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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710512083.6 (22)申请日 2017.06.28 (71)申请人 中国检验检疫科学研究院 地址 100176 北京市大兴区北京市亦庄经 济技术开发区荣华南路11号 (72)发明人 赵红阳卢行安刘莉莉孙英健 王秀君王伟王建华凌莉 (74)专利代理机构 大连博晟专利代理事务所 (特殊普通合伙) 21236 代理人 杨迪 (51)Int.Cl. C12Q 1/14(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 。
2、1/19(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品及其制备 方法 (57)摘要 本发明属于微生物学检测方面的质量控制 领域， 特别涉及一种乳粉中金黄色葡萄球菌标准 样品及其制备方法。 乳粉中金黄色葡萄球菌标准 样品包括目标菌和背景菌群， 所述目标菌为金黄 色葡萄球菌， 所述背景菌群由弗氏柠檬酸杆菌、 大肠埃希氏菌、 肺炎克雷伯菌、 蜡样芽胞杆菌组 成。 本发明均匀性、 稳定性符合标准样品要求， 可 以最大程度保证标准。
3、样品的稳定性， 从满足特殊 运输的条件着手， 通过特殊工艺的研究、 稳定性 和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品的 样品制备技术， 适合于制备符合标准样品要求的 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品， 适用于实验室 的质量控制、 方法验证等用途。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 107236784 A 2017.10.10 CN 107236784 A 1.乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品， 其特征是： 包括目标菌和背景菌群， 所述目标菌为 金黄色葡萄球菌， 所述背景菌群由弗氏柠檬酸杆菌、 大肠埃希氏菌、 肺炎克雷伯菌、 蜡样芽 胞杆菌组成。 2.根据权利要求1所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准。
4、样品， 其特征是： 所述样品以海藻 糖、 脱脂奶粉和无菌水为基质， 其中海藻糖的体积分数为12、 脱脂奶粉的体积分数为15%。 3.根据权利要求1或2所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品， 其特征是： 所述样品中 目标菌的目标浓度为102103 CFU/mL， 背景菌群的目标浓度为103 CFU/mL。 4.根据权利要求1所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法， 其特征是： 包括 样品添加菌株的选择、 冻干保护剂的配制、 样品冻干、 样品的均匀性和稳定性试验四个步 骤， 其中样品冻干过程为： 菌株复苏传代增菌菌悬液配制冻干和包装储存， 具体过 程为： （1） 菌株复苏传代 将标准菌株加入到。
5、营养琼脂斜面培养基中， 在361下使其复苏和生长， 并对复苏的 菌株进行鉴定； （2） 增菌 目标菌培养至对数生长期末， 背景菌群培养至稳定期， 从斜面刮取菌落， 加到10mL的冻 干保护剂中制成相应单一菌种的菌液； （3） 菌悬液配制 将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合， 按目标菌的目标浓度102103 CFU/mL和背 景菌群的目标浓度103 CFU/mL配制菌悬液， 分别配制目标菌的菌悬液和4个背景菌的菌悬 液， 背景菌按1:1的体积比例混合形成背景菌群悬液， 再将目标菌悬液和背景菌群悬液按1： 1体积比混合， 置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中， 加上瓶塞， 但要留有空隙， 不。
6、 要盖实； （4） 冻干和包装 将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中， 冷冻干燥5055h， 当样品冷冻干燥结 束后， 直接进行箱内加塞， 关闭机器， 样品瓶中样品为真空状态； （5） 储存 将样品放置在-18条件下避光保存， 从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进 行均匀性和稳定性试验。 5.根据权利要求4所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法， 其特征是： 所述 冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水， 其中体积分数分别为： 海藻糖12%、 脱脂奶 粉15%。 6.根据权利要求4所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法， 其特征是： 所述 样品的均匀性和稳定性试验按照GB。
7、/T 15000.3-2008 标准样品工作导则 （3） 标准样品 定 值的一般原则和统计方法 进行。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107236784 A 2 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品及其制备方法 0001 技术领域 0002 本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域， 特别涉及一种乳粉中金黄色葡萄 球菌标准样品及其制备方法。 背景技术 0003 乳粉微生物学检验领域非常特殊。 目前， 国内外尚未有机构制备乳粉微生物学标 准样品和大规模生产的先例， 仍属空白领域。 目前虽有一些机构制备微生物类的标准样品， 但标准样品的均匀性和稳定性几乎不能满足要求， 运输极为困难； 或标准样品为仅含。
8、有目 标菌的纯菌株， 与实际样品差距较大， 不能满足日常实验室质量控制等需要。 0004 金黄色葡萄球菌为常见的一种革兰氏阳性菌， 广泛分布于自然界， 可以引起人和 动物的感染。 人类感染金黄色葡萄球菌后， 即可引起皮肤的局部化脓性感染， 也可引起严重 的内脏器官感染， 甚至败血症、 中毒性休克等。 金黄色葡萄球菌产生的肠毒素可沾染食物而 致食物中毒。 如果制备的金黄色葡萄球菌样品中， 目标菌易发生变化(繁殖和死亡等)， 就会 导致样品的保存期短， 样品的均匀性和稳定性差， 影响质量控制效果。 因此， 综合考虑细菌 的生化特性， 选取性质相对稳定的菌群作为目标菌对保证样品的均匀性和稳定性十分重。
9、 要。 金黄色葡萄球菌样品制备的工艺技术要求比较高， 并且样品的均匀性和稳定性与冻干 的菌种、 冻干的工艺条件、 冻干保护剂的使用、 再水化的介质等均有密切的关系。 0005 乳粉中金黄色葡萄球菌指标， 直接反映着乳粉的卫生质量与潜在致病风险。 如果 金黄色葡萄球菌数超过一定限量， 就会导致食源性疾病发生。 因此， 制备均匀性与稳定性俱 佳的金黄色葡萄球菌标准样品， 可以避免金黄色葡萄球菌检验的随意性和不确定性， 有效 地保证检测结果的准确可信。 这对提高实验室质量控制水平， 保障乳粉安全， 甚至于打破国 际贸易壁垒、 提高我国乳粉国际竞争力都具有特殊重要的意义。 发明内容 0006 本发明的。
10、目的是克服金黄色葡萄球菌标准样品中目标菌的活菌数目在运输、 储存 和测试等过程中总菌落数都可发生变化的问题， 提供一种乳粉中金黄色葡萄球菌标准样 品， 均匀性、 稳定性符合标准样品要求， 本发明的另一个目的是提供该样品的制备方法， 工 艺简单， 成功率高。 0007 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是： 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品， 其特征是： 包括目标菌和背景菌群， 所述目标菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)， 所述背景菌群由弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、 大肠埃希氏菌 (E.coil)、 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapn。
11、enmoniae)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)组 成。 0008 所述样品以海藻糖、 脱脂奶粉和无菌水为基质， 其中海藻糖的体积分数为12、 脱 说明书 1/8 页 3 CN 107236784 A 3 脂奶粉的体积分数为15。 0009 所述样品中目标菌的目标浓度为102103CFU/mL， 背景菌群的目标浓度为103CFU/ mL。 0010 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法， 其特征是： 包括样品添加菌株的选 择、 冻干保护剂的配制、 样品冻干、 样品的均匀性和稳定性试验四个步骤， 其中样品冻干过 程为： 菌株复苏传代增菌菌悬液配制冻干和包装储存， 具体过程为。
12、： (1)菌株复苏传代 将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中， 在361下使其复苏和生长， 并对复苏的 菌株进行鉴定； (2)增菌 目标菌培养至对数生长期末， 背景菌群培养至稳定期， 从斜面刮取菌落， 加到10mL的冻 干保护剂中制成相应单一菌种的菌液； (3)菌悬液配制 将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合， 按目标菌的目标浓度102103CFU/mL和背 景菌群的目标浓度103CFU/mL配制菌悬液， 分别配制目标菌的菌悬液和4个背景菌的菌悬 液， 背景菌按1:1的体积比例混合形成背景菌群悬液， 再将目标菌悬液和背景菌群悬液按1： 1体积比混合， 置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中，。
13、 加上瓶塞， 但要留有空隙， 不 要盖实； (4)冻干和包装 将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中， 冷冻干燥5055h， 当样品冷冻干燥结 束后， 直接进行箱内加塞， 关闭机器， 样品瓶中样品为真空状态； (5)储存 将样品放置在-18条件下避光保存， 从全部样品中随机挑选样品发放给参试实验室 或进行均匀性和稳定性试验。 0011 所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水， 其中体积分数分别为： 海藻 糖12、 脱脂奶粉15。 0012 所述样品的均匀性和稳定性试验按照GB/T 15000.3-2008 标准样品工作导则(3) 标准样品定值的一般原则和统计方法 进行。 0013 本发。
14、明菌种的选择采用金黄色葡萄球菌作为目标菌， 以弗氏柠檬酸杆菌、 大肠埃 希氏菌、 肺炎克雷伯菌、 蜡样芽胞杆菌作为背景菌群， 最大程度保证测试样品的稳定性， 且 不影响金黄色葡萄球菌的检测。 0014 本发明的金黄色葡萄球菌标准样品具有以下优势特性： 活的微生物、 数量不发生 变化、 生化特征不发生变异， 从满足特殊运输的条件着手， 通过特殊工艺的研究、 稳定性和 均匀性的研究等形成一套完善的标准样品的制备技术， 适合于乳粉中金黄色葡萄球菌标准 样品的制备。 附图说明 0015 图1为本发明工艺流程图。 说明书 2/8 页 4 CN 107236784 A 4 具体实施方式 0016 下面结合。
15、附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述， 但本发明并不局限于具 体实施例。 0017 实施例1 乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品， 包括目标菌和背景菌群， 所述目标菌为金黄色葡萄 球 菌 ( S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) ， 所 述 背 景 菌 群 由 弗 氏 柠 檬 酸 杆 菌 (Citrobacterfreundii)、 大肠埃希氏菌(E .coil)、 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pnenmoniae)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)组成。 0018 所述样品以海藻糖、 脱脂奶粉和无菌水为基质， 其中海藻糖的体。
16、积分数为12、 脱 脂奶粉的体积分数为15。 0019 所述样品中目标菌的目标浓度为102103CFU/mL， 背景菌群的目标浓度为103CFU/ mL。 0020 实施例2 如图1所示， 一种实施例1中乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法， 包括样品添 加菌株的选择、 冻干保护剂的配制、 样品冻干、 样品的均匀性和稳定性试验四个步骤， 具体 步骤如下： 1、 样品添加菌株的选择 按照目标菌： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)， 背景菌群： 大肠埃希氏菌 (E.coil)、 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillus。
17、 cereus)、 弗 氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)选择标准菌株， 所有标准菌株均购于政府指定的机 构， 并附有菌株证书， 保证了菌株的溯源性。 0021 2、 冻干保护剂的配制 样品以海藻糖、 脱脂奶粉和无菌水为基质(体积分数： 海藻糖12， 脱脂奶粉15)配制 冻干保护剂。 0022 3、 样品冻干 (1)菌株复苏传代 将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中， 在361下使其复苏和生长， 并对复苏的 菌株进行鉴定； (2)增菌 目标菌培养至对数生长期末， 背景菌群培养至稳定期， 从斜面上刮取菌落， 加入到10mL 冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液； (3)菌悬液配。
18、制 将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合， 按目标菌的目标浓度102103CFU/mL和背 景菌群的目标浓度103CFU/mL配制菌悬液。 为保证得到的最终样品中含有以上目标浓度的 菌株， 本实施例中按照目标菌103CFU/mL配制目标菌的菌悬液； 背景菌按103CFU/mL配制4个 背景菌的菌悬液， 按1:1的体积比例混合， 形成背景菌群悬液， 再将目标菌悬液和背景菌群 悬液按1： 1体积比混合， 得到混合菌悬液， 采用比浊法检查菌株含量； 置于磁力搅拌器上不 断搅拌下取1.0mL分装到样品瓶(西林瓶)中， 加上瓶塞， 但要留有空隙， 不要盖实； (4)冻干 说明书 3/8 页 5 CN 1。
19、07236784 A 5 和包装 将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中， 冷冻干燥机参数按如下设置： 冷冻速度(Cooling Rate)0.5/min 早期冷冻点(Incipient Freezing Point)-115min 冷冻温度(Cooling temperature)-40 共熔点(Melting Point Eutectic temperature)-29 加热温度(Heating temperature)20120min 启动冷冻干燥机， 机器直接进入程序化的冷冻干燥过程， 整个冻干过程55h。 0023 当样品冷冻干燥结束后， 直接进行箱内加塞； 关闭机器。 剔除塞子不。
20、紧的西林瓶， 西林瓶中样品为真空状态； (5)储存 将样品放置在-18条件下避光保存， 并对保存的样品进行适当管理和检测， 从全部样 品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。 0024 4、 样品的均匀性和稳定性试验 对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。 检查 样品均匀性和稳定性按照GB/T 15000.3-2008 标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般 原则和统计方法 进行。 所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下： 分别随机选取12个样品， 采用SN/T 1895-2007金黄色葡萄球菌测试方法， 在重复条件 测试212份样品的金黄色葡。
21、萄球菌。 结果数据用方差分析法进行统计处理， 统计步骤及结 果如下： 表1方差分析公式 上表中， 表2样品均匀性检测结果 说明书 4/8 页 6 CN 107236784 A 6 表3样品均匀性试验方差分析结果 结论： 在95置信概率下， 与其他因素对测试结果的影响相比， 样品的不均匀性是可接 受的。 0025 采用两种类型的稳定性试验： 一种是在贮存温度(4)下的稳定性试验， 另一种是 在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验， 选用三个温度点， 分别为20、 36和 42。 定期检测样品， 针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本， 将23份样品结果的 均值(对数转化后)用方差分析法。
22、进行统计处理， F值F临 界 值， 则说明标准样品的稳定性符合 要求， 同时确定在不同温度条件下符合标准样品要求的最长保存时间。 稳定性试验结果见 表4和表5。 0026 表4样品短期稳定性试验方差分析结果 说明书 5/8 页 7 CN 107236784 A 7 说明书 6/8 页 8 CN 107236784 A 8 表5样品短期稳定性试验方差分析结果 SS自由度MSF值F临界值置信概率Sbb 组间0.114502440.0026021.411.640.950.019 组内0.082971450.001844 实施例3 本实施例中所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法的各步骤均与实施例2 中相同， 不同的技术参数为： 菌悬液配制中， 目标菌悬液中目标菌的浓度按照2104CFU/mL 配制； 冻干过程50h。 0027 实施例4 说明书 7/8 页 9 CN 107236784 A 9 本实施例中所述的乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法的各步骤均与实施例3 中相同， 不同的技术参数为： 菌悬液配制中， 目标菌悬液中目标菌的浓度按照4103CFU/mL 配制； 冻干过程52h。 说明书 8/8 页 10 CN 107236784 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 107236784 A 11 。