从蛋白质溶液中去除传染性 海绵状脑病病原体的方法 本发明涉及从蛋白质溶液，特别是从将要用于治疗和其他医学目的的血制品中去除传染性海绵状脑病(TSEs)病原体的方法。使蛋白质溶液与可以结合病原体的吸附剂接触。
在第二次世界大战中，美国研究出了从人血浆中分离蛋白质的方法。这些分离出的蛋白质在医学上用作治疗剂。白蛋白，免疫球蛋白，血纤蛋白原，凝固因子和多种其他蛋白质是这种方法的产物的例子。白蛋白用于例如烧伤患者或者更通常地用于血量不得不增加的疾病患者。免疫球蛋白可以用于自身不能合成保护性抗体的患者。凝结因子浓缩物(特别是因子VIII和因子IX)用于血友病患者。在很多情况下这些制剂可以拯救生命并且它们没有替代物。
从血浆中分离各种蛋白质的方法基于几种不同的原理。仍然在大规模使用的较早的方法是以用乙醇进行蛋白质分级沉淀并且接着通过离心或过滤分离各相为基础。在较新的分级分离案中，也使用其他分离方法，例如离子交换色谱或(免疫)亲和层析。一套完整的分离方案通常包括合并在一个优化过程中的几种不同的方法。
在使用人血浆蛋白的头几年，人血制备品也明显具有缺陷：它们可能传播一些病毒引起地传染性疾病。开始时最重要的病毒是肝炎病毒(乙肝)。后来其他形式的肝炎成为已知的(最近鉴定的非甲非乙肝炎，并且称之为丙肝)。血液和血制品传播的最为广泛公知的病毒是HIV(人免疫缺陷病毒)，艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)的病原体。除了到现在为止提到的那些一外，还有也可能由血浆和血浆衍生物传播的一些其他病毒。
近几年来已知具有某些共同特征的其他可传播疾病。它们被称为TSE并且认为通过非常规的传染源(Scheinker)(NCTA)进行传播。人类疾病克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob)(CDJ)，格-施病源(Scheinker)(GSS)，致命的家族失眠症(FFI)和库鲁病(kuru)都属于这一类，以及一些动物疾病，最广泛公知的是绵羊痒病和牛海绵状脑病(BSE；“疯牛病”)也属于这一类。感染的人或动物都表现出神经变性症状并且这些疾病总是致命的。CJD，该组中最为广泛公知的人类疾病，常常分散性发病；但是在某些情况下，发现某些家族群体发生。曾经公开过通过垂体腺提取物，神经外科手术中使用的污染的用具和角膜或硬脑膜移植用具进行latrogenic传播。从来没有发现通过输血传播任何这类人类疾病。对输血受试者流行病追溯研究没有表明CJD比例与没有输血的对照者相比有所增加[T.F.G.Esmonde，R.G.Will，J.M.Slattery等：克罗伊茨费尔特-雅各布病和输血。Lancet1993，341：205-207]。对后来死于确诊的CJD的人提供的浓缩红细胞的受者的追溯没有发现一个不正常神经或精神病的病例[N.Heye，S.Hensen，N.Muller：克罗伊茨费尔特-雅各布病和输血。Lancet1994，343：298-299]。因此通过输血传播TSE必定是要么非常少要么非常不充分或者两者皆而有之。公众和管理当局从来没有警告潜在的问题，需要保证实施最大程度的关心以保护患者避免可能的对NCTAs的暴露。
证明存在一种感染源没有受到怀疑。但是关于该试剂的精确性质仍然有争议。在过去，很多研究人员相信疾病是由慢病毒引起的；当今最普遍的假设是感染源是一种可能包含核酸或者可能不包含核酸的蛋白质微粒，称之为朊病毒。朊病毒以至少两种不同的形式存在，一种通常在细胞中发现，称之为PrPc，另一种形式只是存在于感染疾病的个体中，称之为PrPsc，PrPres，因为其与瘙痒病相关或者因为其对蛋白酶特别是对蛋白酶K降解的抗性。PrPc和PrPres之间的不同是由于蛋白质的折叠或三级结构变化引起的，占优势的?-螺旋构象最可能变化为?-片层。PrPres与TSE相关或者可能是TSE的成因。同时也讨论了所涉及的其他因子(辅助因子，即核酸或其他蛋白质)。
通过5种方法在不同水平上提高血液和血液衍生物的安全性：(1)采集生物样品尽可能排除已知有传播传染病高度危险性的供体。这借助于调查进行，使得排除具有增加的危险因素的人群。具有增加的危险因素的人群是例如患有某些疾病的人，在供血之前短期访问过某些国家的人，通过其性活动或使用污染针管吸毒而带来危险的人，角膜或硬脑膜移植的接受者，接收垂体激素治疗的人或家族有CJD病史的人，(2)实验室分析确定感染的供体，使其不再接收进一步的处理。这两种方法一起使用结果去除大部分感染的供体但不是全部：(a)试验方法的敏感度可能是不足够；(b)可能还没有获得用于特定感染源的试验；由于实际和经济原因还不可能筛选所有潜在的感染源；(c)试验不是检测感染源本身而是对感染应答的受感染者产生的抗体。从感染时至可检测抗体出现，通常过去了几天或几星期(称之为表面现象)。抗体测试在这期间是没有用的；(d)感染的供体可能因为笔误而漏过。(3)关于传播感染源的安全性通过引入到生产过程中的将感染剂灭活或者去除的特殊步骤而提高。(4)严格遵守实际操作规程(GMP)保证(3)中提到的步骤的效率。(5)全程跟踪每一位供体和相应的产品并从最终产品回到各个供体使直接回收产品，这成为必须的。
现在广泛确立了检测，灭活和消除血液和血浆制品中感染病毒的方法。商售检测系统在世界范围广泛用于检测例如抗人免疫缺陷病毒或抗丙肝病毒抗体。可以通过各种各样的热处理(或者是溶液状态或者是干燥状态；在不同的温度及不同的时间处理)，通过化学处理(使用溶剂和去污剂的组合或者使用碘)或者光化学处理(例如暴露于?-丙醇酸内酯和紫外光；照射其中加入了合适的染料的蛋白质溶液)，或者通过任何很多公知的方法来实现病毒的灭活。还在开发着新的方法。现在毫无疑问取消从人血浆制备药品对已知病毒的传播，未知病毒的传播至少在程度上不会再提高。
遗憾的是这种情况对于NCTA更困难。通常对于供血者的询问目的是排除其生活其后有增加的得CJD危险的那些人(家族成员曾经患CJD或者类似疾病?供体是否曾经接受垂体激素或者角膜/硬脑膜移植?)。毫无疑问这一系列提问会排除一些潜在的病原性和家族情况，但是它不会影响潜在的单个情况。因此通过询问排除高危供体偶然性最大，并且可以预计很多情况会漏过去。供体的筛选还是不可能的。尽管已经研究出了识别PrP的单克隆抗体，但是大多数不能区分PrPc和PrPres，因此测定中一定要结合蛋白酶消化，这使得日常使用麻烦。更糟的是，其根本不能保证在血液或血浆中是否会发现PrPres；组织样品的较好来源是脑活组织检查，其清楚地表明用供体血液是不可能的。有可能开发出以刚刚描述的与PrPres特异性反应的单克隆抗体为基础的测定[Korth等：单克隆抗体测定的朊病毒(PrPsc)]-特异性表位(Prion(PrPsc)-specific epitope defined by monoclonalantibody)。自然(Nature)1997，390：74-77]；但是还没有做到这一点。
遗憾的是，TSE试剂罕见有抗灭活的稳定性。上面提到的灭活病毒的方法没有减小NCTAs的感染。事实上，它们甚至在高压灭菌(121℃蒸汽处理15分钟)下和埋藏在地下也能存活几年。已知可靠灭活NCTAs的几个条件是：在提高的温度下高压灭菌(≥134℃至少18分钟)；用1Mol/L的氢氧化钠溶液处理，优选在高温下处理；强氧化条件(次氯酸钠)；强离液序列高的条件(异硫氰酸胍)。如果对人血浆蛋白质溶液使用这样的条件，则蛋白质自身将至少和NCTAs一样快地灭活。这只是物理去除NCTAs的一个选择。因为感染化合物单体具有和人血浆蛋白质一样的大小，所以不容易通过例如(纳米)过滤或离心去除。确实证明纳米过滤能去除NCTAs，但是去除取决于某些溶质的存在或不存在；例如感染源在表面活性剂的存在下通过过滤器。
因此加工人血液或血浆的公司有必要工业化应用使得从蛋白质溶液中安全去除NCTAs的方法。为了减小用这样的产品治疗患者的感染的理论上所存在的危险，本发明的目的是描述使得在工业规模上从蛋白质溶液分离NCTAs的方法；该方法可以是任何现行血浆分级方法的一部分。
因此，本发明的目的是提供从怀疑污染有NCTAs的蛋白质溶液中安全去除NCTAs的方法。
发现蛋白质溶液中可能存在的NCTA吸附某些材料，例如经修饰的纤维素，硅藻土，膨润土，火山岩，合成聚合物的颗粒等等。如果让蛋白质溶液与这些材料接触足够长的时间，溶液分离成沉淀和上清液，结果导致沉淀步骤本身实现的去除外进一步去除NCTA。上面提到的物质较早地加到血浆分级分离中，称之为助滤剂，以有利于在乙醇分级分离中分离沉淀和上清液。助滤剂在多孔过滤膜上形成一层并且它们促进过滤，因为它们对于液体是可渗透的而对于固体颗粒则不渗透。助滤剂防止小的蛋白质颗粒阻塞滤器孔。
早期专利(EP0679405Al)中描述过通过类似方法从蛋白质溶液中去除不同的病毒。考虑到如上所述关于NCTA的性质仍然存在争论的事实，它们会象病毒一样表现不是十分明显的。
本发明的主题是权利要求1中定义的方法和从属权利要求中定义的具体实施方案。
根据本发明，通过在固相上的吸附从蛋白质溶液中去除NCTAs，所述固相或者悬浮于溶液中以吸附NCTAs或者事先在多孔过滤器上已经形成固相。使蛋白质溶液与吸附剂接触至少一次，所述吸附剂选自硅藻土(kieselguhr)，硅藻土(diatomaceous earths)，硅酸，粘土矿物，金属氢氧化物或水合金属氧化物(metal oxihydrate)，纤维素，珍珠岩和不溶于水的合成聚合物，或者这些材料的混合物或组合物；接触时间至少10分钟。接着，通过过滤或者任何其它合适的方法将悬浮液分离为上清液和沉淀。
用于该项技术的固相是例如助滤剂Celite(Johns-ManvilleCorp.)，Aerosil(Degussa)，珍珠岩，热膨胀珍珠岩，膨润土，或者可以通过过滤或离心从悬浮液中去除的通常细密分布的固体。象金属氢氧化物凝胶这样的物质(例如Alhydrogel Al(OH)3，水凝胶)也是合适的。
NCTAs在提到的材料上的吸附取决于所使用的材料，NCTAs和条件。随着条件的系统变化，吸附到相同材料上的具体NCTAs的“厚度”可能变化。有可能通过例如改变介质的pH值来改变NCTAs对特定材料的吸附。其它溶液参数例如温度，离子强度，盐和有机溶剂也可以影响NCTAs的吸附并且可以为了提高吸附而使用，从而从蛋白质溶液中去除NCTAs。
即使只是10分钟短时间处理蛋白质溶液也能导致NCTAs的基本去除。但是，为了提高NCTAs的去除程度，处理更长的时间是有利的。处理时间可以是大约15分钟，30分钟，大约1小时，大约2小时，大约6小时，大约8小时，大约12小时，大约14小时，大约16小时，大约20小时。
或者通过离心或者通过过滤可以去除包括被吸附的NCTAs的吸附剂。可以以不同方法进行离心，例如通过间歇式方法或连续离心。调节离心力和离心时间使得保证彻底分离吸附材料和上清液。在实验室规模上，可以使用瓷漏斗或类似仪器进行过滤。更大规模上(生产)其它设备是优选的，例如加过滤或旋转过滤。实验
明显地，不可能使用人CJD或类似人疾病的病原体进行实验。为了研究关于NCTAs的行为，有必要借助模型系统。一个已经建立完好的系统是仓鼠瘙痒病模型。下面是该模型的简要描述：首先，从患病动物大脑制备接种物；小心取出大脑并且用9体积的磷酸缓冲盐水超声处理匀浆。当将50μl颅内接种给健康仓鼠时该制剂可以传递该疾病。根据接种物的效价，将会在几星期或几个月内发病。不管哪一种情况在前对所有的动物观察一年或者直到它们死亡。特征行为变化证明疾病自身，例如对噪音的提高的反应和运动失调。通过用缓冲液1次至10次稀释接种物并且将这些稀释液接种给动物，可以确定接种物的效价；效价是在接种的一半动物中引发疾病的最后稀释度的倒数。如上所述制备的接种物具有大约1012的效价。该模型的优点是它对于感染源性质不作任何假设，因为测试依赖于临床疾病。因此感染源可能是一种或多种蛋白质，有或没有所涉及的核酸，慢病毒或者任何其它实体，其总是测定的感染源。因此该系统可以用来测定是否物理去除或灭活了TSE的病原体。类似于使用病毒的证实实验进行实验，这在过去大约10年的文献中已经详细描述；在所评价的产物的纯化方法的特定步骤中加入少量感染物质(称之为强化(spike))并且测定其活性。然后进行下一个处理步骤(例如沉淀，接着分离沉淀和上清液；热灭活)并且在物理分离情况下在两相中滴定残留的活性，或者在灭活情况下作为时间的函数滴定残留的活性。可以从这些测定计算灭活系数，前提是正确根据平衡记录单或动力学。以NCTAs的情况，滴定特别麻烦，因为每一个滴定点需要使用几种动物；因此要相应地修改方案。只有在几个月之后才得知实验的结果，界时感染的动物要么患有该疾病要么保持健康。
实施例
通过将稀释液注入仓鼠大脑中小心滴定在下面所有实施例中使用的脑匀浆。观察187天后不同组中患病动物和健康动物的分布如下： 稀释度 攻击1 攻击2 10-1 4/4 4/4 10-2 4/4 4/4 10-3 4/4 4/4 10-4 4/4 3/3 10-5 4/4 4/4 10-6 4/4 4/4 10-7 4/4 3/4 10-8 5/8 6/8 10-9 3/8 2/8 10-10 0/4 1/4 10-11 0/4 0/4
从这些数据可以计算出匀浆的滴定度大约是109。对于所分析的每一种溶液可以得到类似的表。由这些数据计算每一个样品的清除率；在每一个实施例中指明。实施例1(对于该实施例和下面的实施例，参照图示根据Kistler/Nitschmann的血浆分级分离方法的图1)
将58毫升人血浆搅拌并冷却到1℃。加入0.58毫升脑匀浆。伴随血浆冷却到-5.5℃加入乙醇至19％的最终浓度。将pH调节到5.8后加入珍珠岩，并且将悬浮液离心。上清液中的感染力减小到大约105分之一。实施例2
将40毫升滤液在-5.5℃下搅拌。加入0.4毫升脑匀浆，接着加入乙醇至40％最终浓度。温度降低到-7℃并将pH调节到5.95。加入珍珠岩和Celite的混合物。将悬浮液离心。上清液中的感染力减小到大约105分之一。实施例3
将52毫升沉淀A在1℃下搅拌。加入0.52毫升脑匀浆。加入缓冲液并将pH调节到5.1。加入水后加入乙醇至25％最终浓度。伴随温度降低到-3℃。加入珍珠岩并将悬浮液离心。上清液中的感染力减小到大约106分之一。实施例4
将33毫升再次悬浮的沉淀GG(其含有得自前面步骤的助滤剂)冷却到4℃。加入0.33毫升脑匀浆。将悬浮液离心。上清液中的感染力减小到大约107分之一。实施例5
将50毫升免疫球蛋白溶液G在4℃下搅拌。加入0.5毫升脑匀浆后接着加入助滤剂(Celite 577)。将悬浮液离心。上清液中的感染力减小到大约106分之一。实施例6
将33毫升再次悬浮的沉淀GG冷却到4℃并且根据实施例4所述掺加。将悬浮液离心并且根据实施例5进一步处理上清液(加入助滤剂后接着离心；相应地调节体积)，但是不另外加入脑匀浆。观察200天后，用第二种上清液注射的动物没有一个表现出疾病症状。这表明在合适的助滤剂存在下连续两次过滤基本上比任何单一过滤去除更多的感染源。