二氢硫杂菲羰基胍类化合物、其制备方法 以及其作为药物或诊断试剂的用途 本发明涉及式(I)的二氢硫杂菲羰基胍类化合物，
其中定义如下：
R(1)和R(3)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基、含1，2，3或4个碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-(CF2)x-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-(CF2)x-CF3；
R(10)和R(11)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基或-(CH2)n-(CF2)x-CF3；
m 0、1或2；
n 0、1、2、3、4、5或6；
x和p
彼此独立地表示0或1；
R(2)氢、F、Cl、Br、I、CN、含1，2，3或4个碳原子的烷基、甲氧基、含3，4，5，6，7或8个碳原子的环烷基；
R(4)和R(5)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基、含1，2，3或4个碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-(CF2)s-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-(CF2)v-CF3；
R(12)和R(13)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基；
w 0、1或2；
r和u
0、1、2、3、4、5或6；
q、s、t和v
彼此独立地表示0或1；
或
R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)
与相连的苯环共同构成萘环体系；
A -S-，-SO-或-SO2-
及其可药用盐。
优选的式(I)化合物说明如下：
R(1)和R(3)
彼此独立地表示氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；
R(10)和R(11)
彼此独立地表示氢、甲基、乙基或-CH2-CF3；
m 0、1或2；
n 0、1、2或3；
p 0或1；
R(2)氢、F、Cl、CN、含1，2，3或4个碳原子的烷基、甲氧基、含3，4，5或6个碳原子的环烷基；
R(4)和R(5)
彼此独立地表示氢、甲基或乙基；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)
彼此独立地表示氢、含1，2，3或4个碳原子的烷基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；
R(12)和R(13)
彼此独立地表示氢、甲基或乙基；
w 0、1或2；
r和u
0、1、2或3；
q和t
彼此独立地表示0或1；
或
R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)与相连的苯环共同构成萘环体系；
A -S-、-SO-或-SO2-
及其可药用盐。
特别优选的式(I)化合物说明如下：
R(1)
氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；
R(10)和R(11)
彼此独立地表示氢、甲基、乙基或-CH2-CF3；
m 0、1或2；
n、p彼此独立地表示0或1；
R(2)氢、F、Cl、甲基、含3，4，5或6个碳原子的环烷基；
R(3)、R(4)和R(5)
氢；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)
彼此独立地表示氢、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；
R(12)和R(13)
彼此独立地表示氢、甲基或乙基；
w 0、1或2；
q、r、t和u
彼此独立地表示0或1；
或
R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)
与相连地苯环共同构成萘环体系；
A -S-、-SO-或-SO2-
及其可药用盐。
非常特别优选的式(I)化合物说明如下：
R(1)
氢、甲基、甲氧基、乙氧基、Cl、NR(10)R(11)、-O-CH2-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；
R(10)和R(11)
彼此独立地表示氢、甲基、乙基或-CH2-CF3；
m 0、1或2；
p 0或1；
R(2)氢、F、Cl或甲基；
R(3)、R(4)和R(5)
氢；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)
彼此独立地表示氢、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、-O-CH2-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；
w 0、1或2；
t和u
彼此独立地表示0或1；
或
R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)与相连的苯环共同构成萘环体系；
A -SO2-
及其可药用盐。
带有适当取代基的式I化合物可能存在立体异构形式。如果式I化合物含有一个或多个不对称中心，对每个不对称中心就可能存在彼此独立的S构型或R构型。所有可能的立体异构体，例如对映异构体或非对映异构体，以及两种或两种以上立体异构形式的混合物，例如任意比例的对映异构体和/或非对映异构体，均属于本发明范畴。这样一来，属于本发明范畴的对映异构体既包括光学对映纯的(包括左旋体和右旋体两种)形式，也包括不同比例的两种对映异构体的混合物或者外消旋体形式。如果需要，单一的立体异构体可以通过常规的方法对混合物进行拆分获得，或者通过例如立体选择性合成的方法获得。如果存在活泼氢原子，本发明化合物还包含式I化合物的所有互变异构体。
所述烷基可以是直链或支链烷基。本发明还涉及化合物I的制备方法，其包括将式II化合物与胍反应：
其中R(1)至R(9)及A具有如上所述的含义，L是易于进行亲核取代的离去基团。
式II的活化酸衍生物，其中L为烷氧基，优选为甲氧基、苯氧基、苯硫基、甲硫基、2-吡啶硫基、含氮杂环，优选1-咪唑基，可以方便地根据本身已知的方法由碳酰氯(式II，L＝Cl)制得，这些碳酰氯可根据本身已知的方法由羧酸(式II，L＝OH)与例如亚硫酰氯制得。
除了用式II的碳酰氯(L＝Cl)外，还可以用本身已知的方法直接从苯甲酸衍生物(式II，L＝OH)制备其它的活化的式II酸衍生物，例如用氯化氢气体的甲醇溶液处理得到式II化合物的甲酯(式II，L＝OCH3)，用羰基二咪唑处理得到式II的咪唑衍生物[L＝1-咪唑基，Staab，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1，351-367(1962)]，在惰性溶剂、三乙胺存在条件下用Cl-COOC2H5或甲苯磺酰氯处理得到式II的混和酸酐，也可以用二环己基碳二亚胺(DCC)或氧代-[(氰基(乙氧羰基)亚甲基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(“TOTU”)[Proceedings of the 21st European Peptide Symposium，Peptides 1990，E.Giralt和D.Andreu编辑，Escom，Leiden，1991]来活化苯甲酸。在J.March，高等有机化学，第三版(John Wiley & Sons，1985)中列出了许多可用于制备式II的活化羧酸衍生物的方法，在350页列出了文献来源。
式II羧酸的活化衍生物与胍的反应按照本身已知的方法在惰性的质子性或非质子性的极性有机溶剂中进行。在苯甲酸甲酯(II，L＝OMe)与胍的反应中被证实可用的是甲醇、异丙醇或四氢呋喃，反应温度在20℃至所用溶剂沸点之间。大多数式II化合物与无盐胍的反应在非质子性惰性溶剂如THF、二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷中进行对反应是有利的。然而，如果引入一种碱，例如NaOH时，水同样可以作为式II化合物与胍的反应溶剂。
当L为Cl时，加入酸清除剂，例如通过加入过量的胍的方式来结合氢卤酸对反应是有利的。
优选地，二氢硫杂菲羧酸结构的组装有利地起始于适当取代的苄硫基、苯甲亚磺酰基、苯甲磺酰基。按照已知的方法(见Chem.Rev.95(7)，2457(1995)或“Metal-catalyzed Cross-coupling Reactions”，Diederich，Francois；Stang，Peter J，；Editors Germany(1988)Publisher：(Wiley-VCH，Weinheim，Germany)，517)或Tetrahedron(1998)，54(3/4)，263)进行分子内芳基-芳基偶联。优选硼酸与适当的芳基卤化物如芳基氯、芳基溴、芳基碘，或者与适当的芳基酯例如芳基甲磺酸酯、芳基三氟甲磺酸酯的偶联。在这些情况下，硼酸功能基既可以在苄基中引入，也可以在苯甲酸反应底物中引入。同样优选使用文献Tetrahedron Lett.(1997)，38(22)，3841-3844中描述的双(pinakolato)二硼。式III描述了这样的起始物质，其中R(1)至R(9)及A和L为给定的含义，X和Y为卤原子或-O-SO2CH3或-O-SO2CF3。优选的催化金属是钯，特别是它的络合物Pd(dppf)2。反应进行于无质子偶极溶剂中，优选DMF或DMA，温度在0℃至溶剂沸点间，优选温度范围为40℃至120℃。
通式III的衍生物的优选制备方法是由式IV的3-巯基苯甲酸衍生物或3-亚磺基苯甲酸衍生物与式V的活化苄基衍生物反应：
其中，Z为易于进行亲核取代的离去基团，例如氯、溴、碘、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。式IV与式V衍生物在适当的溶剂，例如DMF、THF或乙腈中反应，加入碱如三乙胺或DIPEA，温度在-20℃至溶剂沸点间，优选温度范围为0℃至40℃。
式I的芳酰胍通常为弱碱，可以与酸结合成盐。适宜的酸加成盐是所有可药用酸的盐，例如卤化物盐，特别是盐酸盐、乳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
式I化合物是取代的酰基胍。
与已知化合物相比，本发明化合物对Na+/H+交换的抑制活性非常突出。
正如已知化合物一样，它们没有不想要的和不利的促尿盐排泄特性，而具有优良的抗心律失常特性，这对治疗例如表现为器官缺氧的相关疾病非常重要。根据这些化合物的药理性质，它们非常适于与一种保护心脏的成分一起作为抗心律失常药，用于预防和治疗心肌梗塞、治疗心绞痛，还可以抑制或极大减缓局部缺血性损伤相关的病生理进程，特别是在局部缺血性心律失常初发时。由于它们对病理性缺氧、局部缺血情况的作用，本发明的式I化合物由于其抑制细胞Na+/H+交换机制，可用作局部缺血引起的急性或慢性损伤或由此引起的原发或继发疾病的抑制剂。这涉及它们在外科手术如器官移植中的用途(在器官移植中，这些化合物即可用于在移植前，也可用于在移植过程中保护供体器官)，涉及到在例如治疗过程中或在生理浴液中储存时，以及在向给接受者移植过程中保护移植的器官。
这些化合物在血管整形外科手术中，例如心脏和外周血管手术中，同样是有保护作用的有益药物。与其对局部缺血性损害的保护效应相关地，这些化合物还适于用作治疗神经系统，特别是中枢神经系统局部缺血的药剂，适用于例如脑猝中或脑水肿的治疗。此外本发明的式I化合物同样适用于治疗各类休克性疾病，例如过敏性休克、心源性休克、低血容量性休克和细菌性休克。此外，本发明的式I化合物对细胞增殖有显著的抑制作用，如对成纤维母细胞的增殖，以及血管平滑肌细胞增生。因而，式I化合物适用作原发或继发性细胞增生引起的疾病的治疗药剂，可用于抗动脉粥样硬化、预防糖尿病晚期并发症、癌症、纤维化疾病如肺纤维化、肝纤维化或肾纤维化，器官肥大和增生，特别是前列腺增生和前列腺肥大的药剂。
本发明化合物是细胞钠离子-质子逆向转运(Na+/H+交换)的有效抑制剂，该转运过程在多种疾病(原发性高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等)中细胞水平也被调高因而需要进行测量，例如在红细胞、血小板或白细胞中。因此本发明化合物作为适用的优良的简单科学工具，可用于例如在以诊断为目的的高血压确证或分型过程中，也用于动脉粥样硬化、糖尿病、增生性疾病等的确诊、分型中。此外，式I化合物还可用于高血压进程中的预防治疗，例如用于原发性高血压。
另外，式I化合物还被发现对血浆脂蛋白有有益影响。通常认为过高的血脂水平，也就是高脂蛋白血象，代表了血管动脉硬化性损伤，特别是冠心病的高风险因素。因而降低升高的血浆脂蛋白水平对动脉粥样硬化的预防和恢复异常重要。除了降低血清中总胆固醇水平外，降低总胆固醇中特定的导致动脉粥样化的脂类级分的含量尤为重要，特别是低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)，因为这些脂类代表了动脉粥样化的风险因素。相比之下，高密度脂蛋白对冠心病则有防护功能。因此，降低血脂不仅仅是要降低总胆固醇水平，更重要的是要降低在血清胆固醇中的LDL和VLDL。现发现式I化合物因其对血脂水平的影响具有可供治疗利用的性质。它们显著降低由于食物中胆固醇和高脂饮食摄取过量或病理性代谢异常例如遗传性高脂血症，导致的血清LDL及VLDL浓度升高，因而可通过排除风险诱因用于动脉粥样硬化损伤的预防和恢复性治疗。不仅可用于原发性高脂血症，也可用于某些例如糖尿病导致的继发性高脂血症。此外式I化合物极大地降低代谢异常导致的梗塞，特别是极大的降低梗塞的发生范围和严重程度。式I化合物还对代谢异常导致的内皮系统损伤有显著的预防作用，这种在内皮功能紊乱综合症中对血管的保护作用使式I化合物可用作冠脉血管痉挛、动脉粥样硬化形成、动脉粥样硬化症、左心室肥大，以及扩张性心肌症和血栓性疾病的预防和治疗药。
所述化合物可优选用于制备治疗高胆固醇血症的治疗药剂；制备预防动脉粥样硬化形成的药剂；制备动脉粥样硬化症的预防和治疗药剂；制备胆固醇水平升高所致疾病的预防和治疗药剂；制备内皮功能紊乱所致疾病的预防和治疗药剂；制备动脉粥样硬化症导致的高血压的预防和治疗药剂；制备动脉粥样硬化症导致的血栓性疾病的预防和治疗药剂；制备高胆固醇血症和内皮功能紊乱导致的局部缺血性损伤及局部缺血再灌注损伤的预防和治疗药剂；制备高胆固醇血症和内皮功能紊乱导致的心肌肥大、心肌症和充血性心力衰竭(CHF)的预防和治疗药剂；制备高胆固醇血症和内皮功能紊乱导致的冠脉血管痉挛和心肌梗塞的预防和治疗药剂；制备治疗所述疾病的药物组合物，其包含降压物质，优选血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂，一种包含式I的NHE抑制剂与有降血脂活性的成分的组合物，优选HMG-CoA还原酶抑制剂(例如洛伐他汀或普伐他汀)，后者具备的降血脂活性增强了式I的NHE抑制剂的降血脂作用，其组合被证实有增强疗效和降低活性成分所需剂量的优异特性。
施用式I的钠离子/质子交换抑制剂作为降低增高的血脂水平的新药剂，以及钠离子/质子交换抑制剂与降压药物和/或降血脂药物的组合物也在权利要求之内。
同样要求的还有施用式I的钠离子/质子交换抑制剂，以及钠离子/质子交换抑制剂与降压药物，特别是ACE抑制剂(如雷米普利)和血管紧张素受体拮抗剂(如洛沙坦)的组合物作为CHF的新治疗药剂。
含有式I化合物的药剂可以口服施用、胃肠外施用、静脉内施用、直肠施用或以吸入方式施用，优选的施用方式取决于疾病的表征。而且，式I化合物单独或与药用赋型剂合用后，既可以作为兽用药物，也可作为人用药物。
所述药物组合物中适用的赋型剂对本领域专业人员(根据其专业知识)来讲是熟知的。除了溶剂、凝胶基质、栓剂基质、片剂赋型剂及其它活性成分载体外，还可使用例如抗氧化剂、分散剂、乳化剂、消沫剂、掩味剂、防腐剂、增溶剂或着色剂。
对口服施用形式，可将活性化合物与对此目的有益的添加剂，如载体、稳定剂或惰性稀释剂混和，再用常规方法制成适当的剂型，如片剂、包衣片、两件式胶囊、水溶液剂、醇溶液剂或油溶液剂。可用的惰性载体实例有阿拉伯胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖或淀粉，特别是玉米淀粉。制备过程可采用干法制粒也可采用湿法制粒。适用的油剂载体或溶液的实例有菜油或动物油，例如葵花子油或鱼肝油。
对皮下或静脉内施用方式，活性化合物要转化为水溶液、混悬液或乳液，如果需要的话，通常根据目的加入如增溶剂、乳化剂或其它成分。适用溶剂的实例有：水、生理盐水或醇，如乙醇、丙醇、甘油，使用其糖溶液如葡萄糖或甘露醇溶液，或者多种所述溶剂的混合物。
适于制备气雾或喷雾方式施用的药物制剂有，例如溶液剂、混悬剂或乳剂，其中式I化合物作为活性成分溶于药用溶剂例如特别是乙醇、水或这些溶剂的混合物。如果需要，这些制剂中还可包含其它药用赋型剂，例如表面活性剂、乳化剂、稳定剂和一种助动气体。此类制品中活性成分的含量按照重量计，通常为约0.1至10，特别是约0.3至3％。式I活性成分的施用剂量及施用频度取决于所用化合物的作用强度和作用持续时间；还取决于待处理疾病的性质和严重程度；以及受治哺乳动物的性别、年龄、体重及个体反应差异。
平均来讲，体重约75kg的患者施用的日剂量是：按照体重至少为0.001mg/kg，优选0.01mg/kg，最大剂量上限是10mg/kg，优选不超过1mg/kg。对于急症，例如心肌梗塞初发时，剂量可能需要提高，而且通常特别采用例如每日多达4次的单剂施用方式。特别是静脉内施用时，对于重症监护病房的梗塞患者高达每kg体重200mg的日剂量可能是必需的。
缩略语清单：
DIPEA 二异丙基乙胺
DMA N，N-二甲基乙酰胺
DME 1，2-二甲氧基乙烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
EA 乙酸乙酯(EtOAc)
Eq. 当量
MeOH 甲醇
Pd(dppf)2 [1，1’-双(二苯基磷)二茂铁]氯化钯(II)/
二氯甲烷络合物(1∶1)
RT 室温
m.p. 熔点
THF 四氢呋喃
实验部分
二氢硫杂菲羰基胍合成的一般方法
步骤1)4-溴-5-氯磺酰基-2-甲基苯甲酸甲酯
4-溴-5-氯磺酰基-2-甲基苯甲酸(12g；J.Med.Chem.1997，40，2017)与亚硫酰氯(20ml)在隔绝潮气的条件下煮沸回流8小时。用旋转蒸发仪真空下除去过量的亚硫酰氯，然后将残余物以无水甲苯(50ml)分散并再次进行蒸发，将所得的酰基氯粗品溶于无水甲苯(25ml)，然后加入MeOH(1.7ml)，再于50℃下搅拌2小时。再次加入MeOH(1.7ml)，继续在50℃下搅拌4小时。将反应混合物以EA(200ml)稀释，再以饱和NaHCO3水溶液(100ml)洗涤。在Na2SO4干燥后，真空除去溶剂，得到淡黄色油状物(11.0g)，无须进一步纯化即可使用。
步骤2)2-溴-5-甲氧基羰基-4-甲基苯亚磺酸
将Na2SO3(550mg)溶于水(2ml)中，在70℃下滴加入4-溴-5-氯磺酰基-2-甲基苯甲酸甲酯的DME(2ml)溶液。在滴加过程中，溶液变为微酸性(pH＝5)。然后将混合物在70℃下搅拌2.5小时，冷却后以盐酸水溶液调节至pH＝1-2。将其以EA(50ml)稀释并以饱和NaCl水溶液(50ml)洗涤。在Na2SO4干燥后，真空除去溶剂，得到淡黄色油状物(228mg)，无须进一步纯化即可使用。
步骤3)4-溴-5-(2-溴苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯
2-溴-5-甲氧基羰基-4-甲基苯亚磺酸(150mg，0.51mmol，步骤2)溶于DMF(1.5ml)。向其中加入2-溴代苄基溴(128mg，0.51mmol)的DMF(0.5ml)溶液以及DIPEA(0.1ml，0.56mmol)，混合物隔绝潮气在室温下搅拌16小时，然后过滤反应溶液，以EA(20ml)稀释，再以1N的盐酸(20ml)和盐水(强度为5％，20ml)洗涤。使有机相流经干燥筒(无水Na2SO4)，并以EA(5ml)洗涤干燥筒。将滤液蒸发，所得粗品以制备性HPLC纯化。
根据一般反应方程式
步骤2)的产物 步骤3)的产物
以类似的方法制备了以下化合物： 编号 苄基溴产物 2 1-溴-2-(溴甲基)-萘4-溴-5-(1-溴萘-2-基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 3 2-溴-4-甲基苄基溴4-溴-5-(2-溴-4-甲基苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 4 1-溴-2-溴甲基-4-氯 苯4-溴-5-(2-溴-5-氯苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 5 2-溴-1-溴甲基-4-氟 苯4-溴-5-(2-溴-4-氟苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 6 1-溴-2-溴甲基-3-氟 苯4-溴-5-(2-溴-6-氟苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 72-溴-1-溴甲基-4-氯苯4-溴-5-(2-溴-4-氯苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 81-溴-2-溴甲基-4-甲氧基苯4-溴-5-(2-溴-5-甲氧基苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 91-溴-2-溴甲基-3-氯苯4-溴-5-(2-溴-6-氯苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 102-溴-1-溴甲基-3-甲基苯4-溴-5-(2-溴-3-甲基苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯 111-溴-2-溴甲基-4-甲基苯4-溴-5-(2-溴-5-甲基苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯
这些涉及的苄基溴中不能直接购买的既可以从相应的甲基芳族化合物以N-溴代琥珀酰亚胺通过游离基溴化制得，也可从相应的苄醇与溴化氢水溶液或与甲磺酰氯/三乙胺然后与四丁基溴化铵反应制备。产物粗品在乙腈/水(9∶1，1ml)中搅拌，可能要加入DMF(0.2ml)。经过筒状装置吸滤并以乙腈/水(9∶1，0.5ml)洗涤。滤集的固体在50℃真空干燥。根据HPLC/MS检测，纯度＞80％。将母液以制备性HPLC纯化，因为其中仍含有大量的产物。
步骤4)6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-硫杂菲-7-羧酸甲酯
将双(pinacolato)二硼(68mg，0.266mmol)、醋酸钾(71mg，0.725mmol)和Pd(dppf)2(9mg，0.012mmol)混于DMA(2ml)中，再向其中加入4-溴-5-(2-溴苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯(112mg，0.242mmol，步骤3)的DMA(4ml)溶液。混合物在80℃下、保护气中搅拌过夜。反应溶液经硅胶过滤并以EA(20ml)洗涤。有机相以水和5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空蒸发。所得粗品以制备性HPLC纯化。
根据一般反应方程式
步骤3)的产物 步骤4)的产物
以类似的方法制备了以下化合物： 编号 产物 2 2-甲基-5，5-二氧代-5，6-二氢-5-硫杂苯并[c]菲-3-羧酸甲酯 3 3，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 4 2-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 5 3-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 6 1-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 7 3-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 8 2-甲氧基-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 9 1-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 10 4，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯 11 2，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羧酸甲酯
步骤5)二氢硫杂菲羰基胍，一般方法
步骤4)的产物 步骤5)的产物
将叔丁醇钾(53mg，0.5mmol)混悬于无水DMF(2ml)中，向其中加入盐酸胍(50mg，0.55mol)，然后将混悬液在室温下隔绝潮气搅拌30分钟。随后加入步骤4甲酯的(0.1mmol)DMF(1ml)溶液，再将混合物在室温下搅拌过夜。滤除析出的盐，然后马上把滤液以制备性HPLC(色谱柱填料MerckSupersphere RP18e，乙腈/水梯度洗脱，以0.1％甲酸为缓冲剂)纯化。所得产物以Agilent系列1100系统的分析型HPLC/MS鉴定，质量检测采用正离子电离解析法。
方法A：
色谱柱：MERCK LiChroCart 55-2
填料：PuroSpher STAR RP18
流速：0.75ml/min
柱温：40℃
梯度：
溶剂A 乙腈/水(90∶10)+0.5％甲酸
溶剂B 乙腈/水(10∶90)+0.5％甲酸
时间[分钟] 溶剂B[％] 0.00 95.0 0.50 95.0 1.75 5.0 4.25 5.0 4.50 95.0 5.00 95.0 6.20 停止
方法B：
色谱柱：YMC J’Sphere ODS H80
填料：4μ
流速：1.0ml/分钟
柱温：30℃
梯度：
溶剂A /水+0.05％三氟乙酸
溶剂B 乙腈 时间[分钟] 溶剂B[％] 0.00 10.0 2.50 95.0 3.30 95.0 3.35 10.0 3.60 停止
实施例1-11的标题化合物是按照二氢硫杂菲羰基胍的一般合成方法合成的：
实施例1：N-(6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：330(M+1)+保留时间2.384分钟(220nm，方法A)
实施例2：N-(2-甲基-5，5-二氧代-5，6-二氢-5-硫杂苯并[c]菲-3-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：380(M+1)+保留时间1.793分钟(220nm，方法B)
实施例3：N-(3，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：344(M+1)+保留时间2.411分钟(220nm，方法A)
实施例4：N-(2-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：364(M+1)+保留时间2.390分钟(220nm，方法A)
实施例5：N-(3-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：348(M+1)+保留时间2.215分钟(220nm，方法A)
实施例6：N-(1-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：348(M+1)+保留时间2.218分钟(220nm，方法A)
实施例7：N-(3-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：364(M+1)+保留时间2.394分钟(220nm，方法A)
实施例8：N-(2-甲氧基-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：360(M+1)+保留时间2.271分钟(220nm，方法A)
实施例9：N-(1-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：364(M+1)+保留时间2.358分钟(220nm，方法A)
实施例10：N-(4，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：344(M+1)+保留时间2.302分钟(220nm，方法A)
实施例11：N-(2，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氢-9-硫杂菲-7-羰基)-胍甲酸盐
MS(ES)：344(M+1)+保留时间2.671分钟(220nm，方法A)
Jansen NHE抑制法
NHE-1的IC50[nM]抑制浓度测定方法如下：
用经转染的表达人NHE-1的细胞系以FLIPR检验法测定pHi的恢复情况以确定NHE-1抑制率。
检测在暗箱中置有含无菌培养基的96-孔微量滴定板的FLIPR(荧光成像平板读数器)中进行。经转染的表达不同亚型NHE的细胞系(亲代细胞系为诱变后筛选出的无内在NHE活性的LAP-1[得自Prof.Pouyssegur，Nice])的起始浓度为约25000个细胞/孔[转染细胞的生长培养基(Iscove+10％胎牛血清)中还含有选择性抗生素G418以保证转染序列的存在]。
真正的检测是从移走生长培养基并在每孔中加入载样缓冲液(5μM的BCECF-AM[2’，7’-二(羧乙基)-5-(及-6-)-羧基荧光素乙酸甲酯]、20mM的NH4Cl，115mM的氯化胆碱，1mM的MgCl2，1mM的CaCl2，5mM的KCl，20mM的HEPES，5mM的葡萄糖；调节pH至7.4[以氢氧化钾])后开始的。将细胞于37℃下孵育20分钟。孵育使细胞载入发出荧光的强度与pHi呈相关关系的荧光染料，而NH4Cl则使细胞呈弱碱性。[无荧光的染料前体BCECF-AM作为一种酯，具有细胞膜渗透性。而真正的染料BCECF没有细胞膜渗透性，是在细胞内由酯酶水解释放出来的。]
孵育20分钟后，在细胞清洗器(Tecan Columbus)中用每次400μl的洗涤缓冲液(133.8mM的氯化胆碱，4.7mM的KCl，1.25mM的MgCl2，1.25mM的CaCL2，0.97mM的K2HPO4，0.23mM的KH2PO4，5mM的HEPES，5mM的葡萄糖；调节pH至7.4[以氢氧化钾])清洗三次，以除去含有NH4Cl和未结合的BCECF-AM的载样缓冲液。在孔中残留物的体积为90μl(可能的范围是50-125μl)。这个洗涤步骤除去了未结合的BCECF-AM，而且由于除去了细胞外的NH4+离子，细胞内呈现酸性(～pHi6.3-6.4)。
由于除去细胞外的NH4+离子导致细胞内NH4+离子与NH3和H+离子的平衡被打破，接下来NH3可以即时穿透细胞膜，所以洗涤步骤导致H+离子滞留在细胞内，这是细胞内酸化的原因。如果这种现象持续足够长的时间将导致细胞死亡。
重要的一点是洗涤缓冲液中不能含有钠离子(＜1mM)，因为细胞外的钠离子会通过NHE的同工型活性迅速使pHi得以恢复。
同样重要的还有所有使用的缓冲液(载样缓冲液、洗涤缓冲液、恢复缓冲液)中不能含有HCO3-离子，因为碳酸氢根会导致干扰LAP-1亲代细胞系中存在的碳酸氢根依赖性pHi调节系统的活化。
将载有酸化细胞的微量滴定板转移至FLIPR中(在酸化后20分钟内)。在FLIPR中以氩原子激光发生器产生的波长为488nm的光激发细胞内的荧光染料，调整测定参数(激发光强度、照射时间、FLIPR配备的CCD照相机光圈数值)使每孔的平均荧光信号介于30000和35000的相对荧光单位之间。
FLIPR中的测定开始后用CCD照相机按照波长递减次序每两单位波长拍摄一次。10秒钟后开始用FLIPR配备的96-孔吸移管管理器加入90μl的恢复缓冲液(133.8mM的NaCl，4.7mM的KCl，1.25mM的MgCl2，1.25mM的CaCL2，0.97mM的K2HPO4，0.23mM的KH2PO4，10mM的HEPES，5mM的葡萄糖；调节pH至7.4[以氢氧化钠])恢复细胞内的pH。
阳性对照孔(100％的NHE活性)中只加入恢复缓冲液，而阴性对照(0％的NHE活性)只使用洗涤缓冲液。在所有其它孔中加入两倍于检测物质浓度的恢复缓冲液。FLIPR中的测定在测量60次后(2分钟)结束。
将未经处理的原始数据输入基于活性的方程中，首先计算出测试物质在各种浓度下的NHE活性，由此得出其IC50值。因为在试验中pHi的回复并不一直是线性的，而是在最后由于较高pHi处NHE活性的降低而下调，因此在评估测量值时选择适宜的范围为保证阳性对照中荧光的增高保持线性是很重要的。
实施例 NHE-1抑制IC50[nM] 1 15.6 2 24.2 3 8.6 4 10.8 5 15.6 6 16.5 7 11.7 8 10.2 9 13.9 10 67.7 11 19.5