.32，产率：64％]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ1.20-1.50(m，12H)，2.05(m，4H)，3.75(br，2H)，3.85(s，3H)，4.13(m，4H)，6.86-6.79(m，5H)，7.35(d，1H，J＝8.4Hz)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ20.7，25.8，48.0，55.8，67.9，68.4，93.3，109.2，109.8，112.1，118.1，120.6，131.4，148.6，149.1，157.8，161.4，164.7，170.8。
下面是HS-1141通过质谱仪分析的结果。
计算值：C(65.62)，H(7.71)，N(9.18)
检测值：C(65.70)，H(7.49)，N(8.87)实施例3N，N-二异丙基-4-[3-(3-氨基-苯并[d]异噁唑-6-基氧)丙氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1151)的制备
通过实施例1步骤2相同的条件制备化合物(3b)，只是将二溴丁烷用二溴丙烷替换，以此在实施例1相同的条件下，通过中间产物，化合物(3b)，(4b)，和(5b)制备化合物(6b)。
以与实施例2相同的条件得到HS-1151，只是将化合物(6a)用化合物(6b)替换[Rf：0.26(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ1.25-1.91(m，12H)，2.35(t，2H)，3.72(br，2H)，3.86(s，3H)，4.24(t，4H，J＝5.8Hz)，6.82-6.91(m，5H)，7.35(d，1H.J＝8.2Hz)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ20.7，28.9，48.3，55.8，64.8，65.4，93.6，109.4，109.9，112.6，112.9，118.1，120.6，131.7，148.6，149.2，157.8，161.4，164.6，170.8。实施例4N，N-二异丙基-4-[5-(3-氨基-苯并[d]异噁唑-6-基氧)戊氧基]-3-甲氧基苯酰胺(HS-1132)的制备
通过与实施例1步骤2相同的条件制备化合物(3c)，只是将二溴丁烷用二溴戊烷替换，以此在实施例1相同的条件下，通过中间产物，化合物(3c)，(4c)，和(5c)制备化合物(6c)。
以与实施例2相同的条件得到HS-1132，只是将化合物(6a)用化合物(6c)替换[Rf：0.32(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)]。
1H NMR(CDCl3，200MHz)δ1.34(m，12H)，1.68(t，2H)，1.90(m，4H)，3.72(br，2H)，3.84(s，3H)，4.02(t，4H，J＝6.2Hz)，6.86-6.74(m，5H)，7.34(d，1H，J＝8.4Hz)。
13C NMR(CDCl3，200MHz)δ20.6，22.4，28.5，28.6，49.1，55.7，68.0，68.5，93.2，109.3，109.8，112.2，112.7，118.1，120.7，131.7，148.7，149.0，157.9，161.4，164.5，170.7。实验1对LTB-4受体拮抗作用的实验
测量上述实施例2至4中得到的化合物对LTB-4受体的拮抗作用，如下所述。
通过使用“Dextran T-500”沉降，并通过用Ficoll/Paque(PharmaciaCo.)的下倾离心(Boyum，Scan.J.Clin.Lab.Invest.，21 Suppl.97，77-89，1989)从人全血中分离嗜中性粒细胞。
通过低渗溶液溶血除去红细胞。将最终的嗜中性粒细胞以3×107细胞/ml分散于HBSS介质中，并用于测量对LTB-4受体的拮抗作用。
对LTB-4受体的拮抗作用的测量是通过已知方法进行的(Tsai等，prostaglandins，38，655-674，1989)，其具体操作方法如下所述：
将0.5nM的[3H]-LTB-4(200Ci/毫摩尔)，对LTB-4受体拮抗作用测量的测试样品，和分散于HBSS介质的细胞加入12mm×75mm的聚乙烯管中(终体积：200μl)，并在冰浴中放置45分钟。
为了将结合在嗜中性粒细胞上的[3H]-LTB-4和没有结合在嗜中性粒细胞上的[3H]-LTB-4分开，将上述混合物用GF/C滤膜过滤(由Wattman Co.制造)。将滤膜用pH7.4的冷的Tris-缓冲液洗涤3次(5ml)，干燥，并测量其放射性。LTB-4对嗜中性粒细胞的选择性结合可通过在LTB-4完全被结合在嗜中性粒细胞上没有拮抗作用的情况下的放射性和在没有放射性同位素标记的LTB-4之外结合在嗜中性粒细胞上的LTB-4的放射性之间的差异的1000倍进行测量的。
表I中的拮抗作用的程度是由选择性结合的抑制程度表示的，他是样品对对照的百分率，IC50是50％浓度对受体的结合的拮抗。
为了比较本发明的化合物与已知的拮抗剂之间的拮抗作用，使用了一种已知的化合物，CGS-25019C(Morrissey，M.M.，和Suh，H.，USP 5451700；Brooks，C.D.等，J.Med.Chem.39，2629-2654，1996)。
表I HS化合物 抑制程度(％) IC50 10nM 100nM 1μM HS-1151 ＜10 37 92 HS-1141 64 95 99 7nM HS-1132 ＜10 10 90 CGS-25019C 11 68 97 80nM
从上述表I可以看出，本发明的化合物对LTB-4受体的拮抗作用相似于或好与(在HS-1141的情况下)已知的化合物，CGS-25019C。实验2对类骨结节形成的评估
将30个小鼠的颅盖除去所有的组织，在37℃溶解于5ml无菌胶原酶(0.1％)和胰酶溶液中(0.05％)。20分钟后，收集释放出的细胞，向其中加入等量的小牛血清。将这一程序每20分钟重复3-6次，收集分离的细胞。将收集的细胞通过离心分离(400×g)5分钟，悬浮在含有10％(v/v)小牛血清的α-MEM介质中。将收集的细胞在培养皿中培养2-3天，然后用胰酶分离，置于96孔培养板中，每孔2×103细胞/100μl。
在将细胞培养2-3天后，将介质换成5％小牛血清，150μg/ml抗坏血酸，和5mM β-甘油磷酸盐，加或减样品(HS-1141)。没有样品的孔作为对照，这时被定为白天。活性可通过对结节的数量和其相对面积进行测量，示于表II。对形成的结节用图像分析仪(Bikorad Co.，USA)；录像机(SonyCo.)；和显微镜(Leitz Co.)进行分析。
表II 样品 浓度(M) 结节数量(No.) 结节面积(mm2) 对照 - 10.04±1.23 0.12±.026 HS-1141 10-8 22.80±4.71 0.273±0.019 10-9 24.00±4.04 0.379±0.068 10-10 19.40±1.29 0.320±0.082 10-11 25.67±3.54 0.342±0.065
从上述表II可以看出，类骨结节的重造对于HS-1141提高了2倍以上。因而，可以看到，HS-1141可有效地刺激骨的形成。
同时进行了本发明的化合物的毒性试验。
将本发明化合物的样品溶解于蒸馏水中，将所得到的溶液注射入大鼠(5/组)。注射14天后观察死鼠的数目。
本发明化合物的50％致死剂量(LD50)为1克/公斤。
本发明化合物的促进骨重造的浓度低于细胞毒性浓度的10000倍。
因而，本发明的化合物作为骨形成的刺激剂可用于治疗骨质疏松。本发明的效用
从上述实验可以看出，本发明的由式I表示的化合物可有效拮抗LTB-4受体，并刺激骨形成。因而，使用本发明的化合物预期可有效地抑制和治疗与LTB-4或骨质疏松相关的疾病。
本发明的化合物可特别地刺激类骨结节的形成，因而可有效地用于治疗骨质疏松。