本申请是2011年7月7日提交的申请号为201180038860.9(国际申请号PCT/US2011/043221)、发明名称为“使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递”的发明专利申请的分案申请。
优先权要求
本申请要求2010年7月7日提交的美国临时专利申请流水号61/362,224关于“LINEAR DNA MOLECULE DELIVERY USING PEGYLATED QUANTUM DOTS FOR STABLE TRANSFORMATION IN PLANTS”的提交日权益。
技术领域
本发明涉及使用纳米颗粒以将线性核酸分子非侵入投递入具有细胞壁的植物细胞中的方法。
发明背景
纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至特定动物细胞。已经发现了，在将某些经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的基因。也已经使用在大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如，量子点(“QD”))作为载体来将分子投递入细胞中。DNA和蛋白质可以与附着于QD表面的某些配体连接。见例如Patolsky,等(2003)J.Am.Chem.Soc.125:13918。可以通过使用标准的生物缀合方案将经羧酸或胺包被的QD与含有硫醇基团(见例如Dubertret等(2002)Science 298:1759；Akerman,等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12617；Mitchell,等(1999)J.Am.Chem.Soc.121:8122)，或N-羟基琥珀酰亚氨基(“NHS”)酯基的分子交联。见例如Pinaud等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Bruchez等(1998)Science 281:2013。一种将分子附着于QD表面的备选方式是经由将经链霉抗生物素蛋白包被的QD与生物素化的蛋白质、寡核苷酸、或抗体缀合进行。见例如Dahan,等(2003)Science 302:442；Pinaud,等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Wu,等(2003)Nature Biotechnol.21:41；Jaiswal,等(2003)Nature Biotechnol.21:47；及Mansson,等(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.314:529。
由于存在植物细胞壁，将外来核酸分子投递至植物是挑战性的。目前的方法依赖于侵入性投递以遗传转化植物。在植物细胞中，细胞壁是针对投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性细胞投递方法，例如生物射弹(基因枪)、微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来实现基因和小分子对有壁的植物细胞中的投递，但是蛋白质的投递仅已经通过微注射实现。在用纳米颗粒将核酸分子投递至植物细胞是期望的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前除去细胞壁。见例如Torney,等(2007)Nature Nanotechnol.2:295-300。
发明概述
本文中描述了使用纳米颗粒和线性化的核酸分子以将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法和组合物。可以使用公开内容的方法的一些实施方案来生成经稳定转化的经遗传修饰的能育植物。在一些实施方案中，线性核酸分子的独特特性容许投递没有外来核酸序列的感兴趣的特定基因序列，所述外来核酸序列对转基因靶生物体可以具有调节后果。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以用线性核酸分子进行PEG化。在具体的实施方案中，纳米颗粒可以是半导体纳米颗粒，诸如量子点(“QD”)。在一些实施方案中，线性核酸分子可以是线性化的质粒DNA。在其它实施方案中，线性核酸分子可以包含编码膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)和/或黄色荧光蛋白(YFP)的序列。
还公开了用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法可以包括提供具有细胞壁的植物细胞；用PEG包被纳米颗粒的表面以生成“PEG化的”纳米颗粒；用至少一种感兴趣的线性核酸分子包被PEG化的纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和用感兴趣的线性核酸分子包被的PEG化的纳米颗粒置于彼此接触中；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入包含细胞壁的细胞中。
进一步公开了用于将性状基因渗入(introgress)植物中的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括提供植物细胞；用PEG包被纳米颗粒的表面以生成PEG化的纳米颗粒；用供在所述植物中表达所述性状用的手段(means)包被PEG化的纳米颗粒；将植物细胞和用供在植物中表达性状用的手段包被的PEG化的纳米颗粒置于彼此接触中；容许所述纳米颗粒和供在植物中表达性状用的手段摄取入所述植物细胞中以生成经转化的植物细胞；自经转化的植物细胞再生全植物；并繁殖所述植物。在一些实施方案中，可以依照本发明的方法基因渗入的性状包括性状，其选自但不限于如下的：雄性不育；除草剂抗性；昆虫抗性；和对细菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。
还公开了本发明的方法，其可以用于在植物内(in planta)转化植物。在一些实施方案中，植物可以选自拟南芥属(Arabidopsis)的植物，例如拟南芥(A.thaliana)。在具体的实施方案中，通过植物内转化来转化的植物可以选自哥伦比亚(Columbia)生态型的拟南芥植物。
另外，公开了经遗传修饰的(GM)植物细胞及其生成方法，其中所述植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在一些实施方案中，可以经由依照本发明的纳米颗粒将质粒导入具有细胞壁的植物细胞中，所述质粒包含至少一种感兴趣的基因和选择标志。在其它实施方案中，可以选择稳定的转化体，其已经稳定整合至少一种感兴趣的基因和/或选择标志。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含至少一种感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。
进一步公开了创建在组织培养中使用的包含感兴趣的分子的可再生植物细胞的方法。组织培养物可以能够再生与可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以例如是胚；原生质体；分生细胞；愈伤组织；花粉；叶；花药；根；根尖；花；种子；荚果；或茎。更进一步，一些实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。
进一步公开了用于生成包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的稳定化植物系的方法，其中首先可以通过纳米颗粒摄取穿过植物细胞壁来导入所述期望的性状或感兴趣的核酸分子。生成稳定化的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下的技术，诸如但不限于自交；回交；杂种生成；与群体杂交；等等。如此，还公开了包含首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物和植物细胞。可以在与另一不同植物细胞的杂交中使用包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物细胞以生成具有期望特征的第一代(F1)杂种细胞；种子；和/或植物，所述期望的性状或感兴趣的核酸分子首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物或细胞(或其祖先)中。
具体地，本申请提供下述各项：
1.一种将感兴趣的线性核酸分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：
提供具有细胞壁的植物细胞；
用感兴趣的线性核酸分子包被纳米颗粒；
将所述具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触；并
容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入所述包含细胞壁的细胞中。
2.依照项1的方法，其中用聚乙二醇包被所述纳米颗粒。
3.依照项1的方法，进一步包括容许所述纳米颗粒摄取入所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。
4.依照项3的方法，进一步包括用亚细胞区室靶向蛋白包被所述纳米颗粒。
5.依照项4的方法，其中所述区室选自下组：胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。
6.依照项1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是来自商业作物物种的植物细胞。
7.依照项6的方法，其中所述植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryzasp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、蓖麻属物种(Ricinus sp.)、和甘蔗细胞。
8.依照项6的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
9.依照项1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是培养的细胞。
10.依照项1的方法，其中所述纳米颗粒是半导体纳米颗粒。
11.依照项10的方法，其中所述半导体纳米颗粒是量子点。
12.依照项1的方法，进一步包括衍生化所述纳米颗粒的表面。
13.依照项1的方法，其中所述感兴趣的线性核酸分子包含选自下组的核酸序列：DNA、RNA、RNAi分子、和基因。
14.依照项13的方法，其中所述感兴趣的线性核酸分子包含基因。
15.依照项14的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农艺学基因、或标志物基因。
16.依照项1的方法，其中所述感兴趣的线性核酸分子通过用核酸酶消化核酸分子获得。
17.依照项16的方法，其中用核酸酶消化的核酸分子选自下组：质粒、粘粒、人工染色体、酵母人工染色体、和细菌人工染色体。
18.依照项13的方法，进一步包括选择已经稳定整合所述感兴趣的线性核酸分子的细胞。
19.依照项18的方法，其中选定的细胞是可再生细胞。
20.依照项19的方法，进一步包括自所述可再生细胞再生植物。
21.一种将感兴趣的线性核酸分子导入植物材料中的方法，该方法包括：
提供植物材料，其中所述植物材料选自由植物细胞、植物组织、和植物组成的组；
用聚乙二醇包被纳米颗粒；
用感兴趣的线性核酸分子包被所述纳米颗粒；
将具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触；并
容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入所述植物材料中。
22.项21的方法，其中所述植物材料是选自下组的植物组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
23.一种用于将性状基因渗入植物中的方法，所述方法包括：
提供植物细胞；
用聚乙二醇包被纳米颗粒；
用供在所述植物中表达所述性状用的手段包被所述纳米颗粒；
将所述植物细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触中；
容许所述纳米颗粒和所述供在植物中表达性状用的手段摄取入所述植物细胞中；
自经转化的植物细胞再生全植物；并
繁殖所述植物。
24.项23的方法，其中所述性状选自下组：表达感兴趣的蛋白质、雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、对细菌性疾病的抗性、对真菌性疾病的抗性、和对病毒性疾病的抗性。
在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案考虑到以下描述会变得显而易见。
附图简述
图1包括未线性化的质粒pDAB3831的图。
图2包括用KpnI限制性酶线性化的质粒pDAB3831的图。
图3包括来自经具有线性DNA的纳米颗粒转化的拟南芥基因组的膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)DNA序列和来自NCBI数据库的PAT序列间的序列比对。
序列表
SEQ ID NO:1显示了用于扩增YFP基因的正向引物序列：TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG。
SEQ ID NO:2显示了用于扩增YFP基因的反向引物序列：TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA。
SEQ ID NO:3显示了用于扩增PAT基因的正向引物序列：GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG。
SEQ ID NO:4显示了用于扩增PAT基因的反向引物序列：AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG。
发明详述
I.几个实施方案的概述
容许非侵入性基因转移的本发明的方法对于生成具有期望性状的经遗传修饰的植物可以是非常有用的。非侵入性基因转移可以促进各区域的细胞内分子位点的特异性靶向和编辑，诸如在作物植物中掺入期望的输入、输出、和农艺学性状。描述的方法也可以作为非GMO选项用于瞬时转化植物，将用于性状基因渗入和疾病抗性的技术扩展至树或蔬菜作物，其中该技术目前是受限的。
目前的专利申请(U.S.S.N.60/978,059)证明了基于纳米颗粒的DNA投递的非侵入性手段，其使用多种纳米颗粒有效载荷投递环形质粒DNA来进行，等等，而且明确证明了拟南芥植物的T1种子中稳定整合转基因。含有其中生成的环形质粒DNA的转基因植物展现出期望的除草剂耐受性表型，而且在同时用至少4倍的田间草铵膦水平喷雾时显示高水平的耐受性。U.S.S.N.60/978,059证明了使用环形质粒DNA通过带正电荷的金纳米颗粒在拟南芥中的遗传转化，等等。本研究描述了使用线性核酸分子稳定遗传转化植物，等等。
U.S.S.N.60/978,059描述了带正电荷的纳米颗粒介导的质粒DNA投递，等等。然而。至今尚未报告证明使用基于线性质粒的投递实现的转基因的稳定基因组整合。此公开内容描述了使用带正电的纳米颗粒介导的线性核酸分子以在植物中进行稳定遗传转化。分子分析指示通过本发明的方法用pat基因和yfp基因转化的转基因T1拟南芥植物中的PAT以及YFP表达。T1转基因植物是能育的，并生成种子。可以将这些种子繁殖，并可以与分子和蛋白质分析一起实施分离分析。
线性核酸分子具有的独特特性使其区别于环形质粒DNA。例如，线性核酸分子可以具有不含载体主链和细胞抗生素选择标志的充分限定的基因盒。
可以以田间水平浓度喷雾除草剂草铵膦(GLA)以筛选转基因物。例如，使用本发明的方法生成的拟南芥T1幼苗已经对在萌发后7天开始隔日的田间水平剂量的草铵膦的五次应用显示了除草剂抗性。通过PCR对来自这些转基因植物的基因组DNA分析pat和yfp的存在，并且结果已经显示了pat和yfp靶DNA序列。PCR产物测序结果已经揭示了使用本发明的方法生成的T1拟南芥中pat和yfp转基因的正确序列。
II.术语
在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义：
回交：如本文中使用的，术语“回交”可以是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。
胚：如本文中使用的，术语“胚”可以指成熟种子内含有的小植物。
纳米颗粒：如本文中使用的，术语“纳米颗粒”可以指一种具有至少1纳米级尺寸，例如小于100nm的微观颗粒。适合于用于本发明的纳米微粒可以具有1nm-0.84um的大小。一类纳米颗粒是“量子点”(QD)。量子点可以具有1nm-10nm，例如2-4nm的中值直径。纳米颗粒的其它种类包括但不限于金纳米微粒；金包被的纳米微粒；多孔性纳米颗粒；中孔性纳米颗粒；硅土纳米颗粒；聚合物纳米颗粒，包括树枝状聚合物(dendrimer)；钨纳米颗粒；明胶纳米颗粒；纳米壳(nanoshell)；纳米核心(nanocore)；纳米球(nanosphere)；纳米棒(nanorod)；磁性纳米微粒；及其组合。
在可用的纳米颗粒中，发光半导体纳米晶体(QD)在生物学成像和感测中提供许多得到证明的应用。其效用源自与较大的蛋白质相当的独特光-物理特征和大小的组合。亲水性CdSe-ZnS QD的流体动力学半径从5nm(对于用分子配体交换的纳米晶体帽)变化至20nm(对于嵌段共聚物内包囊的纳米晶体)。可以将单一QD与几种生物分子(例如，抗体；肽；和核酸分子)缀合以提供具有增强的亲合力的多官能性QD生物缀合物。另外，其对化学和光降解的强抗性可以潜在地容许特定生物学过程的长期荧光监测。Nie和Emory(1997)Science 275:1102-6。可以在不需要进一步纯化的情况中，在同一复合物内同时应用基于金属亲和力自身装配和生物素-亲合素结合的多种非共价缀合方案，以生成即使在胞内环境中仍稳定的多官能性QD生物缀合物。Yezhelyev等(2008)J.Am.Chem.Soc.130(28):9006-12。通过对每个QD利用平均10个YFP及名义上50个细胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)，可以实现具有至少300kDa的分子量和150埃的空间延伸的蛋白质货物的胞内投递。同上文。QD-b-PE缀合物的投递货物具有范围大得多的大小和分子量；例如，在每个缀合物为平均2.5个链霉抗生物素蛋白-b-PE的情况中，投递的装配体具有潜在超过103kDa的分子量，和接近500埃的总体尺寸。若使用具有更高b-PE价的缀合物，则分子量和大小可以实质性增加。
核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、人工染色体(ACE)、和前述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。除非另有规定，核酸分子的长度通常是至少10个碱基。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。
可操作连接的：当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列可以是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。
PEG化的：如本文中所使用的，术语“PEG化的”可以指纳米颗粒(例如，量子点)，其中已经用聚乙二醇(PEG)修饰纳米颗粒的表面以得到改善的生物相容性。可以用各种靶向配体，例如肽和抗体进一步包被PEG化的纳米颗粒，以对特定的细胞和组织实现增强的投递效率。已经将PEG与具有各种药物的纳米颗粒；脂质体；和聚合胶束缀合，例如以延长经包被的纳米颗粒的血液循环时间，其通过经由空间稳定化效应降低蛋白质的非特异性吸附来实现。
量子点：如本文中所使用的，术语“量子点”(QD)(有时又称为纳米晶体)可以指限制导带电子、价带空穴、或激子(导带电子和价带空穴的束缚对(bound pair))在所有三个空间方向的运动的半导体纳米结构。例如，该限制可以由静电势(由外部电极、掺杂、应变、杂质等产生)；不同半导体材料间界面的存在(例如在核心-壳纳米晶体系统中)；半导体表面的存在(例如半导体纳米晶体)；或其组合所致。量子点可以具有离散的量子化能谱。相应的波函数可以在空间上位于量子点内，但是延续晶格的多个周期。量子点含有有限的少量(约1-100)的导带电子；价带空穴；或激子(即，有限数目的基元电荷)。
量子点是一类特殊的半导材料，其可以是由II-VI、III-V、或IV-VI周期类材料构成的晶体。例如，其大小范围可以为直径2-10纳米(10-50个原子)。在一些实施方案中，量子点可以由硒化镉硫化锌核心壳(CdSe/ZnS)构成，并且具有一批有用的电和光学特性，其与散装材料(bulk material)的电和光学特性在性质上趋异。量子点纳米颗粒由于其高的量子产率；高的摩尔消光系数；和对光漂白的高抗性而已经在体内和在体外作为成像剂进行调查。
对草甘膦的抗性：对一定剂量的草甘膦的抗性指植物幸免于(即植物可以不被杀死)所述剂量的草甘膦的能力。在一些情况中，耐受性植物可以暂时变黄或者在其它方面展现出一些草甘膦诱导的损伤(例如，过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。
稳定化的：如本文中所使用的，术语“稳定化的”可以指从同一品种的近交植物的一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物特征。
转基因：如本文中所使用的，术语“转基因”可以指外源核酸序列。在一个例子中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)；编码工业或药学有用的化合物的基因；或编码期望的农业性状的基因。在又一个例子中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子)。在一些实施方案中，要通过纳米颗粒介导的转化导入的感兴趣的核酸分子是转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的核酸分子是内源核酸序列，其中内源核酸序列的额外基因组拷贝是期望的；或相对于宿主生物体中的靶核酸分子在反义取向中的核酸分子。
摄取。如本文中所使用的，术语“摄取”可以指颗粒，诸如纳米颗粒(例如量子点)穿过细胞壁或细胞膜的移位，其中所述移位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的移位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。
III.使用纳米颗粒以稳定转化植物细胞的DNA分子投递
A.概述
例如，本发明描述了用于植物转化的新方法，其使用纳米颗粒介导的线性化质粒DNA投递以遗传转化并形成稳定的转基因植物进行。依照某些实施方案的方法不仅可以提供转基因生物体的快速生成，而且在与其它转化方法相比时为期望的基因组修饰提供几种可能性。本发明的实施方案已经导致经由纳米颗粒介导的线性化质粒DNA投递生成的第一次报告的稳定转化的植物。遗传修饰的公开方法偏离植物遗传转化的传统方法，并且对于生成转基因作物植物可以是非常有用的。
B.DNA分子
随着容许分离和表征编码特定蛋白质或RNA产物(例如干扰RNA(“RNAi”))的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造细胞的基因组以含有和表达外来基因，或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)，以便例如以特定的方式改变细胞的性状。此类外来的另外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。例如，转基因可以编码感兴趣的蛋白质，或者转录成RNAi。在过去15至20年里，已经开发了数种用于产生转基因细胞的方法，并且在具体的实施方案中，本发明涉及转化形式的细胞及其生成方法，其通过经由穿过细胞壁摄取纳米颗粒将一种或多种线性核酸分子导入具有细胞壁的植物细胞中来进行。在本发明的一些实施方案中，转基因可以包含在线性化表达载体中。
细胞转化可以牵涉构建会在特定细胞中发挥功能的表达载体。此类载体可以包含核酸序列，该核酸序列包含在调节元件(例如启动子、增强子、终止序列、或其组合)控制下的或者与调节元件(例如启动子、增强子、终止序列、或其组合)可操作连接的基因。如此，表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒形式，而且可以单独或者与其它质粒联合使用，以使用如本文中所描述的转化方法提供经转化的细胞，从而将转基因掺入包含细胞壁的植物细胞的遗传物质中。
在实施方案中，感兴趣的核酸分子可以是线性核酸分子。例如，可以通过用限制性内切核酸酶消化环形质粒来生成线性核酸分子。限制性内切核酸酶会在质粒核苷酸序列内的一个或多个识别位点处切割质粒。如此，质粒可以设计为容许通过用特定的限制性内切核酸酶消化生成一种或多种特定的线性核酸分子。或者，可以对给定的质粒核苷酸序列搜索一种或多种特定的限制性内切核酸酶的识别位点，所述限制性内切核酸酶容许生成一种或多种特定的线性核酸分子。通过选择在环形质粒或线性核酸分子内的特定位置处切割的限制性位点，可以生成所得的线性核酸分子，其缺乏来自前体核酸分子的一种或多种序列。例如，可以生成如下的线性核酸分子，其缺乏外来核酸序列(例如，载体主链；选择标志，诸如细菌选择标志；和与靶细胞的基因组DNA同源的不必要的核酸序列)。或者，可以合成缺乏外来核酸序列的线性核酸分子。
在感兴趣的分子包含一种或多种基因的实施方案中，基因可以是显性或隐性等位基因。举例而言，所述基因可以赋予的性状诸如除草剂抗性、抗虫性、细菌抗性、真菌抗性、病毒性疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的营养质量、和工业用途。赋予这些性状和其它性状的基因是本领域中已知的，并且可以依照本发明的方法将任何基因导入包含细胞壁的细胞中。
用于线性化和经由纳米颗粒摄取的表达载体：标志物基因
任选地，表达载体可以包含至少一种例如与调节元件可操作连接的遗传标志，其容许通过负选择(即抑制不含该选择标志基因的细胞生长)或者通过正选择(即筛选由该遗传标志编码的产物)回收含有标志物的经转化细胞。许多用于转化的选择标志基因是本领域中公知的，包括例如但不限于：编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性化学剂解毒的酶的基因，或者编码可对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。特定正选择方法也是本领域中已知的。
一种可以适合于用某些核酸分子的植物转化的选择标志基因是任选地在植物调节信号控制下的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4803。可以使用的另一种选择标志基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如Vanden Elzen等(1985)Plant Mol.Biol.5:299。
可以在本发明的方法中使用的其它选择标志基因包括细菌起源的选择标志基因，例如对抗生素赋予抗性的(诸如庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶(adenyl transferase))、和对博来霉素赋予抗性的选择标志基因。参见Hayford等(1988)Plant Physiol.86:1216；Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.210:86；Svab等(1990)Plant Mol.Biol.14:197；及Hille等(1986)Plant Mol.Biol.7:171。其它选择标志基因可以赋予对除草剂诸如草甘膦；草铵膦(glufosinate)；或溴苯腈(bromoxynil)的抗性。参见Comai等(1985)Nature 317:741-744；Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell 2:603-618；及Stalker等(1988)Science 242:419-423。
可以在本发明的方法中使用的其它选择标志基因包括那些不是细菌起源的。这些基因包括例如但不限于小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶；和植物乙酰乳酸合酶。参见Eichholtz等(1987)Somatic Cell Mol.Genet.13:67；Shah等(1986)Science 233:478；及Charest等(1990)Plant Cell Rep.8:643。
另一类适合于植物转化的标志物基因可以需要筛选据推测经转化的植物细胞，而不对经转化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。这些基因特别可用于量化或显现基因在特定组织中表达的空间样式，并且通常称为“报告基因”，因为它们可以与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选经转化的细胞的基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)；β-半乳糖苷酶；萤光素酶；和氯霉素乙酰转移酶。参见Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387；Teeri等(1989)EMBO J.8:343；Koncz等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84:131；及DeBlock等(1984)EMBO J.3:1681。最近，已经可获得用于显现GUS活性的体内方法，其不需要破坏植物组织。Molecular Probes publication 2908(1993)Imagene GreenTM,第1页-第4页；及Naleway等(1991)J.Cell Biol.115:151a。
新近，已经利用编码荧光蛋白(例如，GFP,EGFP,EBFP,ECFP和YFP)的基因作为原核和真核细胞中基因表达的标志物。参见Chalfie等(1994)Science 263:802。如此，荧光蛋白和荧光蛋白的突变在一些实施方案中可以作为可筛选标志物使用。
用于经由纳米颗粒摄取的表达载体：启动子
表达载体中包含的基因可以由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或者与启动子联合使用的其它调节元件也是如此。
启动子是可以在转录起始的上游的DNA区域，而且可以牵涉识别和结合RNA聚合酶和/或其它蛋白质以启动转录。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶；根；种子；纤维；木质部导管；管胞；或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选性的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中驱动表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括但不限于缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选性的、细胞类型特异性的、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子类。“组成性”启动子是可在大多数环境条件下有活性的启动子。
1.诱导型启动子
可以将诱导型启动子与细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。通过诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而升高。
可以在本发明的实施方案中使用任何诱导型启动子。参见Ward等(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。例示性诱导型启动子包括但不限于：那些响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4567-71)；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等(1991)Mol.Gen Genetics 227:229-237；及Gatz等(1994)Mol.Gen.Genetics 243:32-38)；和来自Tn10的Tet阻抑物(Gatz等(1991)Mol.Gen.Genetics 227:229-237)。特别有用的诱导型启动子可以是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。此类例示性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以受糖皮质激素诱导。Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421。
2.组成性启动子
可以将组成性启动子与细胞中表达的基因可操作连接，或者可以将组成性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。
可以在本发明的实施方案中利用不同的组成性启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；来自泛素的启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632及Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；来自pEMU的启动子(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；来自MAS的启动子(Velten等(1984)EMBO J.3:2723-2730)；和来自玉米H3组蛋白的启动子(Lepetit等(1992)Mol.Gen.Genetics 231:276-285及Atanassova等(1992)Plant Journal 2(3):291-300)；和ALS启动子，即欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段的核苷酸序列相似性)。参见国际PCT公开文本WO 96/30530。
3.组织特异性或组织优选性启动子
可以将组织特异性启动子与用于在细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。
可以在本发明的实施方案中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于：根优选性启动子，例如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等(1983)Science 23:476-82及Sengupta-Gopalan等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-4)；叶特异性和光诱导型启动子，例如来自cab或1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的启动子(Simpson等(1985)EMBO J.4(11):2723-2729及Timko等(1985)Nature 318:579-82)；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子(Twell等(1989)Mol.Gen.Genetics 217:240-5)；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子(Guerrero等(1993)Mol.Gen.Genetics 244:161-8)；和小孢子优选性启动子，例如来自apg的启动子(Twell等(1993)Sex.Plant Reprod.6:217-24)。
可以依靠将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区域来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体；液泡；过氧化物酶体；乙醛酸循环体；细胞壁；或线粒体的转运或者分泌入质外体中。在基因的5’和/或3’端的靶向序列可以例如在蛋白质合成和加工过程中决定编码的蛋白质最后可以在何处区室化(compartmentalized)。或者，可以将此类亚细胞区室靶向性蛋白质与纳米颗粒直接连接以将用感兴趣的分子包被的纳米颗粒引导至期望的亚细胞区室。
信号序列的存在可以将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室，或者分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等(1992)Plant Mol.Biol.20:49；Close,P.S.,Master’s Thesis,Iowa State University(1993),Knox等(1987)Plant Mol.Biol.9:3-17；Lerner等(1989)Plant Physiol.91:124-9；Fontes等(1991)Plant Cell 3:483-96；Matsuoka等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:834；Gould等(1989)J.Cell.Biol.108:1657；Creissen等(1991)Plant J.2:129；Kalderon等(1984)Cell 39:499-509；Steifel等(1990)Plant Cell 2:785-93。
外来蛋白质基因和农艺学基因
依照本发明的实施方案的转基因植物可以以商业量生产外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术产生多种转基因植物，它们以常规方式收获。然后可以从感兴趣的组织或总生物质提取外来蛋白质。可以通过由例如Heney和Orr(1981)Anal.Biochem.114:92-6所讨论的已知方法来实现从植物生物质的蛋白质提取。
在本发明的一些方面，为商业生产外来蛋白质提供的植物材料可以是植物、植物组织、或组织细胞。在一些方面，感兴趣的生物质可以是植物种子。对于显示较高表达水平的转基因植物，可以例如经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法，参见Glick和Thompson,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press,Boca Raton 269:284(1993)。例如，关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护或者对于安全性评估可以是有用的。如果可以进行未经授权的繁殖和与其它种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同亲本(parentage)。图谱比较可以牵涉杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。
同样地，可以在经转化的细胞或其后代中表达农艺学基因。更具体地，可以经由本发明的方法对植物进行遗传工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。可以在这方面使用的例示性基因包括但不限于下文进行归类的基因。
1.赋予对害虫或疾病的抗性的基因：
A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中相应无毒力(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等(1994)Science 266:789(克隆对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等(1993)Science 262:1432(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)有抗性的番茄Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等(1994)Cell 78:1089(对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的RSP2基因)。
B)对害虫诸如大豆胞囊线虫赋予抗性的基因。参见例如国际PCT公开文本WO 96/30517；及国际PCT公开文本WO 93/19181。
C)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其为模型的合成多肽。参见例如Geiser等(1986)Gene 48:109(Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA)，例如以ATCC保藏号40098；67136；31995；和31998购得。
D)凝集素。参见例如Van Damme等(1994)Plant Molec.Biol.24:25(数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列)。
E)维生素结合蛋白，例如抗生物素蛋白。参见国际PCT公开文本US93/06487(抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途)。
F)酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等(1987)J.Biol.Chem.262:16793(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub等(1993)Plant Molec.Biol.21:985(编码烟草蛋白水解酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等(1993)Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)alpha-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利No.5,494,813。
G)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮类固醇或保幼激素，其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等(1990)Nature 344:458(克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达)。
H)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参见Regan(1994)J.Biol.Chem.269:9(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；和Pratt等(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(可以在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))。还可参见美国专利No.5,266,317(编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因)。
I)在自然界由蛇、黄蜂(wasp)或任何其它生物体生成的昆虫特异性毒液。例如参见Pang等(1992)Gene 116:165(编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达)。
J)酶，其负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物或另一具有杀昆虫活性的非蛋白质分子。
K)牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶，例如，糖酵解酶；蛋白水解酶；脂肪分解酶；核酸酶；环化酶；转氨酶；酯酶；水解酶；磷酸酶；激酶；磷酸化酶；聚合酶；弹性蛋白酶；壳多糖酶(chitinase)；或葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见国际PCT公开文本WO 93/02197(callase基因的核苷酸序列)。含有壳多糖酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC以保藏号39637和67152获得。还可参见Kramer等(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23:691(编码烟草天蛾壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列)；和Kawalleck等(1993)Plant Molec.Biol.21:673(欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。
L)刺激信号转导的分子。例如参见Botella等(1994)Plant Molec.Biol.24:757(关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)；和Griess等(1994)Plant Physiol.104:1467(玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)。
M)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见国际PCT公开文本WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)；和国际PCT公开文本WO 95/18855(赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。
N)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等(1993)Plant Sci 89:43(杀菌肽-β溶胞肽类似物(cecropin-βlytic peptide analog)的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。
O)病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由可衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等(1990)Ann.rev.Phytopathol.28:451。已经对经转化的植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。
P)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，这杀死昆虫。参见Taylor等,摘要#497,Seventh Int’l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh,Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。
Q)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等(1993)Nature 366:469(表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击)。
R)在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestive protein)。例如，真菌内α-l,4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等(1992)Bio/Technology 10:1436。还可见Toubart等(1992)Plant J.2:367(编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征)。
S)在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等(1992)Bio/Technology 10:305(表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性)。
2.赋予对除草剂的抗性的基因：
A)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性基因编码突变体ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等(1988)EMBO J.7:1241，及Miki等(1990)Theor.Appl.Genet.80:449所描述的。
B)草甘膦抗性(分别由例如突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(经由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的体内诱变的各种形式)；aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予)；其它膦酰基化合物诸如草铵膦(glufosinate)(来自链霉菌属物种(Streptomyces species)，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)基因)；和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。见例如美国专利No.4,940,835；和美国专利6,248,876(可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列)。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，还可见美国专利No.4,769,061(突变体aroA基因的核苷酸序列)。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利No.4,975,374披露了对除草剂诸如L-膦丝菌素赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。例示性PAT基因的核苷酸序列可以在欧洲申请No.0 242 246,及DeGreef等(1989)Bio/Technology 7:61(生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物)中提供。赋予对苯氧基丙酸和环己酮，诸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall等(1992)Theor.Appl.Genet.83:435描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于例如WO 2005012515。赋予对2,4-D、fop和吡啶基氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于例如WO 2005107437。
C)抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。见例如Przibila等(1991)Plant Cell 3:169(用编码突变体的psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas))。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于美国专利No.4,810,648，并且含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435；67441；和67442获得。还可见Hayes等(1992)Biochem.J.285:173(编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达)。
3.赋予或促成增值(value-added)性状的基因，诸如：
A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624。
B)降低的肌醇六磷酸盐含量。肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸盐的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等(1993)Gene 127:87(黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列)。可以导入基因以降低肌醇六磷酸盐含量。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因可以负责特征为低水平肌醇六磷酸的玉米突变体。参见Raboy等(1990)Maydica 35:383。
C)例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳水化合物组成。参见例如Shiroza等(1988)J.Bacteol.170:810(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等(1985)Mol.Gen.Genet.20:220(果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因)；Pen等(1992)Bio/Technology 10:292(α-淀粉酶)；Elliot等(1993)Plant Molec.Biol.21:515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等(1993)J.Biol.Chem.268:22480(大麦α-淀粉酶基因)；及Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)。
C.纳米颗粒
依照本发明的一些实施方案，提供了将感兴趣的线性核酸分子导入包含细胞壁的细胞(例如植物细胞)中的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括将用感兴趣的线性核酸分子包被的纳米颗粒与细胞置于接触中，并且容许纳米颗粒穿过细胞壁的摄取。在具体的实施方案中，纳米颗粒可以可逆地或不可逆地含有、包被有、或以其它方式结合和/或携带感兴趣的线性核酸分子。在某些实施方案中，可以将感兴趣的线性核酸分子在与具有细胞壁的植物细胞接触前或与将纳米颗粒导入具有细胞壁的植物细胞同时引入纳米颗粒。可以在本发明的实施方案中使用的纳米颗粒的例子包括但不限于单独的或与半导体纳米颗粒、带正电荷的纳米颗粒；金纳米颗粒；金包被的纳米颗粒；多孔性纳米颗粒；中孔性纳米颗粒；硅土纳米颗粒；聚合物纳米颗粒，包括树枝状聚合物；钨纳米颗粒；明胶纳米颗粒；纳米壳；纳米核心；纳米球；纳米棒；和磁性纳米微粒组合的量子点。
依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整且整个细胞壁的任何植物细胞。具有细胞壁的植物细胞的例子包括但不限于：藻；烟草；胡萝卜；玉蜀黍；芸苔；油菜籽；棉；棕榈；花生；大豆；甘蔗；稻属物种(Oryza sp.)；拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)；和蓖麻属物种(Ricinus sp.)。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或发现其的任何地方，包括但不限于：在胚；分生细胞；愈伤组织；花粉，包括单倍体和双单倍体小孢子；叶；花药；根；根尖；花；种子；荚果；茎；和组织培养物中的包含细胞壁的细胞。
在本发明的实施方案中，感兴趣的线性核酸分子可以是任何核酸分子，其可以投递至依照本发明的具有细胞壁的植物细胞。感兴趣的核酸分子可以包含但不限于：DNA；RNA；RNAi分子；基因；质粒；粘粒；YAC；和BAC。可以将感兴趣的核酸分子与例如但不限于：多肽；酶；激素；糖肽；糖；脂肪；信号传导肽；抗体；维生素；信使；第二信使；氨基酸；cAMP；药物；除草剂；杀真菌剂；抗生素；和/或其组合同时导入具有细胞壁的植物细胞。
在本发明的具体的实施方案中，可以将纳米颗粒的表面官能化(functionalized)，这可以例如容许靶向性摄取或者容许将其它物质可逆或不可逆地结合至纳米颗粒的表面。作为非限制性例子，可以用例如烷烃硫醇盐(alkanethiolate)的自身装配单层官能化纳米颗粒(例如，量子点)的表面，所述烷烃硫醇盐可以进一步官能化或衍生化。在又一个非限制性例子中，可以用接头衍生化纳米颗粒的表面，所述接头自身可以进一步官能化或衍生物。在一个实施方案中，可以将纳米颗粒进行PEG化。在其它实施方案中，纳米颗粒可以包含下列一种或多种，或者可以用下列一种或多种多官能化：核心(活性或无活性)、空间外层(steric coat)(活性或惰性)、可切割连接；和/或靶向分子或配体。
可以使用Dubertret等(2002)Science 298:1759的方案；或者通过依照熟练技术人员的判断自其修改的方案用PEG官能化纳米颗粒，诸如量子点。例如，可以将经TOPO(三辛基氧膦(tri-octyl phosphine oxide))包被的CdSe/ZnS量子点用氯仿中的PEG-PE悬浮，接着蒸发溶剂，并用水溶解所得的PEG化的量子点。
在本发明的各方面中，可以将纳米颗粒吸收入细胞的各部分中。可以吸收的纳米颗粒的位置的例子包括但不限于：胞质溶胶；细胞核；液泡形成体；质体；黄化质体；色质体；白色体；油质体；蛋白质体；造粉体；叶绿体；和双层膜的腔。在其它实施方案中，可以经由共质体或质外体途径发生纳米颗粒摄取入包含细胞壁的细胞中。
D.稳定转化的植物细胞
依照本发明的稳定转化的植物细胞可以是能够通过纳米颗粒介导的转化用感兴趣的线性核酸分子转化的任何植物细胞。因而，可以自双子叶植物或单子叶植物分离或培养植物细胞。植物细胞也可以存在于植物组织或全植物中。依照本发明的来自双子叶植物的稳定转化的植物细胞的非限制性例子包括：苜蓿；菜豆(bean)；花茎甘蓝(broccoli)；甘蓝(cabbage)；胡萝卜；花椰菜(cauliflower)；芹菜；白菜(Chinese cabbage)；棉；黄瓜；茄子；莴苣；甜瓜(melon)；豌豆(pea)；胡椒(pepper)；花生；马铃薯；南瓜(pumpkin)；萝卜；油菜籽；菠菜；大豆；南瓜(squash)；甜菜；向日葵；烟草；番茄；和西瓜，依照本发明的来自单子叶植物的稳定转化的植物细胞的非限制性例子包括：玉米；洋葱；稻；高粱；小麦；黑麦；黍(millet)；甘蔗；燕麦；小黑麦(triticale)；柳枝稷；和草地草(turfgrass)。
可以自通过本发明的方法生成的稳定转化的植物细胞再生依照本发明的转基因植物。可以以任何方式使用或栽培此类植物，其中感兴趣的核酸分子的存在是期望的。因而，可以通过经由纳米颗粒介导的转化用线性核酸分子转化将转基因植物工程化改造为具有一种或多种期望的性状，等等，并通过本领域技术人员已知的任何方法种植并栽培。
提供以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。实施例不应解释为将本发明限于例示的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：制备纳米颗粒以转化植物细胞
质粒DNA的制备
将pDAB3831质粒DNA(图1)分离并制备以进行线性DNA/PEG化的量子点(PQD)介导的植物转化。此质粒含有由拟南芥泛素10启动子(AtUbi10)驱动的PAT选择标志基因和由木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动的杯水母(Philadium)黄色荧光蛋白基因(PhiYFP)。将含有所述质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接种，并在含有氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基中于37℃培养至混浊。使用Qiagen质粒Midi-Prep试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离DNA。经由限制性酶消化线性化分离的DNA。使用限制酶KpnI消化DNA，由此生成线性化的质粒DNA。
线性DNA-PQD复合物的形成
量子点获自Ocean Nanotechnology(Springdale,AZ)。将2mg经TOPO(三辛基氧膦)包被的CdSe/ZnS量子点用氯仿中的0.15gm(5.5uMol)PEG-PE(1.2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-聚(乙二醇)])(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)悬浮，接着蒸发溶剂，并用水溶解。完成PEG缀合以针对细胞毒性提供保护。
将PQD与线性质粒DNA缀合。将2mg PQD于约60-70℃用4mg HS-PEG-OCH3(Prochimia,Zacisze,Poland)悬浮过夜。将溶剂在真空烘箱中除去。然后，将残余在1mL水(18M)中悬浮。最后一步伴随着红色残余至橙色、光学澄清、透明溶液的变化。为了将线性化质粒DNA包被至H3CO-PET-SH-QD上以进行转化实验，将0.02mg纯化的线性化质粒DNA(pDAB3831)于23℃在黑暗中与2mL水中的所得PQD缀合物一起温育2小时。Torney等(2007)Nature Nanotechnol.2:295-300。
实施例2：转化拟南芥芽
对于植物内遗传转化，用KpnI限制酶消化pDAB3831质粒以线性化DNA。在限制酶消化后，在特定比率的PEG、QD、和线性DNA中使用线性化DNA。
将线性化DNA与量子点、PEG混合，并温育30分钟。然后，将由纳米颗粒和线性化质粒DNA溶液组成的纳米复合物与在含0.02-0.04％Silwet-L77的水中具有5％蔗糖溶液的工作溶液混合。
供植物内转化的植物材料
种子的同步萌发对于确保T0植物中花形成的一致性是重要的。将拟南芥哥伦比亚栽培种种子在0.1％(w/v)琼脂溶液中悬浮，并于4℃温育48小时以完成分层。称重60mg种子，并将其转移至15mL管。添加13mL 0.1％(w/v)琼脂溶液，并旋涡振荡，直至将种子均匀分散。这生成4.6mg种子/1mL 0.1％(w/v)琼脂溶液(或约230个种子/mL)的种子溶液浓度。制备6管(72mL溶液)以播种4个浅苗床，其在每个盘中含有18个(31/2英寸)盆。将种子溶液于4℃温育48小时以完成分层。以每盆1.0mL分层种子溶液单独播种每个盆。在播种完所有盆时，将增殖罩(propagation dome)在盘上放置以保持土壤湿润。在播种日后5天除去该罩。将种子萌发，并将植物在(CMP4030和CMP3244型,Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m2/sec的光强度在恒定的温度(22℃)和湿度(40-50％)下培养。在播种植物后10至14天用霍格兰(Hoagland)氏溶液，随后用DI水给植物浇水，以保持土壤润而不湿。在播种日后4周后，将花切下以产生次生花(secondary flower)的更均匀生长。在播种后第5周中，将植物准备好进行转化过程。
植物内转化
使用来自Clough和Bent的修改方案来完成线性DNA/PQD介导的拟南芥哥伦比亚栽培种转化。Clough和Bent(1998)Plant J.16:735-43。以0.5mg线性DNA和4nM PQD的浓度用线性DNA/PQD复合物溶液生成20mL悬浮液，并用于处理拟南芥植物(主要为未成熟的花簇及一些已受精的长角果)。在浸渍植物前，将浓度0.05％(w/v)(250μL/500mL)-0.005％的Silwet L-77添加至线性DNA/PQD溶液，并充分混合。将植物的地上部分在线性DNA/PQD溶液中浸渍30秒，期间温和搅动。将经处理的植物在合规则的位置于22-24℃在阴影中放置30分钟。将植物在如上文所描述的条件下转移至Convirons，并允许其生长至成熟，并收集种子。
使用选择盘(10.5”x 21”x 1”盘)来筛选来自T0植物的大量收获种子，每个盆上约10,000粒种子。使用两个对照来确保正确地完成选择喷雾；Col-0阴性转化体对照和掺入有在PAT(膦丝菌素乙酰基转移酶)选择标志方面纯合的种子的哥伦比亚Col-0野生型作为阳性转化体对照。为了实现同步，将种子在播种前在0.1％(w/v)琼脂溶液中分层48小时。为了提供每个选择盘10,000粒种子，将200mg种子添加至0.1％(w/v)琼脂溶液，并涡旋振荡，直至将种子均匀地悬浮。然后，将分层的种子在用Sunshine混合物LP5填充并用霍格兰氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的选择盘上播种。为了使选择喷雾有效，重要的是，将40ml悬浮种子均匀地播种至选择盘上。播种后，将增殖罩在每个选择盘上放置，并种植植物以进行选择，在播种后约5天除去增殖罩。
实施例3：对经转化的拟南芥的分析
选择经转化的植物
容许新鲜收获的T1种子于室温干燥7天。将T1种子在26.5x 51cm萌发盘中播种，每个萌发盘接受200mg等分试样的分层T1种子(约10,000粒种子)，其先前已经在40ml 0.1％(w/v)琼脂糖溶液中悬浮，并于4℃贮存2天以完成休眠需要并确保同步种子萌发。
将Sunshine混合物LP5用细蛭石覆盖，并用霍格兰氏溶液在下灌溉，直至潮湿，然后允许重力排水。用移液管将每个40ml等分试样的分层种子均匀地播种至蛭石上，并用湿度罩覆盖4-5天。除去罩，之后一天使用出现后草铵膦喷雾进行初始转化体选择。
种植后7天(DAP)，使用每次应用投递有效率280g ae/ha草铵膦的DeVilbiss压缩空气喷雾尖端用Liberty除草剂(200g ae/L草铵膦,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)的0.2％(w/v)溶液以喷雾体积10ml/盘(703L/ha)在5天内将T1植物(分别为子叶和2-4-lf阶段)喷雾5次。在最终的喷雾后4-7天鉴定存活者(活跃生长的植物)，并个别地移植入用盆栽培养基(Metro Mix 360)制备的3英寸盆中。将移植的植物用湿度罩覆盖3-4天，并如先前那样在22℃生长室中放置或直接移到温室。随后，将罩除去，并将植物在温室(22±5℃,50±30％RH,14小时光照:10小时黑暗，最小值500μE/m2s1自然光+补充光)中培养。
分子和生物化学分析
对PAT和YFP向植物基因组中的整合实施分子分析。将PCR扩增产物进行测序，并与转基因序列比较。
在拟南芥(哥伦比亚栽培种)的T1后代中转基因的基因组整合的分子分析和证据
使用植物DNAZOLTM(Invitrogen)依照制造商的用法说明书自六周龄植物的叶材料提取来自拟南芥转基因植物的基因组DNA。设计PCR引物以检测YFP和PAT转基因。YFP引物以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2呈现。PAT引物以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4呈现。
转基因的gDNA PCR扩增
使用TaKaRa ExTaqTM试剂盒(Takara,Otsu,Shiga,Japan)来完成PAT和YFP的PCR扩增反应。将基因产物在50μl的总反应体积中扩增。PCR反应含有100ng基因组DNA模板、1X ExTaq反应缓冲液、0.2mM dNTP、10pMol每种引物、和0.025个单位/μL ExTaq。使用以下PCR条件：于96℃持续5分钟的1个循环和下列条件的31个循环：94℃达15秒，65℃达30秒，72℃达1分钟，及72℃达7分钟的最终延伸。将PCR扩增产物通过0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙啶染色显现。使用QIAEXTMII凝胶纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)自琼脂糖凝胶纯化DNA片段。
使用先进的Sanger测序技术(MWG Biotech,Huntsville,AL)使用PAT正向引物(SEQ ID NO:3)和YFP反向引物(SEQ ID NO:1)来对PCR片段测序。使用Sequencher软件来分析序列数据。
PAT和YFP PCR扩增子的测序结果与这些基因预期的核苷酸序列匹配。这些结果清楚指示使用PEG化的量子点和线性DNA转化方案将来自pDAB3831的PAT和YFP序列稳定整合入拟南芥的gDNA中。
将PAT和YFP(黄色荧光标签,Evrogen)基因产物的PCR在50μL总反应体积的混合物中扩增，所述混合物含有100ng基因组模板DNA、1x ExTaq反应缓冲液(TaKaRa Bio)、0.2mM dNTP、10pmol引物、和0.025个单位/μL ExTaq。使用如下的PCR条件：于96C持续5分钟的1个循环和以下PCR程序的31个循环：94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分钟。于72℃实施最终的延伸达7分钟以完成PCR产物合成。使用BioRad Gel成像系统获得凝胶图像。图1和2。使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen Inc.)依照制造商的用法说明书将扩增片段进行凝胶纯化。
使用先进的Sanger测序技术(MWG Biotechnologies,Inc.)使用PAT正向引物和YFP正向引物来对PCR片段测序，并使用Sequencher软件(公司)来分析序列。
本结果清楚地指示经由实施例1中带正电荷的纳米颗粒介导的线性化DNA投递来投递的PAT和YFP序列，并且如此提供转基因在拟南芥T1植物的基因组DNA中的稳定基因组整合的证据。
实施例4：纳米颗粒介导的将线性核酸分子投递至培养的植物细胞
制备单细胞植物材料。
例如，使用BY2细胞和NT1细胞两者。BY2细胞是一种非绿色、快速生长的烟草细胞系。NT1细胞是自烟草分离的光合自养细胞。转化前3至4天，通过将2ml NT1或BY2培养物转移至250mL烧瓶中含有50nM DAS-PMTI-1(微管抑制剂)和0.5-0.1％(v/v)DMSO的40ml NT1B或LSBY2培养基中来将1周龄悬浮培养物传代培养至新鲜的培养基。在微管抑制剂处理后4天或7天时收集单细胞。将使用的BY2单细胞经由Beckman流式细胞仪加工以对活细胞计数。使用与共聚焦成像系统附接的微分干涉相差(DIC)显微镜检查细胞以测定单细胞包含遍及细胞胞质分布的大量质体(造粉体)。通过转移3.0OD600的1mL悬浮液来将细胞以每14天传代培养一次。使用培养的细胞作为靶细胞进行转化。
纳米颗粒制备和细胞处理
将质粒DNA分离，并制备以进行线性DNA/PEG化的量子点(PQD)介导的植物转化。质粒含有由拟南芥泛素10启动子(AtUbi10)驱动的PAT选择标志基因和由木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动的杯水母黄色荧光蛋白基因(PhiYFP)。将含有所述质粒的大肠杆菌菌株接种，并在含有氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基中于37℃培养至混浊。使用Qiagen质粒Midi-Prep试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离DNA。经由限制性酶消化线性化分离的DNA。使用限制酶KpnI消化DNA，由此生成线性化的质粒DNA
量子点获自Ocean Nanotechnology(Springdale,AZ)。将2mg经TOPO(三辛基氧膦)包被的CdSe/ZnS量子点用氯仿中的0.15gm(5.5uMol)PEG-PE(1.2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-聚(乙二醇)])(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)悬浮，接着蒸发溶剂，并用水溶解。完成PEG缀合以针对细胞毒性提供保护。
将PQD与线性质粒DNA缀合。将2mg PQD于约60-70℃用4mg HS-PEG-OCH3(Prochimia,Zacisze,Poland)悬浮过夜。将溶剂在真空烘箱中除去。然后，将残余在1mL水(18M)中悬浮。最后一步伴随着红色残余至橙色、光学澄清、透明溶液的变化。为了将线性化质粒DNA包被至H3CO-PET-SH-QD上以进行转化实验，将0.02mg纯化的线性化质粒DNA(pDAB3831)于23℃在黑暗中与2mL水中的所得PQD缀合物一起温育2小时。Torney等(2007)Nature Nanotechnol.2:295-300。
将1-3μL/mL浓度PQD添加至24孔微量滴定板中的500μL细胞，并在黑暗中在摇动器上温和旋转20分钟。将纳米颗粒转运穿过细胞壁。
实施例5：多官能化纳米颗粒介导的拟南芥植物内转化
可以使用自Clough和Bent,1998修改的方案实施拟南芥的植物内转化。优化与归巢蛋白质转导域(PTD)和NLS单元的分子一起的多官能化纳米颗粒上的DNA的浓度以实现增加的转化效率。
植物材料：将健康的拟南芥植物在长日照下在盆中在土壤中培养，直至开花。将第一次抽苔物(First bolt)剪下以促进许多次生抽苔物(secondary bolt)增殖。剪下后大约4-6天准备好植物。选择拟南芥哥伦比亚(Col-0)生态型作为花植物内转化的背景(T0植物)。种子的同步萌发对于确保T0植物中花形成的一致性是重要的。将野生型种子在0.1％琼脂溶液中悬浮，并于4℃温育48小时以完成分层。在称重纸上称重60mg种子，并将其转移至15mL管。添加13mL0.1％琼脂溶液，并旋涡振荡，直至将种子均匀分散。这生成4.6mg种子/1mL溶液(或约230个种子/mL)的浓度。制备6管(72mL溶液)以播种在每个盘中含有18个(31/2英寸)盆的4个浅苗床，并播种总共2个盆。将溶液于4℃温育48小时以完成分层。以每盆1.0mL分层种子溶液单独播种每个盆。在播种完所有盆时，将增殖罩在盘上放置以保持土壤湿润。在播种日后5天除去该罩。将种子萌发，并将植物在(CMP4030和CMP3244型,ControlledEnvironments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m2/sec的光强度在恒定的温度(22℃)和湿度(40-50％)下培养。在播种植物后10至14天用霍格兰(Hoagland)氏溶液，随后用DI水给植物浇水，以保持土壤润而不湿。在播种日后4周后，将花切下以产生次生花(secondary flower)的更均匀生长。在播种后第5周中，将植物准备好进行转化过程。
纳米缀合物制备以进行花处理：选择2-120nm大小范围的纳米颗粒/量子点进行处理，并将其用片段纯化的pDAB3138和归巢肽单元依照Derufus等(2007)多官能化。具有655或705nm的发射最大值并用PEG和氨基修饰的量子点获自Quantum Dot Corporation(ITK氨基)。使用由供应商提供的消光系数通过595nm的光学吸光度测量QD浓度。使用的交联剂是sulfo-LC-SPDP(磺基琥珀酸亚氨基6-(3’-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸盐)(Pierce)和sulfo-SMCC(磺基琥珀酸亚氨基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸盐)(Sigma)。使用sulfo-LC-SPDP和sulfo-SMCC交联剂将经氨基修饰的QD与含有硫醇的质粒DNA和归巢肽缀合。使用Amicon Ultra-4(100kDa截留)滤器，将QD在50mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH 7.2中重悬。将交联剂(1000倍过量)添加至QD，并容许起反应达1小时。将样品在NAP-5重力柱(以除去过量的交联剂)上过滤，进入补充有10mM EDTA的类似缓冲液中。将线性化的质粒DNA，即pDAB 3831用0.1M DTT处理1小时，并在NAP-5柱上过滤，进入含有EDTA的缓冲液中。通常，自冻干粉末使用肽。将肽和线性化的质粒DNA添加至经过滤的QD，并容许于4℃起反应过夜。使用三个Amicon滤器，将产物用Dulbecco氏磷酸盐缓冲液盐水(PBS)过滤两次，用高盐缓冲液(1.0M氯化钠、100mM柠檬酸钠，pH 7.2)过滤两次，并用PBS再过滤两次。需要高盐清洗以除去静电结合的DNA和肽，其仅用PBS清洗没有除去。Sulfo-SMCC具有在一端的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(其与经氨基修饰的QD起反应以形成酰胺键)和在另一端的马来酰亚胺基团(其与硫醇化(thiolated)的质粒DNA起反应以形成硫醚)。Sulfo-LC-SPDP也含有氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，其与任何含有伯胺的分子快速起反应，由此形成稳定的酰胺键。
植物内转化并筛选T1抗性植物：用纳米颗粒、归巢肽和质粒DNA(NHpD)缀合物溶液生成终体积250-500mL悬浮液，然后使用拟南芥植物(主要为未成熟的花簇及一些已受精的长角果)进行处理。在浸渍植物前，将浓度0.05％(250μL/500mL)-0.005％的Silwet L-77添加至NHpD缀合物溶液，并充分混合。将植物的地上部分在NHpD缀合物溶液中浸渍2至30秒，期间温和搅动。将经处理的植物在罩或覆盖物下于22-24℃放置16至24小时。将植物转移至Convirons，并允许其生长至成熟，并收集种子。使用选择盘(10.5”x21”x1”盘)来筛选来自T0植物的大量收获种子，每个盆上约10,000粒种子。使用两个对照来确保正确地完成选择喷雾；Col-0阴性转化体对照和掺入有在PAT(膦丝菌素乙酰基转移酶)选择标志方面纯合的种子的哥伦比亚Col-0野生型作为阳性转化体对照。为了实现同步，将种子在播种前在0.1％(w/v)琼脂溶液中分层48小时。为了提供每个选择盘10,000粒种子，将200mg种子添加至0.1％(w/v)琼脂溶液，并涡旋振荡，直至将种子均匀地悬浮。然后，将分层的种子在用Sunshine混合物LP5填充并用霍格兰氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的选择盘上播种。为了使选择喷雾有效，重要的是，将40ml悬浮种子均匀地播种至选择盘上。播种后，将增殖罩在每个选择盘上放置，并种植植物以使用较早提及的条件进行选择。在播种后约5天除去增殖罩。使用每次应用投递有效率280g/ha草铵膦的DeVilbiss压缩空气喷雾尖端，用喷雾体积10mL/盘(703L/ha)中的草铵膦(来自Bayer CropSciences的除草剂)的0.2％(v/v)溶液(20μl/10ml dH2O)在播种后5天喷雾幼苗，并在播种后10天再次喷雾幼苗。如下计算准备的量：(703L/ha喷雾体积＝280GPA)。(280g ai/ha)x(1ha/703L)x(1L/200g ai草铵膦)＝0.20％溶液(或20μL/10mL)。对于要喷雾的每个盘，将10mL溶液移液入20mL闪烁瓶中。使用水平和垂直应用模式投递喷雾。第二次喷雾后4至7天，鉴定除草剂抗性植物。
序列表
<110> 陶氏益农公司(Dow Agrosciences LLC)
Samboju, Narashima C
Yau, Kerrm Y
Burroughs, Frank G
Samuel, Jayakumar P
Webb, Steven R
<120> 使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递
<130> 2971 10046.1PC (68331-WO-PCT)
<150> 61/362,224
<151> 2010-07-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YFP基因的正向引物(Forward primer for YFP gene)
<400> 1
tgttccacgg caagatcccc tacg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YFP基因的反向引物(Reverse primer for YFP gene)
<400> 2
tattcatctg ggtgtgatcg gcca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的正向引物(Forward primer for PAT gene)
<400> 3
ggagaggaga ccagttgaga ttag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的反向引物(Reverse primer for PAT gene)
<400> 4
agatctgggt aactggccta actg 24