《一种提高脂肪酶活力持续性的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种提高脂肪酶活力持续性的方法.pdf（4页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102242088 A (43)申请公布日 2011.11.16 CN 102242088 A *CN102242088A* (21)申请号 201010171802.0 (22)申请日 2010.05.14 C12N 9/20(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310012 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 阮晖 陈美龄 马风兰 廖文艳 陈赟 徐娟 王睿之 周陈伟 何国庆 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (5。
2、4) 发明名称 一种提高脂肪酶活力持续性的方法 (57) 摘要 本发明的一种提高脂肪酶活力持续性的方 法， 包括以下步骤 ： 将脂肪酶基因 (Genbank 号 ： AF229435) 连接 ( 常规方法 ) 在酿酒酵母细胞壁 成份 FLO 序列 (Genbank 号 ： S73336) 的 N 端， 然后 插入 ( 常规方法 ) 酿酒酵母表达载体 GAL 1 启动 子 (Genbank 号 ： AY428072) 下游 MF1 信号肽序 列 (Genbank 号 ： M17301) 的 C 端， 构建成表达框， 表达框从 N 端到 C 端 ： GAL1 启动子 +MF1 信号肽 序列 + 脂。
3、肪酶基因 +FLO 序列 ； 将包含该表达框的 酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明的优点 ： 将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分 FLO 连接， 如此 则只要酿酒酵母细胞保持存活状态， 脂肪酶即可 保持活力。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 102242092 A1/1 页 2 1. 一种提高植酸酶活力持续性的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 将植酸酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份 FLO 序列的 N 端， 然后插入酿酒酵母表达载 体GAL1启动子下游MF1信号肽序列的C端， 构建成表达框， 表达框从N端到。
4、C端 ： GAL1启 动子 +MF1 信号肽序列 + 植酸酶基因 +FLO 序列 ； 将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒 酵母细胞。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 将包含 “权利要求 1” 所述表达框的酿酒 酵母细胞培养于添加有重量百分比 3-6.5半乳糖的 YPD 培养基中。 权 利 要 求 书 CN 102242088 A CN 102242092 A1/2 页 3 一种提高脂肪酶活力持续性的方法 技术领域 0001 本 发 明 涉 及 一 种 生 物 工 程 领 域，特 别 涉 及 一 种 在 酿 酒 酵 母 (Saccharomycescerevisiae) 细。
5、胞壁外表面展露表达脂肪酶以提高该酶活力持续性的方 法。 背景技术 0002 酯是一大类在化工、 食品、 医药等领域广泛应用的重要产品或中间体， 仅用作食用 香料的酯即达数百种。各种酯的合成路线相同， 均以羧基供体 ( 如酸、 酸酐 ) 和羟基供体 ( 如醇、 淀粉等 ) 为原料， 通过酯化反应制备。 0003 脂肪酶能催化许多种酯的生物合成。与酯的化学合成相比， 酯的生物合成具有效 率更高、 反应条件温和、 能耗低等优点。 但目前应用的脂肪酶存在酶活力持续性不足这一问 题。包括脂肪酶在内的各种酶的重组表达方式有细胞内表达和分泌表达两种， 这两种酶的 重组表达方式使酶分子与宿主细胞之间没有关联，。
6、 即酶分子不是宿主细胞的组成部分， 从 而很容易失活。如果使酶分子成为细胞的有机组成部分， 则只要细胞保持存活状态酶分子 也会保持活力， 从而可以显著提高酶的活力持续性。 0004 本发明开发一种使脂肪酶成为酿酒酵母细胞有机组成的技术， 即将脂肪酶与酿酒 酵母细胞壁成分 FLO 连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分， 只要酿酒酵母细胞保持存活则 脂肪酶始终保持活性状态， 从而显著提高了脂肪酶活力持续性。 发明内容 0005 针对现有的脂肪酶活力持续性不足的问题， 本发明提供一种使脂肪酶成为酿酒酵 母细胞有机组成部分的技术， 使脂肪酶只要酿酒酵母细胞保持存活即可保持活力， 从而显 著提高脂肪酶活力持。
7、续性。 0006 本发明的一种提高脂肪酶活力持续性的方法， 包括以下步骤 ： 0007 将脂肪酶基因 (Genbank 号 ： AF229435) 连接 ( 常规方法 ) 在酿酒酵母细胞壁成份 FLO 序列 (Genbank 号 ： S73336) 的 N 端， 然后插入 ( 常规方法 ) 酿酒酵母表达载体 GAL1 启 动子 (Genbank 号 ： AY428072) 下游 MF 1 信号肽序列 (Genbank 号 ： M17301) 的 C 端， 构建 成表达框， 表达框从 N 端到 C 端 ： GAL1 启动子 +MF 1 信号肽序列 + 脂肪酶基因 +FLO 序 列 ； 将包含该表。
8、达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。 0008 将包含 “权利要求 1” 所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有 4.2-6.8 ( 重量 百分比 ) 半乳糖 ( 普通半乳糖 ) 的 YPD 培养基中 0009 本发明的优点 ： 将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分 FLO 连接， 如此则只要酿酒酵母 细胞保持存活状态， 脂肪酶即可保持活力。 具体实施方式 0010 以下通过实施例进一步对本发明进行描述 ： 说 明 书 CN 102242088 A CN 102242092 A2/2 页 4 0011 实施例 1 脂肪酶展露表达 0012 将脂肪酶基因 ( 来自 Rhizopus oryzae， Genb。
9、ank 号 ： AF229435) 连接在酿酒酵母 细胞壁成份 FLO 序列 ( 来自酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae， Genbank 号 ： S73336) 的 N 端， 然后插入酿酒酵母表达载体 GAL1 启动子 ( 来自酿酒酵母表达载体 pYES263， Genbank 号 ： AY428072) 下游 MF 1 信号肽序列 ( 来自酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae， Genbank 号 ： M17301) 的 C 端， 构建成表达框 ( 从 N 端到 C 端 ) ： GAL1 启动子 +MF 1 信 号肽序列 + 脂肪酶基因 +FL。
10、O 序列。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞 (Saccharomycescerevisiae， 购自安琪酵母股份有限公司 )， 则 MF 1 信号肽将引导脂肪 酶向酿酒酵母细胞外分泌， 而脂肪酶下游的 FLO 序列则锚定在酿酒酵母细胞壁中， 从而使 脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。 0013 实施例 2 脂肪酶展露表达的诱导 0014 在培养酿酒酵母的YPD培养基中， 添加4.2-6.8半乳糖(购自上海生工生物工程 有限公司， Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo.， Ltd.)， 则表达框 “。
11、GAL1 启动子 +MF 1 信号肽序列 + 脂肪酶基因 +FLO 序列” 中的 GAL1 启动子就 会活化， 诱导脂肪酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。 0015 实施例 3 半乳糖对脂肪酶展露表达的作用 0016 在培养酿酒酵母的 YPD 培养基中， 如果不含半乳糖， 则未检测到脂肪酶活性， 这是 因为表达框 “GAL1 启动子 +MF 1 信号肽序列 + 脂肪酶基因 +FLO 序列” 中的 GAL1 启动子 无法活化。 0017 实施例 4 脂肪酶展露表达后其活力持续性显著提高 0018 按照实施例 1 和实施例 2 所示步骤进行展露表达的脂肪酶活性为 512U/mL(4.2 半乳糖 )。
12、 和 505U/mL(6.8半乳糖 )， 半衰期均为 65 天， 即第 65 天时能保持起始活性的一 半。而如果在实施例 1 和实施例 2 所示的展露表达表达框 “GAL1 启动子 +MF1 信号肽序 列 + 脂肪酶基因 +FLO 序列” 中去除 FLO 序列序列， 则脂肪酶进行分泌表达， 活性为 141U/ mL(4.2半乳糖 ) 和 137U/mL(6.8半乳糖 )， 半衰期均仅为 7 天， 即第 7 天时能保持起始 活性的一半。因此， 将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分 FLO 连接而成为酿酒酵母细胞的组成 部分， 只要酿酒酵母细胞保持存活则脂肪酶始终保持活性状态， 从而显著提高了脂肪酶活 力。
13、持续性。 0019 对脂肪酶活性测定采用脂肪酸释放测定法， 活性单位定义为 ： 在 pH 7.0 的 25 橄榄油 ( 购自上海生工生物工程有限公司， Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.， Ltd.) 溶液中， 每分钟释放出 1mol 脂肪酸 ( 标准品购自上海 生工生物工程有限公司， Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.， Ltd.) 的酶量定义为 1 个脂肪酶活力单位 (U)。 0020 最后， 需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然， 本发明不限于 以上实施例子， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102242088 A 。