治疗药物 【技术领域】
本发明涉及衍生于天然来源物质的生理活性物质的用途。更详细地讲，其涉及生理活性物质、产生这样物质的方法、含有作为活性成分的生理活性物质的药用组合物、食品或饮料、抗氧化组合物、用于保鲜的组合物和化装品组合物。背景技术
最近，称之为编程性细胞死亡(细胞的自体毁灭或自我消灭)的细胞或组织的死亡模式引起了关注。
编程性细胞死亡为在细胞基因组中原始编程的死亡，并且不同于其为病理性细胞死亡的坏死。更详细地讲，认为以下过程导致死亡。由一些外部或内部因素引发起的编程性细胞死亡编程的基因的活化引起程序性死亡蛋白地生物合成。在一些情况中，在细胞中以其非活性形式存在的程序性死亡蛋白被活化。这样生成的活化的程序性死亡蛋白摧毁细胞。
在所要求的组织或细胞中诱导编程性细胞死亡是非常有价值的，因为这使得有可能以自然的方式从生命体内消除不需要的或有害的细胞。本发明的目的
本发明的主要目的是提供衍生于天然来源物质的具有生理功能如编程性细胞死亡-诱导的活性的高度安全的物质，以及所述物质的生产方法和用途。本发明概述
本发明概述如下。本发明第一方面涉及其含有选自以下的化合物作为活性成分的药用组合物：
式(Ⅰ)化合物：其中X和Y为H或CH2OH，条件是当X为CH2OH时，Y为H，而当X为H时，Y为CH2OH；
式(Ⅱ)化合物：其中R为通过从含有SH基团的化合物中游离出SH基团而得到的残基，和它们的盐，
所述组合物用于治疗或预防以下疾病：对于其治疗或预防需要诱导编程性细胞死亡的疾病，癌性疾病，对于其治疗或预防需要抑制活性氧生成的疾病，对于其治疗或预防需要抑制一氧化氮生成的疾病，对于其治疗或预防需要抑制前列腺素合成的疾病，对于其治疗或预防需要抑制滑液细胞增殖的疾病、对于其治疗或预防需要抑制热休克蛋白产生的疾病或对于其治疗或预防需要抑制α-糖苷酶的疾病。疾病。
本发明第二方面涉及生产式(Ⅰ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括在中性至碱性条件下，处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物。
本发明第三方面涉及式(Ⅱ)化合物或它们的盐。
本发明第四方面涉及生产式(Ⅱ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括使式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物反应。
本发明第五方面涉及食品或饮料，这种食品或饮料含有选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物，通过稀释选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物来生产和/或通过向其中加入选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物来生产。
本发明第六方面涉及食品或饮料，这种食品或饮料含有式(Ⅰ)化合物，通过稀释式(Ⅰ)化合物来生产和/或通过向其中加入式(Ⅰ)化合物来生产，所述式(Ⅰ)化合物通过在中性至碱性条件下处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物得到。
本发明第七方面涉及抗氧化组合物，其含有作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。
本发明第八方面涉及食品或饮料，其含有本发明第七方面的抗氧化组合物。
本发明第九方面涉及式(Ⅰ)或式(Ⅱ)的抗氧化化合物。例如化合物可用作(但不局限于)抑制活性氧生成的化合物。
本发明第十方面涉及用于保鲜的组合物，其含有作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。
本发明第十一方面涉及化装品组合物，其含有作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。
本发明第十二方面涉及用于抑制α-糖苷酶的组合物，其含有作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。
本发明第十三方面涉及通过在中性至碱性条件下处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物来产生的编程性细胞死亡-诱导的物质。
本发明第十四方面涉及食品或饮料，这种食品或饮料含有编程性细胞死亡-诱导的物质，通过稀释编程性细胞死亡-诱导的物质来生产和/或通过向其中加入编程性细胞死亡-诱导的物质来生产，所述编程性细胞死亡-诱导的物质是通过在中性至碱性条件下处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物来产生的。
在下文，将参照附图详细解释本发明。绘图的简要描述
图1说明样品2的正相HPLC层析谱。
图2说明保留时间为4.05至4.16分钟的组分的质谱。
图3说明保留时间为4.05至4.16分钟的组分的1H-NMR谱。
图4说明在DGE存在下，在多种培养条件下培养得到的培养基中的NO2浓度。
图5说明其中在预培养期间加入DGE的各种培养条件下通过孵育得到的培养基中的NO2的浓度。
图6说明其中在预培养期间加入DGE的各种培养条件下通过孵育得到的培养基中的前列腺素E2的浓度。
图7说明DGE与GSH之间反应产物的质谱。
图8说明DGE与GSH之间反应产物的1H-NMR谱。
图9说明DGE与GSH之间反应产物的13C-NMR谱。
图10说明在DGE存在下培养时3H-胸腺嘧啶核苷的摄取。本发明的详细描述
如在此使用的3,6-脱水半乳糖意指式(Ⅲ)的3,6-脱水吡喃半乳糖：它的醛式(Ⅳ)：或它的水合物式(Ⅴ)：
此外，它包括其硫酸酯化的衍生物和甲基化的衍生物。可使用不同的表达形式来表示由式(Ⅲ)至(Ⅴ)所表示的化合物的结构。打算使式(Ⅲ)至(Ⅴ)化合物包括由这样的不同表达形式表示的化合物和它们的可能的互变异构体。另外，只要发挥所要求的活性，式(Ⅲ)至(Ⅴ)的构型不局限于特定的某一种。可使用D-型或L-型或它们的混合物。
例如，不加限制通过在低于pH 7的酸性条件下水解和/或酶促消化本发明的含有3,6-脱水半乳糖的物质，能够得到在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物。或者，它能够经化学合成。
在本发明中优选使用的具有3,6-脱水半乳糖的这些化合物包括，例如可溶性糖类，其非还原性末端为除了L-半乳糖-6-硫酸酯的糖，例如除了琼脂二糖和κ-carabiose之外的在其还原性末端具有琼脂二糖、κ-carabiose或3,6-脱水半乳糖的的寡糖。沉香寡糖，即其非还原性末端为L-半乳糖的糖类是非常适合用于前药的。
本发明的含有3,6-脱水半乳糖物质的实例包括(但不局限于)来自于红藻的粘多糖如琼脂、琼脂糖、琼脂胶、海萝聚糖、紫菜聚糖、角叉胶、红藻胶和沙菜糖(hypnean)[Kyoritsu-shuppan公司，“Tatouseikagaku 1-Kagakuhen-(多糖的生物化学1-化学-)，第314页(1969)1。在本发明中使用的含有3,6-脱水半乳糖的物质也包括含有这些多糖的物质。
例如，属于石花菜科(Gelidiaceae)如石花菜(Gelidium amansii)、中肋石花菜(Gelidium Japonicum)、大石花菜(Gelidium Pacifium)、扁平石花菜(Gelidium subcostatum)、鸡毛菜(Pterocladia tenuis)和日本刺盾藻(AcanthopeltisJaponica)的红藻，属于江蓠科(Gracilariaceae)如江蓠(Gracilaria verrucosa)和粗江蓠(Gracilaria gigas)的红藻，属于仙菜科(Ceramiaceae)如二叉仙菜(Ceramium kondoi)和钩凝菜(Campylaephora hypnaeoides)的红藻以及用作琼脂糖和琼脂胶原料的其它的红藻。通常几种藻作为原料以组合的形式使用。通过用热水提取原料藻并然后冷却提取液得到石花菜凝胶。通过冷冻脱水或压缩脱水并干燥，经从石花菜凝胶除去水得到琼脂。琼脂正常含有大约70％的琼脂糖和大约30％的琼脂胶。将琼脂进一步纯化能够制备具有高纯度的琼脂糖。
本发明中使用的含有3,6-脱水半乳糖的物质包括以上提到的原料藻如琼脂、石花菜凝胶、琼脂、纯化的琼脂糖、纯化的琼脂胶和在这些物质的生产过程中得到的中间体产物或副产物。
在太阳下晒干的藻经常用作原料。新鲜的藻和干燥的藻两者均可用于本发明。也可使用其在干燥期间被喷水漂白的藻，所谓的漂白的原料藻。不管藻源，可使用以多种形式包括以条、带、板、线和粉末形式存在的琼脂。能够使用含有多种琼脂糖内容物的具有低纯度或高纯度的纯化的琼脂糖。
琼脂糖为具有其中D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替连接在一起的基本结构的多糖。在该结构中，D-半乳糖的1-位通过β-糖苷键连接到3,6-脱水-L-半乳糖的4-位，并且3,6-脱水-L-半乳糖的1-位通过α-糖苷键连接到D-半乳糖的3-位。通过用稀酸或α-琼脂酶(agarase)温和地水解，该α-1,3-键被选择性地水解[Carbohydr.Res.,66:207(1978)]。通过β-琼脂酶该β-1,4-键被选择性地水解。
角叉菜胶为属于杉海苔科(Gigartinaceae)、红翎菜科(Solieriaceae)、沙菜科(Hypneaceae)等的红藻中含有的多糖。κ-角叉菜胶、入-角叉菜胶和η-角叉菜胶是已知的。κ-角叉菜胶具有基本结构，其中D-半乳糖-4-硫酸酯的1-位通过β-糖苷键连接到3,6-脱水-D-半乳糖的4-位,3,6-脱水-D-半乳糖的1-位通过α-糖苷键连接到D-半乳糖-4-硫酸酯的3-位，并且它们交替重复。λ-角叉菜胶具有基本结构，其中D-半乳糖的1-位通过β-糖苷键连接到D-半乳糖-2,6-二硫酸酯的4-位，D-半乳糖-2,6-二硫酸酯的1-位通过α-糖苷键连接到D-半乳糖的3-位，并且它们交替重复。角叉菜胶作为用于食物的凝胶剂使用。
通过化学的、物理的和/或酶法得到的含有3,6-脱水半乳糖的物质的部分分解产物也能使用本发明的含有3,6-脱水半乳糖的物质。此外，在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物可通过利用化学的、物理的和/或酶法部分分解含有3,6-脱水半乳糖的物质进行制备。
依目的而定，在本发明中可使用含有在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物的纯化的、部分纯化的或粗品的物质。
含有3,6-脱水半乳糖的物质的化学分解方法的实例包括在低于pH7的酸性条件下水解。物理分解方法的实例包括电磁波或超声波辐射。酶消化法的实例包括用水解酶例如琼脂酶和角叉菜胶酶的水解。
对在低于pH7的酸性条件下分解含有3,6-脱水半乳糖的物质的条件不局限于特定的某一种，只要所述分解产生在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物，例如，除了琼脂二糖和κ-carabiose之外的在其还原性末端具有琼脂二糖、κ-carabiose或3,6-脱水半乳糖的化合物。
例如，通过将含有3,6-脱水半乳糖的材料溶解或悬浮于浓度在0.0001至5N的酸中并使该混合物反应几秒至几天之后，生成在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物。通过在反应期间加热该混合物，来缩短生成在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物所需要的反应时间。
任何酸能够用于溶解或悬浮含有3,6-脱水半乳糖的物质。无机酸如盐酸、硫酸和硝酸以及有机酸如枸橼酸、甲酸、乙酸、乳酸和抗坏血酸可被使用。在0.0001至5 N的浓度下不加限制，优选为0.001至1 N的浓度下使用酸。此外，所述反应可在0至200℃(不加限制)，优选在20至130℃的温度下进行。另外，所述反应可进行几秒至几天不加限制。可适宜地选择酸和它的浓度、反应温度和时间。这样的选择依以下因素而定：用作原料的含有3,6-脱水半乳糖的物质如琼脂糖或角叉菜胶，在其相关的还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物如琼脂二糖和κ-carabiose，以及除了琼脂二糖和κ-carabiose外在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物的产率，和除了琼脂二糖和κ-carabiose外在其相关的还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物的聚合度。通过选择强酸而非弱酸、高的酸浓度而非低的酸浓度，及高的温度而非低的温度，通常可使酸分解反应更迅速地进行。
例如，通过将琼脂在10％(重量)的浓度下悬浮于0.1NHCl中并通过在100℃下将琼脂加热13分钟来溶解所得到的酸分解产物不再凝胶化，即使把该溶液冷却至它的凝固点。当用凝胶过滤法HPLC、正相HPLC等分析在溶液中含有的糖类时，几乎观察不到具有高分子量的糖类并且发现大多数糖类分解成为由10或更少的糖构成的可溶性糖类。
例如，在本发明中使用的除了琼脂二糖和κ-carabiose外的其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物为不加限制其中糖连接于羟基(hydroxide)而不是连接在3,6-脱水半乳糖的1-位的化合物。它们的实例包括通过用酸分解或用α-琼脂酶消化琼脂糖如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖和琼脂十糖所得到的产物。此外，通过用酸分解或用角叉菜胶酶消化角叉菜胶所得到的产物也能够被举例说明。此外，在本发明中使用的在它们的还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖和κ-carabiose的化合物包括其中选自以下的一个或多个被连接于羟基而不是连接于3,6-脱水半乳糖的1-位的那些化合物：己糖如葡萄糖、甘露糖和半乳糖、戊糖如木糖、阿拉伯糖和核糖、糖醛酸如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸和gluronic酸、氨基糖如葡糖胺和半乳糖胺、唾液酸如N-乙酰基神经氨糖酸、脱氧糖如岩藻糖、以及它们的酯、酰胺和/或内酯。另外，以下也被定义为在本发明中使用的在它们的还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖和κ-carabiose的化合物：其中丙酮酸酯基团和/或硫酸酯基团连接于琼脂二糖、κ-carabiose的那些化合物或者在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖和κ-carabiose的化合物、以及其羟基被甲基化的化合物。
由于在还原性末端的3,6-脱水半乳糖的1-位碳为端基差向异构体碳，对在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物存在α-异构体和β-异构体。两者在本发明中能够作为其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物被使用。此外，在还原性末端的3,6-脱水半乳糖的1-位具有醛的化合物也能够作为其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物使用。可使用3,6-脱水半乳糖的D-异构体或L-异构体。另外，也能够使用α-异构体、β-异构体和醛的混合物以及D-异构体和L-异构体的化合物。
在中性至碱性条件下，通过处理在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物(例如在其还原性末端具有琼脂二糖、κ-carabiose或3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖和κ-carabiose以外的化合物)，能够得到本发明本发明的编程性细胞死亡-诱导物质。通过在低于pH 7的酸分解和/或酶消化含有3,6-脱水半乳糖的物质，随后通过在中性至碱性条件下处理酸分解和/或酶消化的产物，也能够得到它们。
在pH 7以上的碱性条件下，在处理化合物中，任何碱能够用来溶解或者悬浮至少一种选自在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物的化合物，例如在其还原性末端具有琼脂二糖、κ-carabiose或3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖和κ-carabiose以外的化合物。可以使用无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和铵以及有机碱例如tris、乙胺和三乙胺。在0.0001至5N，优选为0.001至1N不加限制浓度下使用该碱。另外，在0-200℃，优选为20-130℃不加限制的温度下，进行该反应。此外，该反应可进行几秒至几天(不加限制)。可适宜选择碱和它们的浓度、反应温度和时间。这样的选择依以下因素而定：作为原料使用的化合物、相关的编程性细胞死亡-诱导物质的收率。一般通过选择高的碱浓度而不是低的碱浓度(尽管可使用任何高于7的pH)和高的温度而不是低的温度可容易地进行本发明编程性细胞死亡-诱导物质的生成过程。
例如，通过制备在pH11.5下的琼脂二糖和κ-carabiose并在37℃下孵育其5分钟，生成本发明编程性细胞死亡-诱导物质。
依目的而定，可使用在中和之后的含有由此生成的编程性细胞死亡-诱导的物质的碱性溶液或者使用作为pH低于7以下的酸性溶液。
例如，通过使用抑制肿瘤细胞的抗增殖活性作为指标，能够测量本发明编程性细胞死亡-诱导物质的编程性细胞死亡-诱导活性。通过使用活性作为指标，能够纯化本发明编程性细胞死亡-诱导物质。能够使用包括化学和物理方法的已知纯化方法。使用纯化方法如凝胶过滤法、使用分子量分级分膜的分离法、溶剂提取法和使用离子交换树脂的多种层析法或者像这样方法的组合能够纯化所述物质。
通过以上描述的式(Ⅰ)化合物，举例说明以纯化形式存在的本发明编程性细胞死亡-诱导的物质。
例如，通过从在中性至碱性条件下处理琼脂二糖得到的产物中纯化其中X为CH2OH和Y为H的式(Ⅰ)化合物。另一方面，通过从在中性至碱性条件下处理κ-carabiose得到的产物中纯化其中X为H和Y为CH2OH的式(Ⅰ)化合物
在如同以上描述的中性至碱性条件下，通过处理3,6-脱水半乳糖或其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物(例如除了琼脂二糖和k-carabiose之外的在其还原性末端具有琼脂二糖、κ-carabiose或3,6-脱水半乳糖的化合物)，生成本发明所使用的式(Ⅰ)化合物。本发明包括在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物以及目标为发挥其生理活性的3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物的用途。
本发明包括目标在于体内产生本发明式(Ⅰ)化合物活性的前药的用途。具有与器官或组织有亲和力的配体的3,6-脱水半乳糖优选用作前药。在结合进入到细胞中后，这样的前药在生理条件下转化为式(Ⅰ)化合物并发挥多种生理功能。在其它方面中，半乳糖作为配体被举例说明。通过使用半乳糖作为配体，实现对肝组织有效的靶向结合。具有这样配体的化合物包括琼脂寡糖，例如在其非还原性末端具有半乳糖的琼脂二糖、琼脂六糖和琼脂八糖。所述琼脂寡糖用作前药。
人们已长期服用在它们的非还原性末端具有半乳糖的琼脂寡糖。在中性或碱性条件下，在还原性末端的3,6-脱水半乳糖游离并转化为式(Ⅰ)化合物后，琼脂寡糖发挥其生理活性作用。即作为前药吸收进入生命体的琼脂寡糖转化为式(Ⅰ)化合物来发挥其生理活性。琼脂寡糖具有用于其有效吸收的适宜的分子量。因此，它们易于在消化道吸收。此外，在其非还原性末端的半乳糖能够使琼脂寡糖在肝吸收活化并经肝便利其在血流中循环。吸收后，在其对非还原性末端的半乳糖具有亲和性的组织的局部位点上，琼脂寡糖转化为式(Ⅰ)化合物以发挥其生理活性。因此，琼脂寡糖能够作为前药给药，其为高稳定的、有效结合的并以浓集状态在局部位点转化为式(Ⅰ)化合物以发挥其生理活性。
式(Ⅰ)化合物的盐包括药学上可接受的盐。能够使用已知方法将所述化合物转化为盐。
在通过使式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物反应得到的反应混合物中，生成在本发明中使用的式(Ⅱ)化合物。
所使用含有SH基团的化合物的实例包括(但不局限于)甲硫醇、丁硫醇、巯基乙醇、含有SH基团的氨基酸和含有SH基团的氨基酸衍生物。含有SH基团的氨基酸的实例包括半胱氨酸和高半胱氨酸。
含有SH基团的氨基酸衍生物的实例包括以上提及的氨基酸例如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽类和含有半胱氨酸衍生物的肽类。含有半胱氨酸的肽类并不局制于特殊的肽类，只要所述肽含有作为其成分的半胱氨酸。本发明的含有半胱氨酸的肽类包括小分子例如寡肽(如谷胱甘肽)和大分子例如蛋白质。另外，在反应期间生成含有半胱氨酸和高半胱氨酸的肽类的条件下，例如在还原条件下，通过混合处理含有胱氨酸和高胱氨酸的肽类可使其用作本发明的含有半胱氨酸和高半胱氨酸的肽类。含有半胱氨酸的肽类也包括含有糖类、类脂等的含有半胱氨酸的肽类。或者，也可使用如同以上描述的多种物质的盐、酸酐、酯等。
可在已知反应条件下，进行用于生成式(Ⅱ)化合物的式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物之间反应。在其中含有SH基团的化合物的SH基团为反应活性的任何条件下，可进行所述反应。
包括化学和物理方法在内的已知纯化方法能够用于纯化和分离由式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物或它们衍生物反应所生成的式(Ⅱ)化合物。
例如，在体内式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物例如半胱氨酸和谷胱甘肽反应，生成由式(Ⅱ)表示的用作药物的代谢衍生物。因此，也能够通过给予式(Ⅰ)化合物得到经所述代谢衍生物发挥的药物的效力。由此，本发明包括目标在于体内生成式(Ⅱ)化合物的式(Ⅰ)化合物的用途。
式(Ⅱ)化合物的盐包括药学上可接受的盐。已知方法能够用于将所述化合物转化为盐。
在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物以及它们的盐具有以下生理活性，例如编程性细胞死亡-诱导活性、制癌活性、抗氧化活性如抑制活性氧产成的活性、抑制脂质过氧化自由基生成的活性和抑制一氧化氮生成的活性、对病原性微生物的抗微生物活性、抗突变活性、抑制α-糖苷酶活性、免疫调节活性、抑制前列腺素合成活性、抗炎活性、抗变态活性、调节细胞因子生成活性、抗风湿活性、抗糖尿病活性、抑制滑液细胞增殖活性和诱导热休克蛋白生成的活性。基于这些活性，使用选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物以及它们的盐作为活性成分的化合物能够生产用于治疗或预防以下疾病的药用组合物。这样的疾病包括需要诱导编程性细胞死亡以用于其治疗或预防的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧的生成以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制脂质过氧化自由基生成以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制一氧化氮的产生以用于其治疗或预防的疾病、由病原性微生物引起的疾病、由突变原引起的疾病、需要抑制α-糖苷酶以用于其治疗或预防的疾病、需要免疫调节以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制前列腺素合成以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制炎症以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制变态反应以用于其治疗或预防的疾病、需要调控抑制细胞因子的产生以用于其治疗或预防的疾病、风湿病、糖尿病、需要抑制滑液细胞增殖以用于其治疗或预防的疾病和需要诱导热休克蛋白生成以用于其治疗或预防的疾病。换言之，能够生产以下药用组合物：用于诱导编程性细胞死亡的组合物、制癌组合物、抗氧化组合物例如抑制活性氧生成的组合物、抑制脂质过氧化自由基生成的组合物和用于抑制一氧化氮生成的组合物、抗微生物组合物、抗病毒组合物、抗突变组合物、抗高血糖组合物、抗高血脂组合物、免疫调节组合物、用于抑制前列腺素合成的组合物、抗炎组合物、抗变态组合物、调节细胞因子产生的组合物、抑制滑液细胞增殖的组合物、抗风湿组合物、抗糖尿病组合物和用于诱导热休克蛋白产生的组合物。
本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物，其包含选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐作为活性成分，用于消除患有自身免疫疾病的患者的自动反应淋巴细胞、肿瘤细胞、病毒感染的细胞等。通过在要求的组织或细胞中诱导编程性细胞死亡，组合物能够用于消除以自然方式存在的来自生命体的不必要的或有害的细胞。本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物对之有效的疾病的实例包括自身免疫疾病例如系统红斑狼疮、免疫介导的肾小球性肾炎、多发性硬化症和胶原疾病、和风湿症。
本发明的用于诱导编程性细胞死亡的组合物能够用于诱导编程性细胞死亡的方法中。所述方法用于说明编程性细胞死亡的诱导作用机制、以及筛选编程性细胞死亡诱导剂和编程性细胞死亡诱导作用的抑制剂。
酪蛋白酶(caspase)抑制剂如IL-1β转化酶抑制剂V[Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟代甲基酮：Takara Shuzo]能够抑制本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物的编程性细胞死亡-诱导活性。因此，由所述组合物诱导的编程性细胞死亡被认为是由于依赖酪蛋白酶的编程性细胞死亡的细胞死亡。
已证实酪蛋白酶作为对以下原因的编程性细胞死亡的重要介质起作用：在多种细胞死亡之前它会增加；其过度表达诱导细胞死亡。肽抑制剂或抑制蛋白例如CrmA和p35抑制编程性细胞死亡；并且与正常小鼠相比较，编程性细胞死亡在对酪蛋白酶-1或酪蛋白酶-3的剔除小鼠上被部分抑制[Seikagaku(生物化学)，70:14-21(1998)]。即在编程性细胞死亡过程期间半胱氨酸蛋白酶、酪蛋白酶被活化，以降解核蛋白或细胞浆蛋白。酪蛋白酶被首先合成为前体并然后经加工活化。酪蛋白酶活化途径的调节决定细胞的死亡。哺乳动物具有10种或更多类型的酪蛋白酶。上流酪蛋白酶处理下流酪蛋白酶以级联模式增强细胞内蛋白水解活性[Saibo kogaku(细胞技术)，17:875-880(1998)]。相反，使用半胱氨酸蛋白酶、酪蛋白酶抑制剂抑制加工活性能够停止由于酪蛋白酶依赖的编程性细胞死亡的细胞死亡。
在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐用于抑制氧化物质例如活性氧的生成。因此，含有作为其活性成分的化合物的抗氧化剂组合物例如抑制活性氧生成的组合物用于治疗或预防由活性氧的生成和/或过量引起的疾病。
活性氧一般分类为自由基活性氧和非自由基活性氧。自由基活性氧包括羟基自由基、羟基过氧化自由基、过氧化自由基、烷氧基自由基、二氧化氮、一氧化氮(下文称作NO)、硫自由基(thylradical)和超氧化物。另一方面，非自由基活性氧包括单态氧、过氧化氢、脂质过氧化氢、次氯酸、臭氧和过氧化亚硝酸盐。它们全部参与多种病理状态例如各种炎性疾病、糖尿病、癌症、动脉硬化、神经疾病和局部缺血再灌注疾病。
通过生命体内的多种途径，活性氧总是在低浓度下即可产生。因此生成的活性氧是不可避免的并且如下包括：从电子传递系统例如在线粒体中生理渗出的超氧化物和过氧化氢，由过渡金属例如铜和铁催化产生的羟基自由基，通过用于防御感染的中性细胞或单细胞生成的次氯酸和通过精氨酸分解产生的NO。生命体具有消除活性氧的系统，包括酶和抗活性氧生成的小分子化合物，以维持生成与消除之间的平衡。然而，如果生成系统由于某些原因活化或与之相反由于消除系统不活化，所述生成系统超过消除系统占据主导地位时，生命体受到氧化损害。这样的状况被称之为氧化应激。此外，除了内部失去平衡以外，由于外界物质例如大气和食物的原因，生命体总是暴露于氧化应激状态。因此，在每个人的日常生活中，氧化应激是不可避免的。
换言之，生命体总是暴露于导致由氧化应激引起的或者由于氧化应激导致的疾病症状的恶化的环境中，氧化应激与以上描述的多种疾病有关。因此，本发明抗氧化组合物例如抑制活性氧生成的组合物也用于预防或治疗由于氧化应激引起的疾病或者预防由于氧化应激引起的疾病状态的恶化。
脂质过氧化反应总是与氧化应激有关。脂质过氧化自由基一旦生成，反应即可发生。在所述反应生成的4-羟基-2-壬醛(nonenal)(HNE)为有毒性的醛，其特异性针对谷胱甘肽或蛋白质。在多种疾病组织中探测到HNE和蛋白质之间的反应产物并且认为其是与氧化应激有关的疾病状态的诱导剂。相应地，在本发明中使用的含有抗氧化物质(例如选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物)的抗氧化组合物，能够抑制脂质过氧化物自由基，它作为活性成分用于治疗或预防由于氧化应激引起的与老年相关的疾病。
NO为内皮细胞衍生舒血管因子(EDRF)的必需成分[自然，327:524-526(1987)]。本发明提供治疗或预防需要抑制NO的生成以用于其治疗或预防的疾病的药用组合物。
本发明的需要抑制NO的生成以用于其治疗或预防的疾病的实例包括(但不局限于)由中毒性休克、用细胞因子等治疗引起的系统性低血压、血压应答降低、糖尿病、血管机能障碍、疾病引起的血管扩张、组织损伤、心血管局部缺血、痛觉过敏、大脑局部缺血、伴随血管形成的疾病、癌症等。
一氧化氮合成酶(NOS)产生L-瓜氨酸和来自L-精氨酸和氧的NO。对NOSs已知的是为组成型表达的cNOS和为诱导型的iNOS。通过用细胞毒素或细胞因子例如LPS和IFN-γ刺激来诱导iNOS，以在巨噬细胞等中生成NO。iNOS本身对维持有机体的系统是必需的。另一方面。已证实当iNOS由于多种因素过度表达时，它引起多种疾病并产生过量的NO。
本发明人已证实式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐抑制iNOS的表达。通过使用Western印迹试验在蛋白水平上并通过使用RT-PCR在信使RNA水平上进行以上证实。因此，选自在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物抑制iNOS的表达，其是由于多种因素过度表达的，并导致过量的NO产生。由此，所述化合物在治疗和预防需要抑制NO的产生以用于其治疗和预防的疾病中是有效的。
在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐抑制巨噬细胞中NO的生成。因此，它们用于治疗和预防在巨噬细胞中由NO产生、致癌作用等引起的疾病。通过在本发明中使用的化合物抑制NO生成并不拮抗性抑制NO生成的诱导剂，例如LPS和IFN-γ。当预先加入在本发明中使用的化合物时，可增强抑制NO生成的作用。因此，作为用于预防抗氧化物质生成的组合物的活性成分，选自在本发明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物是非常有用的。
本发明的用于抑制NO生成的组合物对研究NO生成的机制和NO的作用模式是有用的并且能够用于筛选参与NO生成机制的物质。
血管形成对实体肿瘤生长是必需的。血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF)在该过程中起重要作用。NO在多种肿瘤细胞中诱导VEGF。通过抑制NO生成且由此抑制癌细胞周围的血管形成，本发明用于抑制NO生成的组合物也抑制肿瘤细胞中VEGF的生成。当把本发明用于抑制NO生成的组合物给予其中已将肿瘤细胞皮下植入以形成实体癌的小鼠时，癌组织周围的血管形成变得不充分并且癌脱落。
亚硝胺为一系列其中亚硝基连接于仲胺的化合物。本领域已知的几百种类型的亚硝胺中许多种物质在动物上通过损害它们的DNA显示致癌活性。亚硝胺被认为与人体的致癌作用具有很深的关系。通过在胃中的亚硝酸盐与胺的反应生成亚硝胺。在中性pH下，NO通过与处于生理条件下的胺反应产生亚硝胺。在患有华支睾吸虫病或肝硬变的患者中，NO的生成增加，其在流行病学方面与癌症具有高度相关性。因此，通过给予本发明用于抑制NO生成的组合物以预防NO生成的增加，尤其能够预防高风险基团的致癌性。如同以上描述的那样，本发明用于抑制NO生成的组合物以两个步骤显示它们的抑制癌的活性，即抑制致癌作用和抑制癌组织中血管形成。
在本发明中使用的化合物由于两种协同作用而发挥其制癌活性。一种是诱导编程性细胞死亡以杀死肿瘤细胞的直接作用，另一种是通过抑制涉及由NO诱导的VEGF的血管形成迫使肿瘤细胞死亡的间接作用，该作用通过抑制在肿瘤细胞中NO的产生来完成。
NO也诱导在炎症病灶显著观察到的水肿。换言之，其增加血管通透性[Maeda等，日本癌症研究杂志，85:331-334(1994)]。NO增加为炎性介质的前列腺素的生物合成[Salvemini等，Proceedings of National Academy of Sciences,USA,90:7240-7244(1993)]。另一方面，NO迅速与超氧化物自由基反应，生成过氧化亚硝酸盐离子。该过氧化亚硝酸盐离子被认为引起细胞和组织的炎性损伤。
当活化的免疫细胞进入器官并释放细胞因子时，诱导产生NO。通过特异性破坏β细胞引起胰岛素依赖的糖尿病，这种破坏被认为是由NO引起的。在患有类风湿性关节炎、骨质疏松、痛风性关节炎或与培吉特氏病有关的关节炎患者的病灶中滑液流体含有比相同患者的正常关节或者健康个体的关节更高浓度的NO。当把本发明的抑制NO产生的组合物给予这样的患者时，抑制了在所述病灶中NO的生成，从而导致疾病症状态改善。
在大脑缺血期间和再灌注后，NO生成增加，导致脑组织损伤。在大脑局部缺血期间，将本发明用于抑制NO生成的组合物给予患者缓解脑组织损伤并改善其预后。
花生四烯酸代谢极大地参与炎症的发生和组织损伤。通过环加氧酶的作用，细胞膜上衍生于磷脂的花生四烯酸在体内代谢为前列腺素、前列环素和血栓烷。在它们当中，前列腺素具有血管扩张活性并导致流至器官血流增加的活性。特别是由于它们的增加血流的活性，前列腺素E2和I2增加水肿和白细胞在炎症部位的浸润。因此，通过给予本发明用于抑制前列腺素E2合成的组合物来抑制前列腺素的生物而合成发挥镇静和抗炎活性。此外，白细胞浸润进入炎症部位产生活性氧和引起氧化应激症状。因此，抑制前列腺素生物合成的本发明用于抑制前列腺素E2合成的组合物也用于预防、治疗或者用于预防如同以上描述的由氧化应激引起的多种疾病的恶化。
另外，NO诱导在炎症病灶显著观察到的水肿，即增加血管通透性和增加为如上描述的炎性介质的前列腺素的生物合成。本发明抑制NO生成的作用和抑制前列腺素E2合成的作用发挥协同效果以显示镇静和抗炎活性以及在预防、治疗或者预防由氧化应激引起的多种疾病恶化中起协同作用。本发明的免疫调节组合物具有免疫调节活性例如抑制淋巴细胞的胚细胞样转化活性(blastogenesis)和抑制混合型淋巴细胞反应的活性。因此，本发明的免疫调节组合物作为治疗或预防由于免疫系统或免疫因子异常引起的疾病的药用组合物是有用的。
淋巴细胞胚细胞样转化为一种其中促分裂原结合于淋巴细胞表面的受体以活化淋巴细胞并且促进其分化与增殖的反应。混合的淋巴细胞反应为一种其中从冷血动物得到的淋巴细胞被混合并培养，由此诱导由于主要的组织相容性抗原的不相容性导致的淋巴细胞活化以促进淋巴细胞分化与增殖的反应。本发明免疫调节组合物抑制这些反应并特别用于治疗或预防由于淋巴细胞异常增加引起的慢性疾病，例如自身免疫疾病如慢性肾炎、慢性结肠炎、Ⅰ型糖尿病和类风湿性关节炎并且也用于抑制移植排斥反应。
式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐具有诱导热休克蛋白例如70-kDa热休克蛋白(HSP70)的活性。它们具有对RNA病毒和DNA病毒例如肝炎病毒、AIDS病毒、流感病毒、疱症性口腔炎病毒和疱疹病毒的抗病毒活性。热休克蛋白参与肿瘤免疫。因此，这些化合物对于肿瘤免疫也是有效的。另外，热休克蛋白参与生物防御包括抗炎作用。因此，通过给予式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐能够预防或治疗病毒疾病例如由于流感病毒引起的感冒。
通过使用选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物作为其活性成分的并且与已知的药用载体一起配制，能够制备本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物。该组合物一般与药学上可接受的液体或固体载体并且任选与溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等一起混合来配制它。该制剂可以固体制剂例如片剂、颗粒剂、散剂、粉剂和胶囊剂或者以液体制剂例如正常溶液剂、混悬剂和乳剂的形式存在。另外，该组合物可配制成为干燥制剂，其临用前通过加入适宜的载体能够重新配制成为液体制剂。
本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物能够作为口服制剂或非肠道制剂例如注射制剂和滴剂给药。
按照以上提及的特别的给药途径和剂型可以选择药用载体。对口服制剂，使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在口服制剂中也可以包括粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流体促进剂、调味剂、着色剂、矫味剂等。
按照常规方法，通过将本发明活性成分即选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物溶解或者悬浮于稀释剂中来制备非肠道制剂，这些稀释剂包括注射蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇和聚乙二醇。可任选将灭菌剂、稳定剂、等渗调节剂、平滑剂等加入到溶液或混悬液中。
通过对组合物的剂型适宜的途径给予本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物。给药途径不局限于特殊的途径。经内部或外部(或局部)或者经注射给予所述组合物。例如，能够经静脉、肌内、皮下、皮内等给予注射制剂。外用制剂包括栓剂。
适当确定本发明用于诱导编程性细胞死亡的组合物的剂量并且依照具体剂型、给药途径和目的以及所治疗患者的年龄、体重和症状而变化。根据在制剂中含有的活性成分的量，成人每天剂量一般为10μg至200mg/kg。当然，剂量能够依照多种因素变化。因此，在一些情况下，比以上更小的剂量可能是足够的，但是在另一些情况下，可能需要比以上更多的剂量。本发明的药用组合物可以其本身那样口服给药，或者能够通过加入到选择的日常食物和饮料中服用。
通过使用作为其活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物并且其与已知的药用载体一起配制，能够制备本发明制癌组合物。按照如同以上描述的与诱导编程性细胞死亡的组合物的相同方法制备制癌组合物。
通过对所述组合物剂型适宜的途径给予制癌组合物。给药途径不局限于特殊的途径。内部或外部(或局部)或者经注射给予组合物。例如，静脉、肌内、皮下、皮内等给予注射制剂。外用制剂包括栓剂。
适当确定制癌组合物的剂量并且依照具体剂型、给药途径和目的以及所治疗患者的年龄、体重和症状而变化。根据在制剂中含有的活性成分的量，成人每天剂量一般为10μg至200mg/kg。当然，剂量能够依照多种因素变化。因此，在一些情况下，比以上更小的剂量可能是足够的，但是在另一些情况下，可能需要比以上更多的剂量。本发明的药用组合物可以其本身那样口服给药，或者其能够通过加入到选择的日常食物和饮料中服用。
风湿病是一种其中骨细胞和软骨细胞被损害的自身免疫疾病。式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐在滑液细胞上具有编程性细胞死亡-诱导活性。因此，通过使用作为其活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物并与已知药用载体一起配制，能够制备抗风湿组合物。按照以上描述的相同方法，能够制备抗风湿组合物。
抗风湿组合物能够作为口服制剂或非肠道制剂例如注射制剂和滴剂给药。
按照以上提及的具体给药途径和剂型能够选择药用载体并且可按照以上描述的与诱导编程性细胞死亡有关的组合物的相同方法使用。
通过对所述组合物剂型适宜的途径给予抗风湿组合物。给药途径不局限于特殊的途径。可以内用或外用(或局部)或者经注射给予组合物。例如，静脉、肌内、皮下、皮内等给予注射制剂。外用制剂包括栓剂。
适当确定含有作为其活性成分选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物的抗风湿组合物的剂量并且依照具体剂型、给药途径和目的以及所治疗患者的年龄、体重和症状而变化。根据在制剂中含有的活性成分的量，成人每天剂量一般为0.01至50mg，优选为0.1至10mg。当然，剂量能够依照多种因素变化。因此，在一些情况下，比以上更小的剂量可能是足够的，但是在另一些情况下，可能需要比以上更多的剂量。本发明药用组合物可以以其本身那样口服给药，或者能够通过加入到选择的食物和饮料中日常服用。
另外，通过使用作为其活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物，按照如同以上描述的与诱导编程性细胞死亡的组合物有关的相同方法制备以下组合物：抗氧化组合物、用于抑制活性氧的生成的组合物、用于抑制脂质过氧化自由基生成的组合物、用于抑制NO生成的组合物、对病原性微生物的抗微生物组合物、抗突变组合物、用于抑制前列腺素合成的组合物、用于抑制滑液细胞增殖的组合物、用于诱导热休克蛋白的组合物和抗病毒组合物。依疾病而定可使用如上所述的与诱导编程性细胞死亡有关的组合物的相同剂量和给药途径。
式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐对多种α-糖苷酶例如蔗糖酶和麦芽糖酶显示抑制活性。因此，使用作为活性成分的式(Ⅰ)化合物能够制备抗高血糖组合物、抗高血脂组合物、抗肥胖组合物、抗糖尿病组合物等。按照与上述用于诱导编程性细胞死亡的组合物有关的相同方法能够制备这样的药用组合物。依疾病而定能够使用以上描述的与用于诱导编程性细胞死亡的组合物有关的相同剂量和给药途径。按照常规方法，使用作为其活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物，能够制备用于抑制-糖苷酶的组合物。使用抑制α-糖苷酶的组合物，能够进行抑制α-糖苷酶的方法。
本发明提供含有选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物的食品或饮料，这些饮料或食品可通过稀释所述化合物来生产和/或通过向其中加入所述化合物来生产。本发明的食品或饮料具有诱导编程性细胞死亡的活性、制癌活性、抗氧化活性、对病原性微生物的抗微生物活性、抗突变活性、抑制前列腺素合成活性、诱导热休克蛋白产生的活性、抗病毒活性、抑制α-糖苷酶活性等。因此，它对改善以下疾病状态和预防对选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物敏感的疾病是非常有用的，所述疾病包括：例如需要诱导编程性细胞死亡以用于其治疗或预防的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧的产生以用于其治疗或预防的疾病、需要抑制NO产生以用于其治疗或预防的疾病、由病原性微生物引起的疾病、由突变原、前列腺素合成等引起的疾病、需要诱导热休克蛋白生成以用于其治疗或预防的疾病、病毒性疾病、需要抑制α-糖苷酶以用于其治疗或预防的疾病。
用于生产本发明食品或饮料的方法不局限于具体的方法。可以使用任何方法包括用于生产食品和饮料的烹饪、加工和其它一般使用的方法，只要生成的食品或饮料包含，通过向其中加入来生产的和/或通过稀释来生产的，作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。
例如，在食品或饮料的生产中，在中性至碱性条件下，通过处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端含有3,6-脱水半乳糖的化合物，得到式(Ⅰ)化合物。通过在酸性条件下水解或酶消化具有3,6-脱水半乳糖的物质，得到3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物。
例如，琼脂、琼脂糖和/或角叉菜胶能够用作含有3,6-脱水半乳糖的物质。至少一种选自琼脂二糖、κ-carabiose和在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的除了琼脂二糖、κ-carabiose之外的化合物能够用作在其还原性末端含有3,6-脱水半乳糖的化合物。
在食品或饮料的生产中，本发明食品或饮料也包括含有式Ⅱ化合物的食品和饮料，它们是通过稀释和/或通过向其中加入通过式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物之间的反应生成的式(Ⅱ)化合物来生产的。
本发明的食品或饮料不局限于特殊的食品或饮料并且它们的实例包括如下：加工谷类食物的产品(例如麦粉产品、淀粉产品、预先混合的产品、面条、通心粉、面包、豆酱、荞麦面条、麦麸面包、大米面条、凝胶面条和包装大米饼)、加工脂肪和油类的产品(例如软化脂和油、拌面油(tempura oil)、沙拉油、蛋黄酱和调味品)、加工的豆类产品(例如豆腐、日本豆酱和发酵豆类产品)、加工的肉类产品(例如火腿、熏猪肉、压制的火腿和香肠)、加工的海产品(例如冷冻底栖鱼类、煮熟的鱼酱、煮熟的鱼酱的管状卷饼、底栖鱼类做的饼、鱼酱炸馅饼、鱼丸、腱、鱼肉火腿和香肠、熟鲣鱼干、加工的鱼卵产品、罐头海产品和在甜味酱油中煮熟的鱼)、日常产品(例如生奶、奶油、酸奶、黄油、干酪、炼乳、奶粉和冰淇淋)、加工蔬菜和水果产品(例如糊、果酱、腌菜、果汁、蔬菜饮料和混合饮料)、糖果(例如巧克力、饼干、甜小圆面包、蛋糕、米糕甜食和大米甜食)、酒精饮料(例如沙淇酒、中国酿酒(Chinese liquor)、葡萄酒、威士忌、蒸馏酒、伏特加、白兰地、杜松子酒、郎姆酒、啤酒、软酒精饮料、果酒和甜酒、奢侈品饮料(例如绿茶、茶、乌龙茶、咖啡、软饮料和乳酸饮料)、调味品(例如酱油、酱汁、醋和甜米酒)、罐装、瓶装或袋装食品(例如各种烹调食品如用烹调的牛肉和蔬菜形成顶部配料(topped)的大米饭、在小锅中与肉和蔬菜一起煮沸的大米饭、与红豆一起汽蒸的大米饭和咖喱食品)、半干或浓缩食品(例如肝糊、其它的涂抹食品、用于荞麦面条或udon的汤和浓缩的汤)、干食品(例如速食面条、速食咖喱食品、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食日本豆酱汤、烹调食品、烹调饮料和烹调的汤)、冷冻食品(例如日本式肉片火锅、咀嚼玉米粥、烤鳗、碎牛肉、烧麦、用绞碎猪肉填塞的汤团、各种棒状食品和水果鸡尾酒)、固体或液体食品(例如汤)、加工的农业或森林产品(例如香料)、加工的家畜产品、加工的海产品等。
本发明食品或饮料含有显示其生理功能的量的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和及其盐的化合物，所述食品或饮料是通过稀释和/或通过向其中加入选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和及其盐的化合物来生产的，它们的形式不局限于特殊的形式。所述食品或饮料可以是任何食用的形式如片剂、颗粒剂和胶囊剂。
本发明食品或饮料含有选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物，它们具有生理活性。在摄取食品或饮料时，化合物的生理功能如编程性细胞死亡活性和制癌活性提供预防癌症的作用、抑制癌症的作用等。即本发明食品或饮料为具有改善对式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐敏感的疾病状态或预防对式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐敏感的疾病的健康食品或饮料。它们特别用于保持胃肠道的健康。
另外，通过稀释来生产的和/或通过向它们加入来生产的，含有选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物的食品或饮料用作基于化合物抑制α-糖苷酶活性的抗高血糖、抗糖尿病、抗肥胖或抗高血脂的食品或饮料。
另外，式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐具有抗氧化活性如抑制活性氧生成的活性和抑制脂质过氧化自由基生成的活性。因此，它们能够作为抗氧化组合物用于抗氧化食品或饮料的生产中，所述抗氧化食品或饮料包括如抑制活性氧生成的组合物、用于抑制脂质过氧化自由基生成的组合物和用于抑制NO生成的组合物。
本发明抗氧化组合物制剂含有至少一种选自以上提及的化合物作为活性成分的化合物不局限于具体的某种化合物。按照常规方法，所述组合物能够适宜于配制成例如粉剂、糊剂、乳剂等，这取决化合物被加入到的食品或饮料。通过使用本发明抗氧化组合物，能够被便利地生产含有作为活性成分用于本发明化合物的食品或饮料。
本发明提供由式(Ⅰ)或式(Ⅱ)表示的抗氧化作用的化合物。
例如，通过在中性至碱性条件下处理经低于pH7的酸性条件下的酸性分解和/或酶消化含有3,6-脱水半乳糖的物质，能够得到由式(Ⅰ)表示的抗氧化作用化合物。能够使用纯化的和部分纯化的物质。
能够使用的含有3,6-脱水半乳糖的物质的实例包括那些衍生于藻如琼脂、琼脂糖和/或角叉菜胶。
通过使式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物反应，能够得到由式(Ⅱ)表示的用于抗氧化作用的化合物。能够使用纯化的和部分纯化的物质。
本发明用于抗氧化作用的化合物用于消除或抑制生命体中氧化剂如活性氧的生成。因此，所述化合物用于改善由活性氧产生和/或过量引起的疾病状态或预防由活性氧产生和/或过量引起的疾病。
如同以上描述的那样，当生命体内用于生成活性氧的系统超过排除系统变得占据主导地位时，通过氧化损害生命体生成的氧化应激参与多种疾病过程。因此，生命体总是暴露于导致由氧化应激引起的疾病或疾病症状恶化的环境中。因而，每天服用适宜量的抗氧化物质以用于预防、治疗或预防由氧化应激引起的疾病恶化是需要的。对每天摄取适宜量的抗氧化物质而言，要求人们从食物和/或饮料中摄取。含有通过稀释来生产的和/或通过向其中加入本发明抗氧化化合物来生产的食品或饮料作为抗氧化的食品或饮料或者抗氧化应激的食品或饮料是非常有用的。
本发明中使用的化合物也具有保留水分的能力。因此，它能够用作生产抗便秘组合物以及抗便秘食物或饮料的活性成分。
本发明还提供含有选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物作为其活性成分的化妆品组合物。
可将含有以上提及的化合物作为活性成分的化妆品组合物配制成以下形式：基底化妆品组合物如雪花膏、乳液、洗液、洁面剂和面膜、化装用化妆品如唇膏和粉底、体皂、肥皂等。所述化合物对头发也是有用的。本发明化妆品组合物能够以护发产品的形式生产，例如，头发产品如生发油、美发液、固发洗液、梳理头发剂、发乳和发发套，以及头发化妆用品如香波、护发素和滋发剂。依其漂白、润湿或抗氧化活性而定，能够适当测定化妆品组合物中混合的化合物的量。至于化妆品组合物中的其它成分，可以使用那些在日常化妆品组合物中混合的成分。通过常规方法如那些在JP-A8-310937中描述的方法，能够测定漂白活性和润湿活性。
本发明化妆品组合物具有基于以下活性的优良性质，包括：在皮肤上的漂白活性、润湿活性、抗氧化活性、抑制活性氧生成的活性和抗氧化应激活性，以及在头发上的润湿活性、抗氧化活性、抑制活性氧生成的活性和抗氧化应激活性等。
本发明提供用于保鲜的组合物，其含有作为活性成分的选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物。式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐具有抗氧化活性、保鲜活性、抑制酪氨酸酶活性、抗病理性微生物活性和抗突变活性。因此，通过使用选自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐的化合物作为活性成分，能够按照已知的配制方法制备用于食物防腐保鲜的组合物，其有效防止食物颜色变化、腐烂、氧化作用等。本发明用于保鲜的组合物对保持各种食物、容易腐烂的食物、加工食物等的味道和新鲜是非常有用的。
按照本发明，使用在中性至碱性条件下经处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的化合物(在下文简单称为编程性细胞死亡-诱导物质)生成的编程性细胞死亡-诱导物质作为活性成分，能够产生诱导编程性细胞死亡的组合物。按照如同以上描述的与用于诱导编程性细胞死亡的组合物相同方法，可制备这样的组合物。
本发明的含有编程性细胞死亡-诱导物质作为其活性成分的诱导编程性细胞死亡组合物的剂量被适当测定并且依具体剂型、给药途径和目的以及受到治疗的患者的年龄、体重和疾病而变化。按照包含在制剂中的活性成分的量，一般成人每天剂量为10μg至200mg/kg。当然，所述剂量能够依多种因素而变化。因此，在一些情况下，低于以上剂量的剂量可能是足够的，而在另一些情况下，则可能需要高于以上剂量的剂量。本发明药用组合物可如其本身那样口服给予，或者通过将其加入到所选择的食品或饮料中来服用。
含有本发明的编程性细胞死亡-诱导物质作为其活性成分的诱导编程性细胞死亡组合物对肿瘤细胞具有抗增殖活性。因此，使用本发明的编程性细胞死亡-诱导物质作为活性成分，能够制备制癌组合物。
按照如同以上描述的与用于诱导编程性细胞死亡的组合物相同的生产方法，剂量和给药途径能够用于含有本发明的编程性细胞死亡-诱导物质作为活性成分的制癌组合物。
本发明的编程性细胞死亡-诱导物质能够用作治疗癌症等的药用组合物。使用由本发明的编程性细胞死亡-诱导物质作为活性成分表示的化合物诱导编程性细胞死亡的方法用于研究生物学防御机制、癌症等以及用于开发诱导编程性细胞死亡的抑制剂。
本发明的食品和饮料含有有效量的发挥其生理活性的物质，这些食品和饮料含有本发明的编程性细胞死亡-诱导物质，通过稀释本发明编程性细胞死亡-诱导物质来生产和/或通过向其中加入本发明的编程性细胞死亡-诱导物质来生产。生产本发明食品或饮料(例如用于诱导编程性细胞死亡的食品或饮料或制癌食品或饮料)的方法不局限于特殊的方法。可采用任何包括烹调、加工和其它一般使用的用于生产食品或饮料的方法只要得到的食品或饮料含有有效量的用于发挥编程性细胞死亡-诱导活性或制癌活性的本发明编程性细胞死亡-诱导物质。所述食品或饮料含有本发明的编程性细胞死亡-诱导物质，这些食品和饮料是通过稀释和/或通过向其中加入本发明的编程性细胞死亡-诱导物质来生产的，所述编程性细胞死亡-诱导物质是在食品或饮料生产中通过在超过pH 7的碱性条件下处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的原料生成的。
至于本发明食品或饮料含有本发明的编程性细胞死亡-诱导物质，或是通过向其中加入和/或通过稀释本发明的编程性细胞死亡-诱导物质来生产，它们的形式不局限于特殊的形式。所述食品或饮料可以是任何食用的形式如片剂、颗粒剂和胶囊剂。
本发明食品或饮料含有编程性细胞死亡-诱导活性和制癌活性。因此，它们对改善消化器官的疾病状态或预防消化器官的癌症等是非常有用的。
当在100 mg/kg的单次剂量下口服给予小鼠本发明式(Ⅰ)化合物、或式(Ⅱ)化合物、或它们的盐和编程性细胞死亡-诱导物质时，未观察到死亡。
如同以上描述的那样，基于它们的多种生理功能，本发明的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、它们的盐和编程性细胞死亡-诱导物质在包括医药、食品和饮料的广泛领域中是非常有用的。
在高于pH7的碱性条件下，经处理3,6-脱水半乳糖和/或在其还原性末端具有3,6-脱水半乳糖的原料而人工生成的本发明式(Ⅰ)化合物和/或编程性细胞死亡-诱导物质在食品或饮料生产中的用途也包括在本发明中。
在食品或饮料中生成的或者作为式(Ⅰ)化合物与含有SH基团的化合物如含有SH基团的氨基酸或它们的衍生物如半胱氨酸或含有半胱氨酸的氨基酸衍生物(例如谷胱甘肽)之间的反应产物而人工生成的式(Ⅱ)化合物的用途也包括在本发明中。
以下实施例进一步详细说明本发明，但不打算对本发明范围构成限制。
实施例1：L-甘油基-1,5-环氧-1αβ,6-二羟基-顺式-己-3-烯-2-酮(DGE)和D-甘油基-1,5-环氧-1αβ,6-二羟基-顺式-己-3-烯-2-酮(κ-DGE)的制备
(1)将2.5g的市售琼脂(AgarNoble,Difco)悬浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下把悬浮液加热13分钟以制备溶液。在冷却至室温并用NaOH将pH调节至大约中性pH后，将该溶液通过Cosmonice滤膜过滤并如下在正相HPLC上分离。
柱：TSK凝胶Amide-80(21.5mm × 300mm,Toso)
溶剂A:90％乙腈水溶液
溶剂B:50％乙腈水溶液
流速：5ml/min。
洗脱法：从溶剂A至溶剂B(80分钟)→溶剂B(20分钟)的线形梯度
检测：在195nm下的吸光度
所使用样品的量：2ml
收集保留时间为66.7、78.5或85.5分钟的峰并进行质谱分析。揭示这些物质分别为琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖。将如同以上描述的在HPLC上的重复分离8次。在减压下，将由此分离得到的部分蒸发至干，分别得到122mg琼脂二糖、111mg琼脂四糖和55mg琼脂六糖。
(2)将12μl的1NNaOH加入到在实施例1-(1)中得到的600μl100mM琼脂二糖水溶液(样品1)中，以调节pH至11.5。在37℃下，将溶液孵育5分钟。然后向溶液中加入12μl的1NHCl以调节pH至大约5(样品2)。向50μl溶液中另外加入1μl的1NHCl以调节pH至大约2(样品3)。
样品1至3的编程性细胞死亡-诱导活性的对肿瘤细胞的抗增殖活性测量如下。结果，每一个样品对肿瘤细胞具有几乎等值的抗增殖活性。
将样品1至3分别经过滤灭菌并用灭菌水适当稀释。将10μl每种稀释液置于96孔微量滴定板的孔中。向其中加入已在56℃下处理30分钟的含有10％小牛血清(Gibco)的90μl RPMI1640培养基(Nissui)和5,000HL-60细胞(ATCC CCL-240)。在5％CO2存在下，于37℃下将板孵育48小时。在光学显微镜下检查细胞形态学。向其中另外加入在磷酸盐缓冲的盐水中的10μl5mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(Sigma)并继续孵育另外4小时。向孔中加入100μl含有0.04NHCl的2-丙醇并将混合物充分搅拌。测量在590nm下的吸光度以确定细胞生长水平。
(3)如同在实施例1-(2)所述，将样品1至3点样到硅胶板60F254(Merck)上并使用乙醇∶1-丁醇∶水=5∶5∶1展开。然后向板上喷淋地衣酚-硫酸试剂以检测斑点。结果，对样品2或样品3未观察到琼脂二糖斑点，伴随观察到几个新斑点。
将10μl的每一个样品1和2如下在正相HPLC上进行分离。
柱：PALPAK Type S(4.6 × 250mm,Takara Shuzo)
流动相A:90％乙腈水溶液
B:50％乙腈水溶液
流速：1ml/min。
洗脱：流动相A(10分钟)→从流动相A至流动相B(40分钟)的线性梯度→流动相B(10分钟)
检测：在195nm下的吸光度
柱温：40℃
结果，对样品2未观察到对样品1所观察到的琼脂二糖峰，而观察到多个新峰。将样品2的各峰进行收集，减压下蒸发至干并溶于水中。用与以上描述的相同的方式测量每一个流分(fraction)对肿瘤细胞的抗增殖活性。结果，保留时间为4.05至4.16分钟的流分中存在活性。
这些结果显示于图1中。图1说明了样品2的正相HPLC色谱图。在图1中，横轴表示保留时间(分钟)，纵轴表示吸光度。
(4)按照在实施例1-(2)中描述的方法，由实施例1-(1)中制备的琼脂四糖和琼脂六糖以及用0.1N盐酸分解κ-角叉菜胶得到的产物制备的κ-carabiose生产碱处理的制剂。然后如同在实施例1-(2)中描述的那样测量它们对肿瘤细胞的抗增殖活性。结果，对每一种碱处理的制剂观察到对肿瘤细胞的抗增殖活性。
如下制备κ-carabiose。
将2.5g的κ-角叉菜胶(Sigma,C-1263)悬浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下将悬浮液加热16分钟以制备溶液。将该溶液冷却至室温，用NaOH中和至大约中性pH，通过Cosmonice滤膜过滤并如同在实施例1-(3)中描述的那样在正相HPLC上分离。在洗脱时间为27.8分钟时，收集含有κ-carabiose的流分并减压下蒸发至干，以制备κ-carabiose。
(5)将2.5g市售琼脂(AgarNoble)悬浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下将悬浮液加热13分钟以制备溶液。将该溶液冷却至室温。用NaOH将pH调节至12。然后中和溶液。
如同在实施例1-(3)中描述的那样，将中和的溶液经历正相HPLC。收集各峰，减压下蒸发至干并溶于水中。如同以上描述的那样，测量各流分对肿瘤细胞的抗增殖活性，证实了保留时间为4.05至4.16分钟的流分的抗增殖活性。此外，观察到编程性细胞死亡体的形成。
其次，大量收集保留时间为4.05至4.16分钟的流分以制备用于结构分析的样品。
然后使用DX302质谱仪(Nippon Denshi)进行快速原子轰击质谱法(FAB-MS)。此外，将样品溶于重二甲基亚砜中并经核磁共振(NMR)进行结构分析。
在图2中说明保留时间为4.05至4.16分钟的流分的质谱。在图3中说明保留时间为4.05至4.16分钟的流分的1H-NMR谱。在图2中，横轴表示m/z值和纵轴表示相对强度(％)。在图3中，横轴表示化学位移值(ppm)和纵轴代表信号强度。
FAB-MS:m/z 145[M+H]+
将样品溶于重二甲基亚砜中。甘油用作测量基质。1H-NMR:δ3.50(1H,m,6-H),3.59(1H,m,6-H),4.52(1H,m,5-H),4.95(1H,d,J=5.0Hz,1-H),5.02(1H,t,J=6.0Hz,6-OH的H),6.05(1H,dd,J=2.5,10.5Hz,3-H),7.20(1H,dd,J=1.5,10.5Hz,4-H),7.35(1H,d,J=5.0Hz，1-OH的H)
这些结果假定重二甲基亚砜的残留质子的化学位移值表示为2.49ppm 。
对1H-NMR中信号鉴定的编号如同在下式中所指明的那样。
从这些结果来看，它揭示出保留时间为4.05至4.16分钟的部分含有L-甘油基-1,5-环氧-1αβ,6-二羟基-顺式-己-3-烯-2-酮(下文简称为DGE)。
相似地，如在该实施例中上述的那样，用碱处理κ-carabiose。用与以上描述的相同方式，从碱处理的制备中纯化为编程性细胞死亡-诱导物质的D-甘油基-1,5-环氧-1αβ,6-二羟基-顺式-己-3-烯-2-酮(下文称作κ-DGE)。
(6)将45g琼脂粉末(Nacalai Tesque)悬浮于400ml蒸馏水中。向悬浮液中加入4.1ml的11NHCl和蒸馏水至450ml。在90℃下，将生成的酸性悬浮液加热35分钟。用10N NaOH中和加热的酸性溶液。将2.7ml的1N NaOH进一步加入其中。在37℃下，于碱性条件下将该溶液孵育15分钟。用1N HCl中和碱处理过的溶液，并然后使用蒸发器浓缩至150ml。用等体积的乙酸乙酯把浓缩物提取10次。收集来自十个回合的提取的乙酸乙酯相，使用蒸发器浓缩至2ml，并然后溶于20ml氯仿∶甲醇=9∶1中。在下述条件下，以硅胶柱层析法分离生成的溶液：柱体积：250ml；流量压力：0.2Kgf/cm2；流动相溶剂：氯仿∶甲醇=9∶1；和流分体积：8ml。在薄层层析上分析每一个流分的组成(用氯仿∶甲醇=9∶1展开)。收集仅含有Rf值大约为0.25斑点的流分52至78作为含有DGE的流分，使用蒸发器，将其浓缩至2ml。如同以上描述的那样，再次将浓缩物经历硅胶柱层析法。收集作为含有DGE流分的流分64至96，使用蒸发器浓缩，并然后溶于8ml蒸馏水中。冷冻干燥DGE水溶液，得到113mg的DGE制剂。
实施例2：编程性细胞死亡诱导试验
(1)在37℃下，于含有10％小牛血清(JRH)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker)上培养HL-60细胞，其中细胞已在56℃下处理30分钟，并以2.5 × 105细胞/4.5ml的浓度于RPMI 1640培养基上悬浮。
将在125μM、250μM、500μM、1mM、2mM或4mM的500μl的DGE水溶液加入到4.5ml的悬浮液中。在5％CO2存在下，在37℃下将混合物孵育24小时。
在光学显微镜下，检测培养的细胞。在50μM或更多的最终浓度下，于DGE存在下，对培养的细胞观察到核的浓缩、细胞的皱缩和编程性细胞死亡体的形成。对含有加入的500μl盐水的对照组培养的细胞未观察到这样的现象。
以如同以上描述的相同方法，使用培养24或48小时的细胞，使用如在Saibo Kogaku,Bessatsu(Cell Technology，增刊)Jikken方案系列：编程性细胞死亡Jikken方案(实验性方案系列：用于编程性细胞死亡的实验方案)(Shujun-sha)第129-130页中描述的FACScan，实施编程性细胞死亡细胞的测量和如在Bio Manual UP系列：Saishin编程性细胞死亡Jikken-ho(Bio Manual UP系列：现代编程性细胞死亡实验方法)(Yodo-sha)第61-63页中所述分析DNA碎片。结果，在50μM或更多的最终浓度的DGE存在下对培养的细胞观察到编程性细胞死亡细胞。在50μM或100μM的浓度的DGE存在下，观察到DNA碎片。对含有加入500μl盐水的对照组培养的细胞未观察到这样的现象。
(2)如同在实施例2-(1)中描述的那样，用0.4％台盼蓝将培养24小时的细胞部分染色并在光学显微镜下检测。将未染色的活细胞和染为蓝色的死亡细胞计数。经测定导致50％生存力[生存力50(μM)]的DGE浓度为81.7μM。如上所述，由于具有编程性细胞死亡-诱导活性，DGE对肿瘤细胞显示抗增殖活性。另外，κ-DGE显示相似的活性。
实施例3：脂质过氧化自由基生成抑制试验
将金黄色葡萄球菌3A(国立典型菌种收藏所(National CollectionofType Culture),NCTC 8319)接种到5ml的脑心浸液培养基(Difco,0037-17-8)中并在37℃下孵育过夜。经离心收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次并然后以1×107菌落形成单位/ml的浓度在磷酸盐缓冲盐水中悬浮。在37℃下，将100μl的细胞悬浮液、在10或100mM下的100μl的DGE水溶液、100μl的1mg/ml高铁血红蛋白溶液(Sigma,M9250)、600μl的磷酸盐缓冲盐水和100μl的50mM叔丁基过氧化氢溶液(Katayama Kagaku,03-4 990)反应30分钟。将1ml的2×NMP培养基加入到反应混合物中以终止反应。如下制备2×NMP：将8g营养肉汤(Difco,0003-01-6)、5g胰蛋白胨(Difco,0123-17-3)、5gNaCl、10g甘露糖醇(Nacalai Tesque,213-03)和0.035g酚红(Nacalai Tesque,268-07)溶于蒸馏水中以使体积达到500ml；用NaOH将pH调至7.4；然后经过滤将混合物灭菌，得到2×NMP培养基。用NMP培养基(经用灭菌水将NMP培养基稀释2倍来制备)每3倍量稀释生成的混合物，制备12个连续的稀释液。将每一个稀释液160μl置于96孔微滴定板上的每孔中。在37℃下，将板孵育过夜。用裸眼观察培养基的颜色。由于细菌生长的结果，导致孔中培养基的颜色从红色变成黄色的样品被鉴定为具有抑制脂质过氧化自由基生成活性。
结果显示在表1中。在表1中，+表示观察到细菌在孔中生长的样品，而-表示未观察到细菌在孔中生长的样品。在表中上线的数字表示于37℃下在叔丁基过氧化氢溶液与细胞反应30分钟时的反应混合物中DGE的浓度。
表1 DGE 1mM 10mM 细菌生长 - +
如从这些结果中看到的那样，DGE显示抑制脂质过氧化自由基生成活性。另外，对以下描述的κ-DGE和DGE-GSH观察到相似的活性。
实施例4：NO生成抑制试验
(1)在3×105细胞/ml浓度下，将RAW264.7细胞(ATCC TIB 71)悬浮于不含有酚红但含有10％小牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(Life Technologies Oriental,25030-149)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(Bio Whittaker,12-917F)中。将500μl悬浮液加入到48孔微滴定板上的每一个孔中并在5％CO2存在下于37℃下将板孵育12小时。将10μl含有25μg/ml脂多糖(LPS,Sigma,L-2012)和500U/ml干扰素-γ(IFN-γ，由Cosmobio,GZM-MG-IFN销售)和10μl的在250或500μM下的DGE水溶液加入到孔中。将板孵育另外12小时。然后测量在培养基中经NO氧化生成的NO2-的浓度。提供不加入LPS或IFN-γ的对照组与不加入DGE的对照组。
在培养后，将100μl的4％Griess氏试剂(Sigma,G4410)加入到100μl培养基中，并在室温下使混合物放置15分钟。然后测量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那样，在溶于相同培养基中的所给定的浓度下，通过使用NaNO2制备的校准曲线，计算培养基中NO2的浓度。所有的测量重复三次。
结果，DGE剂量依赖性抑制由LPS和干扰素-γ诱导的NO生成。结果显示在图4中。图4说明了在DGE存在下于相应培养条件下孵育的培养基中的NO2-的浓度。在图4中，横轴表示培养条件和竖轴表示NO2-的浓度(μM)。
在与上述相似的条件下，从培养4、6、8小时的RAW264.7细胞制备RNA。通过RT-PCR方法测定包含在RNA中的编码诱导性NO合酶[iNOS；Biochem.Byophys.Res.Commun.,215:148-153(1995)]的mRNA的量。结果，对未加入DGE水溶液的对照组细胞观察到来自iNOS mRNA的DNA碎片的扩增。另一方面，对加入DGE水溶液的细胞未观察到所述碎片的扩增。这些结果提示由DGE抑制的NO生成是通过抑制iNOS的转录而引起的。
(2)在3×105细胞/m/浓度下，将RAW264.7细胞悬浮于不含有酚红但含有10％小牛血清和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中。将500μl悬浮液加入到48孔微滴定板上的每一个孔中。在5％CO2存在下，于37℃下将板孵育6小时。将其由在0.5 mM的浓度下将DGE溶于水中并将其过滤灭菌的10μl水溶液加入到孔中。将板孵育另外0.5或5小时。然后将含有5μg/ml LPS和2000U/mlIFN-γ的10μl水溶液加入到孔中。将板孵育另外12小时。测量在培养基中经NO氧化生成的NO2-的浓度。提供不加入LPS或IFN-γ的对照组与不加入DGE的对照组。
在培养后，将100μl的4％Griess氏试剂加入到100μl培养的上清液中，并在室温下使混合物放置15分钟。然后测量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那样，在溶于相同培养基中的所给出的浓度下，通过使用NaNO2制备的校准曲线，计算培养基中NO2-的浓度。
所有的测量重复三次。
结果，与培养0.5小时的组相比较，在加入LPS和IFN-γ之前，于DGE存在下，对孵育5小时的组观察到对NO的生成的强力抑制。
其结果显示在图5中。图5说明了在预先孵育期间其中加入DGE的多种培养条件下孵育得到的培养基中的NO2-的浓度。在图5中，横轴表示培养的条件和竖轴表示NO2-的浓度(μM)。
如上所述，DGE显示抑制NO生成的活性。另外，κ-DGE显示相似的活性。
实施例5：抗微生物活性试验
如下测定DGE抗大肠杆菌W3110(细菌1)、鼠伤寒沙门氏杆菌LT2(细菌2)、枯草芽孢杆菌IFO3021(细菌3)、铜绿假单孢菌IFO3080(细菌4)和链球菌株突变GS5(细菌5)的抗微生物活性。
在L-液体培养基上，将细菌1至4培养过夜。基于浊度，用敏感肉汁培养基(Nissui)将培养物稀释至大约2×105细胞/180μl的浓度。在脑心浸液培养基上，将细菌5培养过夜。基于浊度，用脑心浸液培养基将培养物稀释至大约2×105细胞/180μl的浓度。将每一种细菌稀释液180μl放入到96孔微滴定板上的每一个孔中。另一方面，将对应细菌稀释液进一步稀释并涂布到L-液体培养基或脑心浸液培养基的板上。在37℃下，将板孵育过夜。将生成的菌落计数以测定证实有活力的细胞数目。
将14.4mg/ml DGE溶液每次稀释2倍以制备系列稀释液。把每个稀释液20μl放入其中已放入细菌稀释液的孔中。无须振摇，在37℃下，将细胞培养24小时。培养后，测量每种培养物的浊度。生成浊度低于已加入盐水的对照组的孔中浊度的样品的浓度定义为最小生长抑制浓度。
此外，把那些未观察到细菌细胞生长的孔的培养基在板上涂布。在37℃下，将板孵育过夜后，将生成的菌落计数以测定证实有活力的细胞数目。与先前测定的证实有活力的细胞相比较，从加入样品开始无须振摇下培养24小时后，生成较低有活力的细胞数目的培养基中样品的浓度定义为最小杀菌浓度。对细菌1至5，测定DGE的最小生长抑制浓度和最小杀菌浓度，如表2中所示。
表2最小生长抑制浓度 (μg/ml)最小杀菌浓度 (μg/ml) 细菌1 360 720 细菌2 360 720 细菌3 360 720 细菌4 360 720 细菌5 90 180
如上所述，DGE显示抗微生物活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也观察到显示出活性。
实施例6：抗突变活性试验
按照经umu试验检测环境突变物的方法，测定抗突变活性，该方法能够测定相对于β-半乳糖苷酶活性(Mutation Research,147:219(1985))的致突变性。简言之，将25μl突变原[在10μg/ml下的丝裂霉素C(DNA交联剂)或在7μg/ml下的4-硝基喹啉-1-氧化物(NQO，一种DNA甲基化试剂)]加入到50μl的不同浓度(1.0、5.0、10或15mM)的DGE溶液中。将在TGA培养基中的在OD 600为0.12下的鼠伤寒沙门氏菌TA1535/pSK1002的培养物加入到该混合物中以使最终体积为1.5ml。然后在37℃及伴随振摇下，将混合物孵育2小时。按照Miller的方法[分子遗传学的实验，第352页(1972)]，使用200μl培养物以测量β-半乳糖苷酶活性。结果显示在表3中。
表3β-半乳糖苷酶活性DGE的最终浓度(mM) 0 0.03 0.17 0.33 0.5丝裂霉素 C 611 590 570 451 383 NQO 1437 1376 1212 1038 926
如同从表中看到的那样，在最终浓度0.5mM下，DGE分别对丝裂霉素C(DNA交联剂)显示37％的抗突变活性和对NQO(甲基化试剂)显示36％的活性。另外，κ-DGE和如下描述的DGE-GSH也显示相似的活性。
实施例7：制癌活性试验
(1)将琼脂粉末(Wako Pure Chemical Industries)加入到50mM枸橼酸溶液中以使最终体积为3％在95℃下，将混合物加热160分钟，用pH12的碱处理混合物并然后中和以制备用于制癌活性试验的受试溶液。
从Nippon Charles River购买雄性裸鼠(SPF/VAFBalb/cAnNCrj-nu,4周龄)并预先喂饲1周。在1.5×106细胞/小鼠下，将人结肠癌细胞系HCT116(ATCC CCL-247)皮下移植到小鼠上。
从移植结肠癌细胞系2周后，用于制癌活性试验的受试溶液(其临用前立即调节至pH6.5)每周5天作为饮用水自由给予小鼠。每只小鼠每天摄取的平均体积为3.5ml。另外，来自Oriental Yeast的MF作为食物自由给予小鼠。
开始给予受试溶液4周后，从每只接受受试溶液的小鼠取出实体癌并将实体癌的重量与来自向其给予正常水的对照组小鼠的重量相比较。每组使用10只小鼠进行该试验。
结果，在口服接受用于制癌活性试验的受试溶液的组观察到显著的肿瘤生长抑制。
(2)将艾氏黑素瘤细胞腹膜内(1.2×106细胞/小鼠)给予18只雌性ddY小鼠(5周龄，体重大约为25g)。观察持续30天。然后计算平均生存天数、延长率和30天生存数。将小鼠分成3组，每组6只。一组为对照组，且另外2组分别接受2mg/kg和20mg/kg剂量的DGE。从给予癌症后那天起，将DGE腹膜内给予4天。
结果显示在表4中。对照组的平均生存天数为14.3天。对接受2mg/ml和20mg/kg剂量的DGE组，30天生存数分别为1和3。对接受2mg/ml和20mg/kg剂量的DGE组，平均生存天数分别为23.7天和28.0天，并且延长率分别为141％或者更多和195％或者更多。因此，观察到显著延长作用。
表4 平均生存天数 (天)延长率 (％)30天生存数 对照组 2mg/kg 20mg/kg 14.3 23.7 28.0 100 ＞141 ＞195 0 1 3如同以上描述的那样，DGE显示制癌活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也显示相似的活性。
实施例8：黑素原生成抑制试验
将悬浮于含有10％小牛血清的RPMI-1640培养基中的小鼠黑素瘤细胞B16BL6分散到在5×104细胞/孔/2ml培养基的6孔板上并在37℃下孵育板。第2天，向其中加入100μl的DGE溶液(2mg/ml至0.2mg/ml)。第7天，更换培养基，同时向其中加入100μl DGE溶液(2mg/ml至0.2mg/ml)。第8天，收获细胞。消化DNA、RNA和蛋白质后，测量400nm下的吸光度以测定抑制黑素原生成活性。
简言之，通过搅拌除去培养基后，每孔加入溶于20mM EDTA溶液的0.3ml 0.25％胰蛋白酶并在37℃下将板孵育10分钟。然后向孔中加入2ml新鲜培养基并悬浮细胞。将悬浮液转移至试管。经离心除去培养基后，将细胞悬浮于2ml PBS中并再次离心。除去上清液后，向细胞加入含有5mM氯化锰和1μl的70,000U/ml DN酶I(Takara Shuzo)的30μl的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)。将混合物充分混合并然后在37℃下孵育2小时以消化DNA。然后向混合物加入1μl的10mg/ml核糖核酸酶A(Sigma)并在50℃下将生成的混合物孵育1小时以消化DNA。最后，向其中加入含有100μg/ml蛋白酶K(Sigma)、0.1％Tritton X和10mM EDTA的100mM Tris-盐酸盐缓冲液(pH7.8)以制备总体积至200μl对2×106细胞。在37℃下孵育混合物16小时后，测量400nm下的吸光度。
结果，对DGE观察到抑制黑素原生成活性，它们的漂白作用被证实。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也显示相似的活性。
实施例9：α-糖苷酶抑制试验
(1)经将对硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷(一种用于α-糖苷酶的产色底物)与来自酵母的α-糖苷酶反应并比色定量水解释放的4-硝基苯酚，测量DGE抑制α-糖苷酶的活性。简言之，将10μl的α-糖苷酶溶液[40mU/ml，衍生自S.cerevisiae(啤酒酵母)，Sigma，溶于10mM磷酸盐缓冲液(在37℃下pH 7.2)中]和10μl含有溶于10mM磷酸盐缓冲液(在37℃下pH7.2)中的受试样品的溶液混合。向其中加入80μ1的1.5mg/ml底物溶液[Sigma，溶于10mM磷酸盐缓冲液(在37℃下pH7.2)]以开始反应。在37℃下反应40分钟后，测量(岛津uv2200)410nm下的吸光度。结果显示在表5中。由此计算剩余的活性，将未有受试样品的活性定义为100％。
表5加入DGE的量(μM)吸光度(OD 410nm)剩余活性(％) 0 5 50 500 1000 5000 0.444 0.433 0.401 0.221 0.114 0.083 100 98 90 50 26 19
如从这些结果中看到的那样，DGE显示抑制α-糖苷酶的活性。抑制α-糖苷酶活性至50％的DGE浓度(IC50)为500μM。
(2)，将来自大鼠小肠粘膜的α-糖苷酶粗酶制品[根据如在Arne Dahlqvist,Anal.Biochem.,7:18-25(1964)中描述的方法制备]用于测量如下DGE抑制α-糖苷酶的活性。
对酶反应，将在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的80μl蔗糖、麦芽糖、海藻糖或可溶性淀粉的溶液作为底物，以100mM的最终浓度(对可溶性淀粉0.5％)加入到适当用相同缓冲液稀释的10μl受试样品溶液中。向其中加入10μl从大鼠小肠制备的粗酶溶液。在37℃下，将该混合物反应20分钟。
经向反应混合物中加入3ml的葡萄糖测量试剂(Wako PureChemical Industries)，在37℃下反应5分钟并然后测量作为在混合物中葡萄糖的含量在505nm下的吸光度，评价酶反应。
按照以上提到的方法，使用在四种不同的浓度下的DGE，测量DGE对经α-糖苷酶的每一种底物的消化的抑制活性。抑制α-糖苷酶的活性表示为相对活性(％)，将无DGE的对照组的活性定义为100％。
结果显示在表6中。
表6 DGE(mM) 0.2 0.5 1.0 2.0蔗糖 91麦芽糖 96海藻糖 98可溶性淀 100 粉 92 97 96 95 83 100 99 91 71 96 100 92
如同使用狄克松作图法(plot)测定的那样，DGE对蔗糖的抑制常数(Ki)为6.0mM。
与使用麦芽糖等时观察到活性相比较，当蔗糖用作底物时，DGE显示更高的抑制α-糖苷酶活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也观察到相似的抑制α-糖苷酶活性。
实施例10：抗风湿活性试验
DSEK细胞为从患有慢性风湿病患者的滑液膜上建立的成纤维细胞系并作为体外类风湿病模型保存在Saitama医学院联合医学中心第二内科医学系中。在5％CO2存在下，在37℃下于含有10％FBS(BioWhittaker)的Iscov-MEM培养基(IMDM:Gibco-BRL)上将DSEK细胞培养至汇合。使用胰蛋白酶-EDTA溶液，于3×104细胞/ml浓度下，在相同的培养基上悬浮这些细胞。将200μl悬浮液分散于96孔微滴定板(Falcon)的每一个孔中。在培养5-7天后，此时细胞生长至80％汇合，将培养基改变为200μl含有25、50、75、100、200或400μM的DGE的以上述培养基。
孵育24或72小时后，向孔中加入10μl预先混合的WST-1(Takara Shuzo,MK400)。在37℃下，将混合物反应3.5小时。通过从450nm下的吸光度(A450)减去650nm下吸光度(A650)得到值来表示细胞生长程度。
所述结果显示在表7中。
表7 DGE 浓度(μM) 培养时间 24小时 72小时 细胞生长程度(A450-650) 0 25 50 100 200 400 3.98 3.86 3.24 2.88 1.26 0.71 3.94 3.33 3.25 2.05 0.48 0.35
如在A450-650数据基础上测定的那样，导致半数细胞生长抑制的浓度(IC50)分别为24小时时207μM和72小时时112μM。
如上所述，在体外类风湿病模型(DSEK细胞)上，与加入PBS的对照组孔相比较，在加入DGE孔中的类风湿病细胞的生长被强烈抑制。另外，人们认识到所述化合物不仅保持其生长抑制活性，而且还有在超过预定的时间内增强活性的趋势。
这些结果证实DGE具有很强的抗风湿活性。因此，人们期待着DGE将被开发为抗慢性风湿病的有效的治疗药物和保健食品。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也观察到相似的活性。
以培养24或72小时的DSEK细胞中回收150μl/孔培养上清液。使用对相应细胞因子(人FGF-β和人IL-10来自Intergen，及人IL-1α和人TGF-β来自Promega)特异性的ELISA试剂盒，测定DGE对来自细胞上的细胞因子(人TGF-β、人FGF-β、人IL-1α和人IL-10)生成(表达)的作用。
结果，DGE显示抑制人IL-1α和人FGF-β生成的活性以及增强人IL-10和人TGF-β生成的活性。
实施例11：前列腺素E2生成抑制试验
在3×105细胞/m/浓度下，将RAW264.7细胞悬浮于含有10％小牛血清的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中。将500μl悬浮液加入到48孔微滴定板上的每一个孔中并在5％CO2存在下，于37℃下将板孵育6小时。将通过使0.5mM的浓度下的DGE溶于水并过滤灭菌制备的10μl水溶液加入到孔中。将板孵育另外0.5或5小时，然后将10μl50μg/ml的LPS水溶液加入孔中。将板孵育另外12小时后，测量前列腺素E2的量。提供不加入LPS的对照组与不加入DGE的对照组。
在培养后，使用前列腺素E2 ELISA试剂盒(Neogen，编码404110)，测量在培养基上清液中前列腺素E2的量。所有的测定重复3次进行。
结果显示在图6中。图6说明在预先孵育期间，在其中加入DGE的多种培养条件下孵育得到的培养基中的前列腺素E2的浓度。在图6中，横轴表示培养的条件和纵轴表示前列腺素E2的浓度(ng/ml)。
结果，DGE抑制由LPS诱导的前列腺素E2的生成。另外，与孵育0.5小时相比较，加入LPS之前对在DGE存在下孵育5小时的孔观察到较强的前列腺素E2生成的抑制作用。
实施例12：热休克蛋白诱导试验
将5ml含有10％小牛血清的RPMI-1640培养基和在2×105细胞/ml的浓度下的RPMI 1640放入到6孔板的每一个孔中。在5％CO2存在下，在37℃下，将板孵育24小时。然后向其中加入最终浓度0、6.25、12.5、25、50或100μM的DGE。孵育继续另外6小时。
在培养后，将细胞计数。经离心收获细胞，用PBS洗涤以制备DGE-处理的细胞。在45℃下加热10分钟后，也制备以相同方法培养的细胞。
根据如在分子克隆[Cold Spring Haerbor实验室出版社(1989)]中描述的方法，将这些处理后的细胞用于SDS-PAGE。在2.5×106细胞/ml浓度下，将处理后的细胞悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中。于100℃处理细胞悬浮液10分钟。将每份5μl的细胞悬浮液应用于两个SDS-PAGE凝胶(5％积层凝胶，10％分离凝胶)并电泳。凝胶之一经受考马斯蓝染色法。另一个凝胶被印迹到聚偏二氟乙烯化物转移膜上[ImmobilonTM,Millipore,Cat.IPVHOOO-10号]。使用Block Ace(大日本制药，目录UK-B25号)，在4℃下将膜阻断过夜。
阻断的膜与单克隆抗体HSP72/73(Ab-l)(Oncogene ResearchProducts，目录HSP01号)反应，其特异性与热诱导的70kDa热休克蛋白反应。用含有0.05％吐温20的TBS洗涤随后用TBS洗涤膜。然后膜与过氧化酶接合的二级抗体HRT-兔抗鼠IgG(H+L)(Zymed实验室公司，目录61-6520号)反应，并然后如上所描述的那样洗涤。与初级和二级抗体反应的膜与致化学发光试剂RenaissanceTM(杜邦NEN，目录NEL-100号)反应。然后将膜暴露于X-射线胶片以证实70kDa热休克蛋白的诱导作用。
结果，观察到由DGE诱导的70kDa热休克蛋白。诱导作用的程度显示在表8中。在表8中，+表示诱导水平。增加的+号数目意指增加的诱导作用。另一方面，-表示未观察到诱导作用。
另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也观察到诱导热休克蛋白的相似的活性。
表8 细胞的处理热休克蛋白的诱导 在45℃加热10分钟 0μMDGE 6.25μMDGE 12.5 μ MDGE 25.0μMDGE 50.0μMDGE 100μMDGE +++ - + + ++ +++ ++++
实施例13：制备5-L-谷胱甘肽-S-基-2-羟基-3,7-二氧二环[2.2.2]辛-1-醇(DGE-GSH)
(1)将DGE和还原的谷胱甘肽(GSH；Nacalai Tesque)以20mM的浓度溶于PBS中并在37℃下把混合物反应过夜。在正相柱，PAL-PAK Type S上分馏100μl的反应混合物。在以下条件下实施层析法：流速：1ml/min；含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液(0-10分钟)；线性梯度从含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液至含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(10-50分钟)；检测：在195nm下的吸光度；流分收集：每次1.5分钟。将相应流分浓缩至干并重悬浮于50μl蒸馏水中。如同在实施例1-(2)中描述的那样，使用HL-60细胞，测量对肿瘤细胞的抗增殖活性。结果，对加入大约30-40的流分的组观察到编程性细胞死亡体。这些组在590nm下的吸光度低于加入水的组的吸光度，说明抑制细胞生长。在反相层析法(TSK凝胶ODS-80Ts(5μm),Toso,4.6×250nm)上，分馏以如同以上描述的相同方法制备的50μl活性组分。在以下条件下实施层析法：流速：1ml/min；含有0.1％TFA的蒸馏水(0-15分钟)；线性梯度从含有0.1％TFA的蒸馏水至含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(15-30分钟)；含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(30-45分钟)；检测：在215nm下的吸光度；流分收集：每次1.5分钟。将相应流分浓缩至干并重悬浮于50μl蒸馏水中。如同在实施例1-(2)中描述的那样，使用HL-60细胞，测量对肿瘤细胞的抗增殖活性。结果，对加入大约4至9的流分的组观察到编程性细胞死亡体。这些组在590nm下的吸光度低于加入水的组的吸光度，说明抑制细胞生长。这些结果证实编程性细胞死亡-诱导活性。
以上提及的正相层析法重复10次。收集具有编程性细胞死亡-诱导活性的流分，浓缩至干，重新溶于1ml蒸馏水中并然后经受正相层析法以制备纯化的流分。然后将经正相层析法纯化的流分经受以上提及的反相层析法。收集具有编程性细胞死亡-诱导活性的流分并浓缩至干。结果，从含有20mM DGE和20mM谷胱甘肽的1ml反应混合物中，得到5mg具有编程性细胞死亡-诱导活性的化合物。该化合物用于结构测定。
(2)使用DX302质谱仪，进行在实施例13-(1)中得到的编程性细胞死亡-诱导物质即DGE和谷胱甘肽反应产物的质谱分析。另外，将样品溶于重水中以通过核磁共振谱(NMR)分析结构。结果如下显示。
在实施例13-(1)中得到的编程性细胞死亡-诱导的物质的质谱示于图7中。所述物质的1H-NMR谱示于图8中。所述物质的13C-NMR谱示于图9中。在图7中，横轴表示m/z值和纵轴表示相对强度(％)。在图8和9中，横轴表示化学位移值(ppm)和纵轴表示信号强度。
FAB-MS:m/z 452[M+H]+
474[M+Na]+
544[M+甘油+H]+
566[M+甘油+Na]+甘油用作基质。1H-NMR:δ1.62(1H,t,J=13.5Hz,6-H),1.96(1H,dd,J=4.0,13.5Hz,6-H),2.07(2H,m,5′-H),2.42(2H,m,4′-H),2.85(1H,dd,J=8.5,13.5Hz,1′-H),2.90(1H,ddd,J=4.0,10.5,13.5Hz,5-H),3.06(1H,dd,J=5.0,13.5Hz,1′-H),3.44(1H,dt,J=5.0,10.5Hz,4-H),3.52(1H,t,J=10.5Hz,H-8),3.66(1H,dd,J=5.0,10.5Hz,H-8),3.82(1H,t,J=6.5Hz,6′-H),3.88(2H,S,9′-H),4.47(1H,dd,J=5.0,8.5Hz,2′-H),4.65(1H,S,2-H)。
假定HOD的化学位移值为4.65ppm来表示1H-NMR的化学位移值。13C-NMRδ26.6(5′-C),31.9(4′-C),32.7(1′-C),35.6(6-C),42.0(9′-H),45.2(5-C),53.9(6′-C),54.4(2′-C),64.7(8-C),70.4(4-C),92.1(2-C),97.2(1-C),173.4(7′-C),173.5(8′-C),173.8(10′-C),175.4(3′-C)。
假定二噁烷的化学位移值为67.4ppm来表示1C-NMR的化学位移值。
在1H-NMR和1C-NMR中的峰鉴定编号如在下式中指明。
从这些结果中，揭示在实施例13-(1)中得到的编程性细胞死亡-诱导的物质为5-L-谷胱甘肽-S-基-2-羟基-3,7-二氧双环[2.2.2]-辛-1-醇(在下文简称为DGE-GSH)。
实施例14：编程性细胞死亡诱导试验
将实施例13-(1)中获得的10mg/ml DGE-GSH水溶液经过滤灭菌并用灭菌水稀释2、4、8、16、32、64、128、256或512倍。如同在实施例1-(2)中描述的那样，测量这些稀释液抗HL-60细胞的抗增殖活性。结果，对加入DGE-GSH的组观察到编程性细胞死亡体。这些组在590nm下的吸光度低于加入水的对照组的吸光度。基于以上提到的结果计算，GI50(即与加入水的对照组相比较经在590nm下的半数吸光度证实的导致50％生长抑制的浓度)为大约48.7μg/ml。
实施例15:NO生成抑制试验
在3×105细胞/ml浓度下，将RAW264.7细胞悬浮于不含有酚红但包含10％小牛血清和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中。将500μl悬浮液加入到48孔微滴定板上的每一个孔中并在5％CO2存在下于37℃下将板孵育12小时。将10μl含有50μg/ml脂多糖和5000U/ml干扰素-γ的水溶液和通过使实施例13-(1)中制备的DGE-GSH以1mM浓度溶于水制备的10μl水溶液加入到孔中。将板孵育另外16小时。测量在培养基中经NO氧化生成的NO2-的浓度。提供不加入LPS或IFN-γ的对照组与不加入DGE-GSH的对照组。
在培养后，向100μl的培养基加入100μl的4％Griess氏试剂(Sigma,G4410)，并在室温下使混合物放置15分钟。然后测量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那样，在溶于相同培养基中所给出的浓度下，通过参照使用NaNO2制备的校准曲线，计算培养基中NO2-的浓度。
结果，未含有加入物的培养基中的NO2-浓度为4.6μM。在加入LPS和IFN-γ而未加入DGE-GSH的对照组培养基中的NO2-浓度为12.1μM。在加入DGE-GSH的培养基中的NO2-浓度是低的(9.4μM)。说明DGE-GSH对LPS和IFN-γ诱导的NO生成的抑制作用。
实施例16：前列腺素E2生成抑制试验
在3×105细胞/ml浓度下，将RAW264.7细胞悬浮于不含有酚红但包含10％小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中。将500μl悬浮液加入到48孔微滴定板上的每孔中并在5％CO2存在下，于37℃下将板孵育12小时。将10μl的50μg/ml脂多糖溶液和通过把实施例13-(1)中制备的DGE-GSH以1mM的浓度溶于水并过滤灭菌制备的10μl水溶液加入到孔中。将板孵育另外16小时后，测量前列腺素E2的量。提供不加入LPS的对照组与不加入DGE-GSH的对照组。
在培养后，使用前列腺素E2ELISA试剂盒(Neogen,Code,404110)，测量在培养基上清液中前列腺素E2的量。
结果，未含有加入物的培养基中前列腺素E2的浓度为50.3ng/ml。在加入LPS而未加入DGE-GSH的对照组培养基中前列腺素E2的浓度为63.4ng/ml在加入DGE-GSH的培养基中前列腺素E2的浓度是低的(50.7ng/ml)。说明DGE-GSH对LPS诱导的前列腺素E2的生成有抑制作用。
实施例17：淋巴细胞激活抑制试验
从Nippon SLC购买DDY小鼠(雌性，7周龄，体重大约25g)并用于实验前预先喂饲1周。从小鼠取出脾脏，绞碎并悬浮于含有10％小牛血清(HyClone)的RPMI-1640培养基中以得到单细胞悬浮液。除去粘附于塑料培养皿的粘着细胞并将非粘着细胞用作脾淋巴细胞。以2×106细胞/ml的浓度将脾淋巴细胞悬浮于含有10％小牛血清的RPMI-1640培养基中。将200μl悬浮液接种到96孔微滴定板上的每个孔中。除了对照组孔以外，将DGE以各种不同的浓度加入到每孔中。此外，将5μg的伴刀豆凝集素A(Nacalai Tesque)加入到每孔中。在5％CO2存在下，在37℃下，将板孵育2天。在完成培养的前一天，将37kBq的3H-胸苷(Daiichi Pure Chemicals)加入到每孔中以脉冲标记细胞。培养后，在玻璃滤器上收获细胞以测量放射活性。
结果显示在图10中。DGE以剂量依赖方式显示针对经用突变原刺激活化的淋巴细胞增殖的抑制活性，并在0.3μg/ml浓度下几乎完全抑制增殖。因此，DGE抗淋巴细胞活化的抑制活性被证实。
如同以上描述的那样，本发明提供式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、它们的盐和用作以下组合物活性成分的本发明编程性细胞死亡-诱导的物质，组合物包括：诱导编程性细胞死亡组合物、制癌组合物、抗氧化组合物如抑制活性氧生成的组合物、用于抑制脂质过氧化自由基生成的组合物和用于抑制NO生成的组合物、用于抑制前列腺素合成的组合物、抗致病性微生物组合物、用于保鲜的组合物、抗突变组合物、抗高血糖组合物、抗高血脂组合物、用于诱导热休克蛋白生成的组合物、抗病毒组合物和用于抑制α-糖苷酶的组合物。
包含通过稀释这样的物质来生产的，和/或通过向其中加入这样的物质来生产的食品或饮料用作具有以下活性的功能性食品或饮料，包括：编程性细胞死亡-诱导活性、制癌活性、抗氧化活性如抑制活性氧生成和抑制NO生成的活性、抑制前列腺素合成活性、抗致病性微生物活性、抗突变活性、抗高血糖活性、抗肥胖活性、诱导热休克蛋白生成活性和抗病毒活性。因此，本发明提供其在患有癌症或病毒性疾病的患者的病灶细胞中诱导编程性细胞死亡并因此在预防或改善这些疾病的症状的食品或饮料。经口服摄取以上提到的在食品或饮料中的本发明化合物，能够在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡。因此，在消化器官的癌症如结肠癌和胃癌的情况中，在它们当中，本发明的食品或饮料具有优良的预防或改善消化器官癌症的症状的效果。此外，基于它们的抗氧化活性如抑制活性氧生成的活性，以上提到的食品或饮料作为抗氧化应激食品或饮料是优良的。
另外，式(Ⅰ)或式(Ⅱ)化合物也用作抑制活性氧生成的抗氧化化合物。含有通过稀释来生产的和/或通过向其中加入本发明抗氧化作用的化合物来生产的食品和饮料，用作改善由生命体内氧化物质如活性氧导致的疾病的疾病状态的食品和饮料。此外，本发明的食品和饮料对便秘的改善或预防是有效的。
本发明提供的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它们的盐用作对食品或饮料提供抗氧化活性如抑制活性氧生成活性的新的功能性化合物。
本发明化合物具有保鲜活性。因此，它们经常用于保持食品或容易腐烂食物的味道和新鲜。
另外，含有本发明化合物的化妆品组合物用作那些漂白或给皮肤增加水分的化妆品。