《神经元细胞培养液及培养方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《神经元细胞培养液及培养方法.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610890624.4 (22)申请日 2016.10.12 (71)申请人 上海爱萨尔生物科技有限公司 地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路781号 807室 (72)发明人 高歌陈瑛 (74)专利代理机构 上海领洋专利代理事务所 (普通合伙) 31292 代理人 刘秋兰 (51)Int.Cl. C12N 5/0793(2010.01) (54)发明名称 神经元细胞培养液及培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于外周血单核细胞培 养神经元细胞的培养液， 所述培养液。
2、包括： 体积 比为1:0.81.2的DMEM/F12基础培养基和神经 细胞培养基， 以及神经生长因子、 腺苷酸环化酶 激活剂、 血清替代物、 L-抗坏血酸、 L-谷氨酰胺衍 生物、 ALK抑制剂、 GSK-3抑制剂、 GSK3抑制 剂、 ALK-2,3,6,AMPK抑制剂和TGF-R抑制剂。 本 发明还公开了一种由外周血单核细胞培养神经 元细胞的方法， 使用所述培养液， 可以外周血单 核细胞为原料定向分化培养得到神经元细胞， 取 材方便， 且无数量限制， 可避免道德争议。 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 CN 106367390 A 2017.02.01 CN 106367390 A 1。
3、.一种基于外周血单核细胞的神经元细胞培养液， 其特征在于， 所述培养液包括： 体积 比为1:0.81.2的DMEM/F12基础培养基和神经细胞培养基， 以及神经生长因子、 腺苷酸环 化酶激活剂、 血清替代物、 L-抗坏血酸、 L-谷氨酰胺衍生物、 ALK抑制剂、 GSK-3 抑制剂、 GSK3 抑制剂、 ALK-2,3,6,AMPK抑制剂和TGF- R抑制剂。 2.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于， 所述神经生长因子为Beta人类神经生长因 子； 所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素； 所述L-谷氨酰胺衍生物为GlutaMAX-I二肽； 所述血 清替代物为N2和/或B27； 所述ALK抑制剂为。
4、LDK378和/或AZD3463； 所述GSK-3 抑制剂为 TWS119、 CHIR-98014和/或CHIR-99021HCl； 所述GSK3 抑制剂为SB415286； 所述ALK-2,3,6, AMPK抑制剂为BML-275、 BML-2752HCl和/或LDN-193189； 所述TGF- R抑制剂为EW-7197和/或 SB-505124。 3.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于， 所述神经生长因子浓度为515 g/mL， 所 述腺苷酸环化酶激活剂浓度为15 mol/L， 所述血清替代物浓度为25mmol/L， 所述L-抗 坏血酸浓度为0.060.15mmol/L， 所述L-谷。
5、氨酰胺衍生物浓度为515mmol/L， 所述ALK抑 制剂浓度为0.10.3mmol/L， 所述GSK-3 抑制剂浓度为0.550.65mmol/L， 所述GSK3 抑制 剂浓度为0.450.64mmol/L， 所述ALK-2,3,6,AMPK抑制剂浓度为0.110.25mmol/L， 所述 TGF- R抑制剂浓度为0.160.28mmol/L。 4.如权利要求3所述的培养液， 其特征在于， 所述DMEM/F12基础培养基和所述神经细胞 培养基的体积比为1:1， 所述神经生长因子浓度为612 g/mL优选10 g/mL， 所述腺苷酸环 化酶激活剂浓度为24 mol/L优选3 mol/L， 所述。
6、血清替代物浓度为24mmol/L优选 3mmol/L， 所述L-抗坏血酸浓度为0.080.12mmol/L优选0.10mmol/L， 所述L-谷氨酰胺衍生 物浓度为612mmol/L优选10mmol/L， 所述ALK抑制剂浓度为0.160.22mmol/L优选 0.18mmol/L， 所述GSK-3 抑制剂浓度为0.580.63mmol/L优选0.60mmol/L， 所述GSK-3 抑 制剂浓度为0.480.60mmol/L优选0.50mmol/L， 所述ALK-2,3,6,AMPK抑制剂浓度为0.15 0.23mmol/L优选0.20mmol/L， 所述TGF- R抑制剂浓度为0.180.2。
7、5mmol/L优选0.22mmol/ L。 5.如权利要求3所述的培养液， 其特征在于， 其还包括青霉素和/或链霉素， 青霉素的浓 度为30200 g/mL优选80120 g/mL更优选110 g/mL， 链霉素的浓度为50300 g/mL优选 100250 g/mL更优选150 g/mL。 6.如权利要求3所述的培养液， 其特征在于， 其还包括视黄酸， 视黄酸浓度范围为0.01 0.28mmol/L优选0.080.15mmol/L更优选0.12mmol/L。 7.如权利要求36任一项所述的培养液， 其特征在于， 其还包括5-氟-2 -脱氧尿苷、 尿 苷和阿糖胞苷， 5-氟-2 -脱氧尿苷的浓。
8、度范围为520 g/mL优选1018 g/mL更优选15 g/ mL， 尿苷浓度范围为2050 g/mL优选3040 g/mL更优选35 g/mL， 阿糖胞苷浓度范围为1 8 g/mL优选26 g/mL更优选3 g/mL。 8.一种由外周血单核细胞培养神经元细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)用权利要求16任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养58天， 然后用权 利要求7所述的培养液培养3660小时， 移除未贴壁的细胞， 再用权利要求16任一项所述 的培养液培养26天得到原代培养物； 2)原代培养物用权利要求16任一项所述的培养液进行传代培养， 培养1528天即可 权利要求书 。
9、1/2 页 2 CN 106367390 A 2 得到神经元细胞。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于： 步骤1)具体为在3539优选37、 28优选5CO2条件下， 用权利要求16任一项 所述的培养液对外周血单核细胞进行培养58天， 培养期间每24天优选3天更换一次培 养液， 每次只换一半， 留一半原液； 然后用权利要求7所述的培养液培养48小时， 移除未贴壁 的细胞； 再用权利要求16任一项所述的培养液继续培养26天得到原代培养物， 继续培 养期间每13天优选2天更换一次培养液； 步骤2)具体为， 将步骤1)得到的原代培养物消化下来， 于3539优选37、 28优 选5CO2条件下用。
10、权利要求16任一项所述的培养液进行传代培养， 培养1528天得到神 经元细胞， 传代培养期间每13天优选2天更换一次培养液。 10.如权利要求8所述的培养方法， 其特征在于， 所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque 密度梯度离心法分离患者血样得到。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106367390 A 3 神经元细胞培养液及培养方法 技术领域 0001 本发明属于神经元细胞培养技术领域， 具体涉及一种神经元细胞的培养液及培养 方法。 背景技术 0002 神经系统疾病， 特别是中枢神经系统退行性疾病是临床中的常见病和多发病， 严 重危害着人类的健康。 世界卫生组织2007年2月发布的报。
11、告指出， 全球超过10亿人承受着神 经退行性疾病的痛苦， 2005年全球有2400多万人患有阿尔茨海默病； 其它中枢神经系统退 行性疾病， 如多发性硬化、 亨廷顿氏症和帕金森氏综合症， 也给患者带来极大的痛苦。 0003 已有研究表明， 利用人神经元细胞可研究神经损伤的机理以及筛选干预神经功能 的新药， 还可以通过移植来修复受损神经。 现有技术中， 人神经元细胞的获得方法主要包括 以下两种： 0004 一、 由胚胎干细胞诱导分化。 胚胎干细胞是取自人体胚胎， 具有分化成各组织器官 细胞能力的一类细胞。 胚胎干细胞经诱导分化可得到具有相应功能的神经元细胞， 可用于 药物筛选， 疾病机制研究。 但。
12、是由于受到伦理道德的限制， 目前可应用的胚胎干细胞系有 限， 无法获得各种疾病表型的神经元细胞， 限制了其在药物筛选和疾病机制研究方面的应 用， 而且由于这类神经元细胞来源于异体， 往往具有免疫排斥反应， 进一步限制了在临床细 胞治疗中的应用。 0005 二、 由诱导多功能干细胞诱导分化。 诱导多功能干细胞技术是干细胞应用领域的 一项新技术， 于2007年诞生， 该技术通过向体细胞(如皮肤细胞)中导入转录因子， 将体细胞 诱导成具有胚胎干细胞类似功能的诱导多功能干细胞， 诱导多功能干细胞具有无限增殖能 力， 能够分化为各组织器官细胞。 由于它来源于人体自身的体细胞， 避免了伦理道德的限制 和免。
13、疫排斥反应， 而且具有无限增殖能力， 在药物筛选、 疾病机制研究和未来临床细胞治疗 领域有较大的应用前景。 但是诱导多功能干细胞制备周期长， 一般需要48个月， 而且得到 诱导多功能干细胞后还需要12个月的时间进行分化才能得到神经元细胞， 这使得神经元 细胞的获得周期最短需要半年左右， 周期过长必然使得制备成本较高。 另外这种方法得到 的细胞稳定性相对欠缺， 具有致癌风险。 0006 综上， 由胚胎干细胞诱导分化受到伦理道德约束、 获得的神经元细胞数量有限且 具有免疫排斥反应， 而由诱导多功能干细胞诱导分化的制备周期长成本较高， 这些使得神 经元细胞在疾病机制研究、 药物筛选及临床细胞治疗中的。
14、应用受到较大限制。 发明内容 0007 因此， 本发明针对现有技术中神经元细胞的来源以及在应用中受到限制的技术问 题， 目的在于提供一种无来源限制， 可避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养神 经元细胞的培养液。 0008 本发明的基于外周血单核细胞的神经元细胞培养液包括： 体积比为1:0.81.2的 说明书 1/7 页 4 CN 106367390 A 4 DMEM/F12基础培养基和神经细胞培养基(Neurobasal)， 以及神经生长因子、 腺苷酸环化酶 激活剂、 血清替代物、 L-抗坏血酸、 所述L-谷氨酰胺衍生物、 ALK抑制剂、 GSK-3 抑制剂、 GSK3 抑制剂、 。
15、ALK-2,3,6,AMPK抑制剂和TGF- R抑制剂。 0009 所述培养液的各组分可协同诱导外周血单核细胞定向分化为神经元细胞。 其中， DMEM/F12基础培养基即含有体积比为1:1的DMEM培养基和F12培养基。 DMEM/F12基础培养基 和神经细胞培养基均为市售产品。 所述神经生长因子为Beta人类神经生长因子(英文名 Beta-NGF human， 氨基酸序列为SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR F。
16、IRIDTACVC VLSRKAVR， 购自Sigma-Aldrich， 货号SRP3018)是一些神经元存活、 生长和分化所必需的营 养因子。 所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素(英文名Forskolin， CAS号为66575-29-9)， 用于 通透细胞， 激活腺苷酸环化酶， 从而升高细胞内的cAMP水平。 所述血清替代物可选用N2和/ 或B27， 用于神经元细胞的原代细胞培养中有丝分裂后期神经元的生长和表达。 L-抗坏血酸 作为培养基中的生长因子。 所述L-谷氨酰胺衍生物选用GlutaMAX-I二肽， 作为培养细胞的 能量来源、 参与蛋白质的合成和核酸代谢。 所述ALK抑制剂可选用LDK3。
17、78(5-氯-N2-(2-异丙 氧基-5-甲基-4-(哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺， 又称色 瑞替尼， 英文名Ceritinib， CAS号为1032900-25-6)和/或AZD3463(N-4-(4-氨基-1-哌啶 基)-2-甲氧基苯基-5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺， CAS号为1356962-20-3)； 所述 GSK-3 抑制剂可选用TWS119(3-6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并2,3-D嘧啶-4-基氧基苯 酚， CAS号为601514-19-6)、 CHIR-98014(N6-2-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1。
18、H-咪唑-2-基)- 2-嘧啶基氨基乙基-3-硝基-2,6-二氨基吡啶， CAS号为556813-39-9)和/或CHIR- 99021HCl(6-2-4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基乙基氨 基吡啶-3-甲腈盐酸盐， CAS号为252917-06-9)； 所述GSK3 抑制剂可选用SB415286(3-(3- 氯-4-羟苯基)氨基-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮， CAS号为264218-23-7)； 所述ALK- 2,3,6,AMPK抑制剂可选用BML-275(6-4-2-(1-哌啶基)乙氧基苯基-3-(4-吡啶基)吡唑 并1,5-。
19、a嘧啶， 英文名为Dorsomorphin， CAS号为866405-64-3)、 BML-275 2HCl和/或LDN- 193189(6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并1,5-a嘧啶， CAS号为 1062368-24-4)； 所述TGF- R抑制剂可选用EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)- 4-1,2,4三唑并1,5-a吡啶-6-基-1H-咪唑-2-甲胺， CAS号为1352608-82-2)和/或SB- 505124(2-4-(1,3-苯并二氧杂环戊烷-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基-6-甲。
20、 基-吡啶， CAS号为694433-59-5)。 0010 所述神经生长因子浓度为515 g/mL， 所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为15 mol/L， 所述血清替代物浓度为25mmol/L， 所述L-抗坏血酸浓度为0.060.15mmol/L， 所 述L-谷氨酰胺衍生物浓度为515mmol/L， 所述ALK抑制剂浓度为0.10.3mmol/L， 所述 GSK-3 抑制剂浓度为0.550.65mmol/L， 所述GSK3 抑制剂浓度为0.450.64mmol/L， 所述 ALK-2,3,6,AMPK抑制剂浓度为0.110.25mmol/L， 所述TGF- R抑制剂浓度为0.16 0.28mmol。
21、/L。 0011 进一步的， DMEM/F12基础培养基和神经细胞培养基的体积比优选1:1， 所述神经生 长因子浓度优选612 g/mL更优选10 g/mL， 所述腺苷酸环化酶激活剂浓度优选24 mol/ L更优选3 mol/L， 所述血清替代物浓度优选24mmol/L更优选3mmol/L， 所述L-抗坏血酸浓 说明书 2/7 页 5 CN 106367390 A 5 度优选0.080.12mmol/L更优选0.10mmol/L， 所述L-谷氨酰胺衍生物浓度优选612mmol/ L更优选10mmol/L， 所述ALK抑制剂浓度优选0.160.22mmol/L更优选0.18mmol/L， 所述 。
22、GSK-3 抑制剂浓度优选0.580.63mmol/L更优选0.60mmol/L， 所述GSK-3 抑制剂浓度优选 0.480.60mmol/L更优选0.50mmol/L， 所述ALK-2,3,6,AMPK抑制剂浓度优选0.15 0.23mmol/L更优选0.20mmol/L， 所述TGF- R抑制剂浓度优选0.180.25mmol/L更优选 0.22mmol/L。 0012 本发明的一较佳实施例中， 其还包括青霉素和/或链霉素， 青霉素的浓度为30 200 g/mL优选为80120 g/mL更优选110 g/mL， 链霉素的浓度为50300 g/mL优选为100 250 g/mL更优选150。
23、 g/mL。 0013 本发明的一较佳实施例中， 其还包括视黄酸， 用于调控基因表达， 进一步促进定向 分化作用， 视黄酸浓度范围为0.010.28mmol/L优选0.080.15mmol/L更优选0.12mmol/ L。 0014 本发明的一较佳实施例中， 为加速神经元的分化， 所述培养液还包括5-氟-2 -脱 氧尿苷、 尿苷和阿糖胞苷， 5-氟-2 -脱氧尿苷的浓度范围为520 g/mL优选1018 g/mL更 优选15 g/mL， 尿苷浓度范围为2050 g/mL优选3040 g/mL更优选35 g/mL， 阿糖胞苷浓 度范围为18 g/mL优选26 g/mL更优选3 g/mL。 001。
24、5 本发明的另一目的在于提供一种由外周血单核细胞培养神经元细胞的方法， 所述 方法包括以下步骤： 0016 1)用权利要求16任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养58天， 然后 用权利要求7所述的培养液培养3660小时， 移除未贴壁的细胞， 再用权利要求16任一项 所述的培养液培养26天得到原代培养物； 0017 2)原代培养物用权利要求16任一项所述的培养液进行传代培养， 培养1528天 即可得到神经元细胞。 0018 本发明的一较佳实施例的所述方法中， 步骤1)具体为， 在3539优选37、 2 8优选5CO2条件下， 用权利要求16任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养5 8天。
25、， 培养期间每24天优选3天更换一次培养液， 每次只换一半， 留一半原液； 然后用权 利要求7所述的培养液培养48小时， 移除未贴壁的细胞； 再用权利要求16任一项所述的培 养液继续培养26天得到原代培养物， 继续培养期间每13天优选2天更换一次培养液(全 部更换)； 0019 步骤2)具体为， 将步骤1)得到的原代培养物消化下来， 于3539优选37、 2 8优选5CO2条件下用权利要求16任一项所述的培养液进行传代培养， 培养1528天 得到神经元细胞， 传代培养期间每2天更换一次培养液(全部更换)。 0020 所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。 。
26、0021 本发明的积极进步效果在于： 使用所述培养液， 经所述培养方法， 可将外周血单核 细胞培养得到神经元细胞。 一方面取材方便， 所述外周血单核细胞可取自患者或健康人血 液， 且无数量限制， 可避免道德争议； 另一方面， 与现有的动物模型相比， 本发明培养得到的 神经元细胞提供了最接近人体的体外细胞模型， 降低了或无免疫排斥反应， 更有利于疾病 机制研究、 药物筛选及临床细胞治疗。 说明书 3/7 页 6 CN 106367390 A 6 附图说明 0022 图1为外周血单核细胞的显微镜照片； 0023 图2为实施例1培养得到的神经元细胞的显微镜照片； 0024 图3为实施例1培养得到的神。
27、经元细胞的免疫荧光的显微镜照片； 0025 图4为实施例2培养得到的神经元细胞的免疫荧光的显微镜照片； 0026 图5为实施例3培养得到的神经元细胞的免疫荧光的显微镜照片； 0027 图6为实施例4培养得到的神经元细胞的免疫荧光的显微镜照片。 具体实施方式 0028 下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0029 实施例14利用外周血单核细胞培养成神经元细胞 0030 一、 培养液A和培养液B。 0031 实施例14的培养液A包括由DMEM/F12基础培养基和神经细胞培养基 (Neurobasal)混合而成的混合培养基， 以及添加在混合培养基中的添加组分。 各实施例的 DMEM/F12。
28、基础培养基和神经细胞培养基混合的体积比例、 添加组分及其含量如表1所示。 0032 表1培养液A的组分及含量 0033 说明书 4/7 页 7 CN 106367390 A 7 0034 0035 实施例14的培养液B分别在对应的培养液A的基础上另外添加有表2所示的用于 加快神经元分化的组分。 0036 表2培养液B的加速分化的组分及含量 0037 0038 备注： 表1和表2所述各物质均为市场上购得 0039 二、 培养过程 0040 实施例14分别使用表1所示的对应的培养液A和表2所示的对应的培养液B按照 以下步骤培养神经元细胞。 0041 1、 外周血单核细胞的分离(Ficoll-Paq。
29、ue密度梯度离心法) 0042 通过SepMateTM管中间小孔向管内加入3.5mL Ficoll-Paque(相对密度1.077)， 液 面超过管子内置管， 保持SepMateTM管直立放置于离心管架子上。 0043 取5mL DPBS+2FBS至于15mL离心管中， 然后加入5mL外周血血样， 盖好后轻轻地 来回颠倒4次混匀， 混匀后用移液管取10mL沿着SepMateTM管侧壁缓慢地加在Ficoll-Paque 上， 1200g离心10分钟。 0044 外周血单核细胞位于SepMateTM管最上层， 将最上层细胞悬液缓慢倒入新的15mL离 心管， 向离心管中加入5mL DPBS+2FBS。
30、， 300g离心8分钟。 弃去上清， 轻弹离心管底部， 再 加入5mL DPBS+2FBS， 300g离心5分钟。 弃去上清液， 轻弹离心管底部用剩余未吸走的 DPBS+2FBS重悬细胞得到外周血单核细胞， 外周血单核细胞的显微镜照片如图1所示。 0045 2、 神经元细胞的培养 0046 将得到的外周血单核细胞平均分到一块12孔板中， 并加入培养液A(1mL/孔)(若培 说明书 5/7 页 8 CN 106367390 A 8 养液存放于4冰箱中， 需提前取出室温预热20分钟)， 于37， 5CO2的孵箱里培养n1天， 期 间每3天更换一次培养液， 每孔每次只更换一般， 留一半原液。 004。
31、7 使用培养液B替换培养液A培养48小时， 加快神经元的分化。 0048 然后将12孔板置于无菌操作台中， 轻轻晃动12孔板， 使用吸引泵吸去培养液， 用 2mL移液管将死细胞以及未贴壁的细胞移除。 0049 用5mL移液管沿着孔壁缓慢加入新鲜的培养液A(1mL/孔)， 继续放入孵箱中培养n2 天， 培养液每2天更换一次。 0050 3、 神经元细胞的传代培养 0051 铺好4块传代用的新的4孔板， 加入基质胶(BD MatrigelTM hESC-qualified Matrix)(0.25mL/孔)， 置于37孵箱中孵育1个小时备用。 0052 取出孵箱中原代培养用的12孔板， 轻轻摇晃板。
32、， 吸去培养液后， 每孔加入1mL的 DPBS(pH7.4)洗一次， 然后每孔加入0.5mL的EDTA， 37孵箱内消化n3分钟后在倒置显微镜 下观察， 细胞群中间出现小孔即可停止消化。 轻轻晃动12孔板， 吸去消化液。 然后加入新鲜 的培养液A(1mL/孔)， 用1mL的移液枪尽可能的将细胞从板上吹下来(不用反复吹打， 避免传 代后细胞团过小， 影响细胞贴壁生长)。 0053 吸取孔中培养液分配于铺好加有基质胶的4孔板， 每孔的培养液分别平均分配至4 个含有基质胶的孔中， 即传代比例为1:4。 分配好后左右摇板各6下使板中细胞分布均匀， 然 后置于37， 5CO2的孵箱里培养， 培养n4天得。
33、到神经元细胞。 0054 其中实施例14的培养过程中的时间参数n1n4如表2所示 0055 表2各实施例的时间参数 0056 0057 效果实施例 0058 神经元细胞特征性蛋白的免疫荧光鉴定 0059 分别对实施例14所得的细胞按照以下步骤进行鉴定。 0060 1)固定细胞 0061 取培养完成的4孔板， 吸去培养液后， 沿4孔板板壁缓缓加入1PBS(pH7.4， 下同， 0.5mL/孔)， 洗2次； 然后沿板壁缓慢加入4的多聚甲醛(4PFA)(0.5mL/孔)， 室温放置15 分钟固定细胞， 轻柔地吸去4PFA， 加入1PBS洗3次(0.5mL/孔/次)。 0062 2)一抗孵育 0063。
34、 加入0.3Triton100(0.25mL/孔)， 于37孵育30分钟； 然后加入5的BSA (0.25mL/孔)封闭， 于37孵育30分钟； 然后直接在封闭液中加入一抗， 于37孵育1小时， 加入1PBS洗3次(0.5mL/孔/次)。 0064 其中， 一抗包括胆碱乙酰转移酶(CHAT)抗体、 微管蛋白(TUJ)抗体、 双皮质素(DCX) 说明书 6/7 页 9 CN 106367390 A 9 抗体、 少突胶质细胞转录因子-2(OLIG2)抗体、 酪氨酸羟化酶(TH)抗体和微管相关蛋白2 (MAP2)抗体， 使用上述每种一抗分别进行孵育， 加入后稀释比例分别为1:100、 1:1000、。
35、 1: 100、 1:100、 1:100和1:500。 0065 3)二抗孵育 0066 向一抗孵育后的4孔板中加入对应的用1BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗 (0.25mL/孔)， 37避光孵育30分钟后吸去二抗， 加入1PBS洗3次(0.5mL/孔/次)， 每次5分 钟； 然后加入用1PBS配好的终浓度为1 g/mL的DAPI(0.25mL/孔)， 染色30s， 吸去DAPI， 加 入1PBS洗2次(0.5mL/孔/次)； 最后加入1PBS(0.5mL/孔)， 显微镜下观察并拍照处理。 0067 其中的二抗包括驴抗绵羊二抗、 驴抗兔子二抗和驴抗老鼠二抗， 其中TH、 OLIG2、。
36、 DCX和MAP2使用驴抗兔子二抗， TUJ使用驴抗老鼠二抗， CHAT使用驴抗绵羊二抗(二抗均购自 life technologies)。 0068 鉴定结果如图36所示， 图36中AF分别显示实施例14培养得到的神经元细 胞的神经特征性蛋白TUJ、 CHAT、 TH、 OLIG2、 DCX和MAP2的免疫荧光染色情况， 其中CHAT是胆 碱能神经元细胞的特征蛋白， OLIG2为少突胶质细胞的特征蛋白， TH是多巴胺能神经元细胞 的特征蛋白， DCX是各类神经元中广泛存在的特征蛋白， MAP2和TUJ是各类神经元中都存在 的微管、 微丝等骨架蛋白。 由此可知以外周血血样为原料分离外周血单核细胞， 再使用本发 明的培养液和培养方法培养可得到多种神经元细胞。 说明书 7/7 页 10 CN 106367390 A 10 图1 图2 说明书附图 1/5 页 11 CN 106367390 A 11 图3 说明书附图 2/5 页 12 CN 106367390 A 12 图4 说明书附图 3/5 页 13 CN 106367390 A 13 图5 说明书附图 4/5 页 14 CN 106367390 A 14 图6 说明书附图 5/5 页 15 CN 106367390 A 15 。