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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810782000.X (22)申请日 2018.07.17 (83)生物保藏信息 CGMCC NO.15950 2018.06.15 (71)申请人 中国海洋大学 地址 266000 山东省青岛市市南区鱼山路5 号中国海洋大学 (72)发明人 田相利赵坤李海东蒋雯雯 宋君 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23K 10/18(2016.01) A23K 50/80(2016.01) C02F 3/34(2006.01) C02F 3/30(2。
2、006.01) C12R 1/07(2006.01) C02F 101/16(2006.01) (54)发明名称 一株异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌及其复 合菌制剂 (57)摘要 本发明专利属于微生物及其应用领域， 尤其 涉及一株异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌BSXS- 1602； 还涉及一种以上述异养硝化-好氧反硝化 芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的复合菌制剂； 本发明还涉及一种以上述异养硝化-好氧反硝化 芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的混合菌粉。 本 发明的异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌， 为芽孢 杆菌BSXS-1602， 于2018年6月15日在中国普通微 生物菌种保藏管理中心进行。
3、了保藏， 保藏号为： CGMCCNO.15950。 本发明的芽孢杆菌BSXS-1602 是从海水养殖环境中分离的， 具有高效的异养硝 化-好氧反硝化性能， 能用于调控水产养殖水环 境。 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 108865940 A 2018.11.23 CN 108865940 A 1.一种异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌， 为芽孢杆菌BSXS-1602， 于2018年6月15日在中 国普通微生物菌种保藏管理中心进行了保藏， 保藏号为： CGMCC NO.15950。 2.一种权利要求1所述的芽孢杆菌BSXS-1602在去除NH4+-N和NO2-N以及水产养殖水环 境调控中的。
4、应用。 3.一种由权利要求1所述的芽孢杆菌BSXS-1602制成的菌粉。 4.一种权利要求3所述的菌粉的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将芽孢杆菌 BSXS-1602活化、 扩大培养， 经28液态发酵， 8000rpm离心收集菌泥， 加入膨润土作为载体， 将菌泥与膨润土搅拌均匀， 45烘干， 制成菌量为100500亿/g的菌粉。 5.一种权利要求3所述的菌粉作为水产动物饲料添加剂的应用， 以及调控水质的应用。 6.一种以权利要求1所述的芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的复合菌制剂， 其特征在 于， 所述复合菌制剂是由芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01以101。
5、2:1的细菌数 比例复合而成； 所述白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)， 于2012年12月7日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏， 保藏号为： CGMCC NO.6939。 7.一种权利要求6所述的复合菌制剂在降解NH4+-N和NO2-N以及水产养殖水环境调控中 的应用。 8.一种以权利要求1所述的芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的的混合菌粉， 其特征在 于， 制备方法如下： 将芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01分别活化、 扩大培养， 再 分别经28液态发酵， 然后将芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽。
6、孢杆菌BBHS-01按照1015:1的 细菌数比例混合， 8000rpm离心收集菌体， 加入膨润土和黄原胶作为载体， 将菌体与膨润土、 黄原胶搅拌均匀， 45烘干， 制成总菌量为100500亿/g的菌粉。 9.根据权利要求8所述的混合菌粉， 其特征在于， 所述载体为膨润土与黄原胶按照5:1 的质量比混合而成。 10.一种权利要求8所述的混合菌粉作为饲料添加剂的应用， 以及调控水质的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108865940 A 2 一株异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌及其复合菌制剂 技术领域 0001 本发明专利属于微生物及其应用领域， 尤其涉及一株异养硝化-好氧反硝化芽孢 杆菌。
7、BSXS-1602； 还涉及一种以上述异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌 BSXS-1602为主要成分 的复合菌制剂； 本发明还涉及一种以上述异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌BSXS-1602为主要 成分的混合菌粉。 背景技术 0002 氮污染是导致养殖水质恶化的重要因素之一， 严重威胁水生生物的生存。 生物脱 氮因其具有经济、 高效、 环保等优点而逐渐成为近年来的研究热点。 传统的生物脱氮通常包 含两部分， 第一步为硝化作用， 即自养硝化细菌在好氧条件下进行氮转化： NH4+-NNO2-N NO3-N； 第二步是异养硝化细菌在厌氧条件下进行氮转化： NO3-NNO2-NNO， N2ON2。 由于这两个。
8、阶段所需要条件截然不同， 因此传统的生物脱氮系统必须包含两个单独的体 系， 导致脱氮成本升高。 研究表明， 异养硝化细菌可以在利用碳源进行生长的同时， 将养殖 水体中的含氮化合物， 通过硝化作用， 转化为NH2OH、 NO2-N或NO3-N等； 与此同时， 大部分细 菌还可以同时进行好氧反硝化作用， 将NO2-N或NO3-N转化为NO、 N2O和N2等气体。 Paracoccu denitrificans(最初命名为Thiosphaera pantotropha)是首株被报道的具有好氧反硝化 作用的菌株， 其可以将NO3-N或 NO2-N反硝化为N2。 此后， 更多新的好氧反硝化菌株被分离 和。
9、研究， 例如 Thiosphaerapantotropha， 假单胞菌属(Pseudomonas)， 粪产碱杆菌 (Alcaligenes faecalis)， 芽孢杆菌(Bacillus)等。 0003 近年来研究表明， 芽孢杆菌具有较强的硝化和反硝化性能， 可以有效的去除养殖 水体中的NH4+-N和NO2-N， 减少NH4+-N和NO2-N等物质对养殖生物的毒害作用。 目前报导的大 部分异养硝化-好氧反硝化菌株分离自土壤、 污水处理系统和生物滤膜等， 分离自海水养殖 环境的菌株鲜见报导， 菌株的生活环境不同导致其适应性和脱氮性能存在较大的差异， 因 此从海水养殖环境中分离筛选具有高效脱氮能。
10、力的菌株显得尤为重要。 发明内容 0004 本发明的目的之一是从海水养殖环境中分离筛选一种具有高效的异养硝化- 好 氧反硝化性能的芽孢杆菌。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案， 一种异养硝化-好氧反硝化芽 孢杆菌， 为芽孢杆菌BSXS-1602， 于2018年6月15日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进 行了保藏， 保藏号为： CGMCC NO.15950。 0006 所述芽孢杆菌BSXS-1602去除性能主要包括对NH4+-N和NO2-N的去除方面， 该菌株 为分离筛选自凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘底泥的脱氮芽孢杆菌， 命名为 BSX。
11、S-1602， 经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 0007 本发明还公开了一种上述芽孢杆菌BSXS-1602在净化水质、 去除NH4+-N 和NO2-N 以及水产养殖水环境调控中的应用。 说明书 1/9 页 3 CN 108865940 A 3 0008 一株益生菌菌株能否成功应用于生产实践， 不仅与菌株本身较高的转化和脱氮性 能有关， 其对环境的适应性也至关重要。 研究结果表明， 本发明的芽孢杆菌BSXS-1602具有 较高的异养硝化-好氧反硝化性能， 对C/N的适应范围较广， 耐盐范围广， 具有更强的耐氧 性， 在水产养殖水环境调控中具有很好的潜在应用价值。 0。
12、009 一种上述芽孢杆菌BSXS-1602的菌粉， 其制备方法如下： 将芽孢杆菌BSXS-1602活 化、 扩大培养， 经28液态发酵， 8000rpm离心收集菌体， 加入膨润土作为载体， 将菌体与膨 润土搅拌均匀， 45烘干， 制成菌量为100500 亿/g的菌粉。 0010 本发明还公开了一种上述芽孢杆菌BSXS-1602菌粉作为水产动物饲料添加剂的应 用， 以及调控水质的应用， 所述芽孢杆菌BSXS-1602菌粉作为水产动物饲料添加剂时， 其添 加量为饲料质量的0.05-0.2。 本发明的芽孢杆菌BSXS-1602 菌粉方便存储和使用， 能促 进水产动物的食欲， 作为饲料添加剂投喂凡纳滨。
13、对虾时， 能够有效的降低饵料系数， 促进凡 纳滨对虾生长。 0011 本发明的另一目的是提供一种以芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的复合菌制剂， 所述复合菌制剂是由芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌(Bacillus baekryungensis) BBHS-01以1012:1的细菌数比例复合而成。 所述白翎芽孢杆 BBHS-01， 于2012年12月7日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏， 保藏地址： 北京市朝 阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 保藏号为： CGMCC NO.6939。 0012 一种以上述芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的复合。
14、菌制剂在净化水质、 去除NH4+-N 和NO2-N以及水产养殖水环境调控中的应用。 0013 实验结果表明芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01无拮抗作用， 将芽孢杆 菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01以1012:1的细菌数比例复合时， 芽孢杆菌BSXS-1602 和白翎芽孢杆菌BBHS-01均能快速良好生长， 芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01对 氮污染物的去除作用方面具有协同作用， 具体表现为： 芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌 BBHS-01以1012:1 的细菌数比例复合所制得的复合菌制剂能够有效的去除NH4+-N和 NO。
15、2-N， 改善养殖环境， 同剂量情况下， 复合酶制剂对NH4+-N和NO2-N的去除率显著高于任意 一种单株菌的去除效率。 0014 一种以芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的的混合菌粉， 其制备方法如下： 将芽孢杆 菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01分别活化、 扩大培养， 再分别经28液态发酵， 然后将 芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01按照 1015:1的细菌数比例混合， 8000rpm离 心收集菌体， 加入膨润土和黄原胶作为载体， 将菌体与膨润土、 黄原胶搅拌均匀， 45烘干， 制成总菌量为100500 亿/g的菌粉。 0015 进一步地， 所述载体为。
16、膨润土与黄原胶按照5:1的质量比混合而成。 通过使用膨润 土和黄原胶作为载体， 可以很好地负载芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01， 使本 发明的混合菌粉不易被水流冲散， 进而有利于芽孢杆菌 BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS- 01协同作用的发挥。 0016 本发明还公开了一种以上述混合菌粉作为饲料添加剂的应用， 以及调控水质的应 用， 所述混合菌粉作为饲料添加剂时， 其添加量为饲料质量的0.01 0.1。 0017 本发明的混合菌粉能促进水产动物的食欲， 作为饲料添加剂投喂水产动物时， 能 改善水产动物的肠道群落结构， 比如能改善刺参和凡纳滨对虾的肠道群落结构， 能。
17、够有效 说明书 2/9 页 4 CN 108865940 A 4 的降低饵料系数， 促进凡纳滨对虾生长， 此外本发明的混合菌粉方便存储且使用方便。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0019 (1)本研究通过对凡纳滨对虾养殖池塘底泥进行富集， 筛选具有高效的异养硝化- 好氧反硝化性能的芽孢杆菌BSXS-1602， 根据菌株的形态特征、 生理生化特性以及16S rDNA 序列和特异性序列比对分析， 菌株BSXS-1602被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 一株益生菌菌株能否成功应用于生产实践， 不仅与菌株本身较高的转化和脱氮 性能有关， 其对环境的适应性。
18、也至关重要。 本发明通过分析不同环境因子(碳源、 C/N(质量 比)、 pH、 盐度和转速)对菌株BSXS-1602异养硝化-好氧反硝化特性的影响， 发现在温度28 下， 菌株 BSXS-1602分别在碳源为葡萄糖、 C/N 18、 pH值7.5、 盐度30和转速160rpm 条件 下具有较高的异养硝化-好氧反硝化性能。 在此基础上， 分别研究了菌株 BSXS-1602异养硝 化和好氧反硝化的最佳反应条件。 正交实验结果表明， 当以 NH4Cl为氮源时， 菌株BSXS- 1602的最佳硝化条件分别是C/N 10、 pH值9.0、 盐度10和转速为160rpm。 当以NaNO2为氮源 时， 菌株。
19、BSXS-1602的最佳反硝化条件分别是C/N 10、 pH值6.0、 盐度30和转速为160rpm。 综上， 本发明的芽孢杆菌BSXS-1602具有较高的异养硝化-好氧反硝化性能， 对C/N的适应范 围较广， 耐盐范围广， 具有更强的耐氧性， 在水产养殖水环境调控中具有潜在的应用价值。 0020 (2)芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01以1012:1的细菌数比例复合所 制得的复合菌制剂能够有效的去除NH4+-N和NO2-N， 改善养殖环境， 同剂量情况下， 复合酶 制剂对NH4+-N和NO2-N的去除率显著高于任意一种单株菌的去除效率。 0021 (3)芽孢杆菌BSXS。
20、-1602的菌粉以及以芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的混合菌粉 能促进水产动物的食欲， 作为饲料添加剂投喂水产动物时， 能够有效的降低饵料系数， 促进 凡纳滨对虾生长， 此外本发明的混合菌粉方便存储且使用方便。 附图说明 0022 图1以16S rDNA序列为基础构建菌株BSXS-1602的系统发育树； 0023 图2为白翎芽孢杆菌BBHS-01及相关菌株的基于16S rDNA基因序列的系统发育树。 具体实施方式 0024 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0025 样品来源： 本研究中所用的对虾养殖池塘的。
21、底泥样品， 均于2014年7月采自江苏省 赣榆县(34 58 N,119 20 E)农业产业园区的佳信水产开发有限公司的三个对虾投饵养殖 池塘(温度28)。 0026 主要试剂和仪器： 本研究使用的主要化学试剂均购买自国药集团化学试剂有限公 司。 除特殊说明， 均为分析纯； PCR试剂购自北京全士金生物(TransGen Biotech)公司， 细菌 通用引物和特异性序列扩增引物均由上海生工生物工程 (Sangon Biotech)有限公司合 成。 所用主要仪器包括： -80超低温冰箱(SANYO Electric Co.,Ltd.Japan)； 电子天平 (METTLED TOLEDO Co。
22、rp.Shanghai,China)； AIR TECH超净工作台(万净集团安泰公司)； SPX型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)； HZQ-Q恒温摇床(中国哈尔滨市东联电子技术 开发有限公司)； YSI 556多参数水质测量仪(YSI Incorporated,USA)； DR2700型分光光度 说明书 3/9 页 5 CN 108865940 A 5 计 (HACH Incorporated,USA)； 高速冷冻离心机(Hitachi Koki Co.,Ltd.Japan)。 0027 培养基 0028 本研究中所使用的培养基主要包括： 0029 (1)富集培养基： (NH4)2SO4 2。
23、.0g、 MgSO4 0.10g、 NaH2PO4.2H2O 0.26g、 K2HPO4 0.5g、 CaCO3 1.0g、 FeSO4.7H2O 0.183g、 葡萄糖5g、 KNO2 1.0g、 NH4Cl 0.5g、 酵母提取物0.02g、 海水 1000mL、 pH 7.5； 分离平板是在上述富集培养基中添加2.0(w/v)的琼脂； 0030 (2)2216E培养基： 胰蛋白胨6.0g、 酵母提取物2.0g、 海水1000mL， pH 7.5。 2216E分 离平板是在上述富集培养基中添加2.0(w/v)的琼脂； 0031 菌株的脱氮性能检测使用人工配制的水产养殖模拟废水， 主要包括：。
24、 基础测试液、 异养硝化培养基(HNM)和亚硝酸盐反硝化培养基(NDM)。 其中， 0032 基础测试液： NH4Cl 0.1605g、 NaNO2 0.05g、 葡萄糖2.475g、 海水1000mL、 pH 7.5； 0033 异养硝化培养基(HNM)： NH4Cl 0.1605g、 葡萄糖2.0808g、 海水1000mL、 pH 7.5； 0034 亚硝酸盐反硝化培养基(NDM)： NaNO2 0.207g、 葡萄糖2.0808g、 海水 1000mL、 pH 7.5； 0035 上述富集培养基和人工模拟水产养殖废水在使用前均经高压灭菌处理。 0036 实施例1菌株芽孢杆菌BSXS-1。
25、602的分离及鉴定 0037 1、 芽孢杆菌菌株的分离和筛选 0038 取对虾养殖池塘预混后的底泥样品用无菌海水进行梯度稀释， 充分振荡混匀后静 置。 取上清液于无菌离心管并将其置于90水浴锅中水浴加热20min。 取水浴处理后的上清 液接种至含有富集培养基的250mL三角烧瓶中。 将接种后的三角烧瓶连续振荡培养一个星 期， 得到初始富集菌液。 根据1:10的接种比例， 将初始富集菌液接种至富集培养基中继续培 养一个星期， 如此反复驯化培养6 个周期。 取最后一次富集菌液， 进行菌株的分离和纯化。 将纯化后的菌株进行革兰氏染色和芽孢染色。 挑选革兰氏染色和芽孢染色均呈阳性的菌 株， 利用血平板。
26、法进行菌株致病性检测， 选取不存在致病性的菌株进行进一步研究。 利用基 础测试液对上述筛选出的菌株进行进一步的筛选， 挑选具有硝化和反硝化能力的菌株。 0039 通过对富集驯化筛选出的菌株进行水浴、 革兰氏染色和芽孢染色， 初步筛选得到5 株芽孢杆菌； 然后通过以菌株对基础去除液NH4+-N和NO2-N的去除能力为依据， 进一步筛选 得到1株具有高效硝化-反硝化性能的菌株， 即为 BSXS-1602。 0040 2、 菌株的鉴定 0041 菌株生理生化特性测定： 鉴定的项目主要包括菌株的形态、 革兰氏染色、 芽孢染 色、 甲基红、 V-P测定、 氧化酶、 接触酶、 淀粉水解酶、 脂酶、 溶菌酶。
27、、 亚硝酸盐还原酶、 西式柠 檬酸盐、 葡萄糖发酵、 甘露醇、 明胶液化、 厌氧生长、 动力培养基和H2S。 0042 测序扩增后的菌株BSXS-1602的16S rDNA基因序列(1460bp)与NCBI 数据库序列 进行比对， 以16S rDNA序列同源性为基础选取相关菌株基因序列构建系统发育树(见图1， 其中BSXS-1602为本发明的菌株芽孢杆菌BSXS-1602)。 结合生理生化实验结果和16S rDNA 序列鉴定， 可以确定菌株BSXS-1602为枯草芽孢杆菌。 0043 3、 菌株BSXS-1602的形态学观察 0044 在光学显微镜下， 菌株BSXS-1602呈短杆状， 具有鞭。
28、毛， 能运动。 经过革兰氏染色和 芽孢染色的菌株， 在光学显微镜下为革兰氏染色阳性， 芽孢染色均匀。 将纯化的菌株BSXS- 说明书 4/9 页 6 CN 108865940 A 6 1602置于生化培养箱28条件下培养24小时后， 2216E平板上的菌落为乳白色、 扁平、 不透 明、 边缘不规则。 0045 4、 生理生化鉴定结果 0046 菌株BSXS-1602和模式菌株枯草芽孢杆菌CGMCC1.3358的生理生化结果见表1。 0047 表1菌株BSXS-1602和枯草芽孢杆菌CGMCC1.3358的生理生化结果 0048 0049 0050 备注：“+” 代表阳性；“-” 代表阴性。 0。
29、051 5、 不同环境因子对菌株芽孢杆菌BSXS-1602的影响 0052 通过分析不同环境因子(碳源、 C/N(质量比)、 pH、 盐度和转速)对菌株 BSXS-1602 异养硝化-好氧反硝化特性的影响， 发现在温度28下， 菌株 BSXS-1602分别在碳源为葡萄 糖、 C/N 18、 pH值7.5、 盐度30和转速160rpm 条件下具有较高的异养硝化-好氧反硝化性 能。 研究结果表明， 该菌株具有较高的异养硝化-好氧反硝化性能， 在水产养殖水环境调控 中具有潜在的应用价值。 0053 实施例2白翎芽孢杆菌BBHS-01的主要特征及其对水体污染物的去除实验 0054 1.白翎芽孢杆菌BB。
30、HS-01的主要特征如下： 0055 (1)形态特征： 0056 形态为杆状， 能运动， 可产生芽孢， 二分裂生殖， 菌体单个、 两两或短链相聚。 0057 (2)生理生化特征： 0058 菌株革兰氏阳性， 芽孢染色阳性， 油脂水解酶阳性， 淀粉水解酶阳性， 接触酶阳性， V-P试验阴性， 葡萄糖氧化发酵产产气、 明胶阳性、 乳糖阳性、 麦芽糖阳性、 甘露醇阴性、 甘露 糖阳性、 蔗糖阴性、 阿拉伯糖阴性、 木糖阴性。 0059 (3)菌株鉴定 0060 根据白翎芽孢杆菌BBHS-01和相关菌株的16S rDNA构建的系统发育树最终确定菌 株为白翎芽孢杆菌属的细菌(见图2， 其中BBHS-01。
31、为本发明的菌株白翎芽孢杆菌)。 说明书 5/9 页 7 CN 108865940 A 7 0061 2.白翎芽孢杆菌BBHS-01对水体污染物的去除实验： 0062 (1)对虾饵料固体平板生长情况检测： 0063 从对虾养殖池塘底泥中分离筛选出白翎芽孢杆菌BBSH-01(保藏号为： CGMCC NO.6939)， 该菌株于281在20g/L的对虾饵料培养基(市售对虾饵料20g研成细粉， 灭菌 陈海水1000mL， 浸泡48h后离心取上清， 加琼脂25 g， 调pH 7.8， 121， 灭菌20min)上长势 好， 生长迅速， 培养24h的菌落直径可达2mm左右。 0064 (2)对虾饵料浸出液。
32、的去除效果检测： 0065 1)白翎芽孢杆菌BBHS-01对对虾饵料浸出液的去除效果实验 0066 实验所用的去除液： 为市售对虾饵料20g研成细粉， 灭菌陈海水1000mL， 浸泡48h后 离心取上清， 加亚硝酸钠0.058g， 调pH 7.8， 分装成100mL/瓶， 于 121， 灭菌20min。 0067 将白翎芽孢杆菌BBHS-01的24h活化培养物8000rpm离心10min， 以无菌生理盐水洗 剂沉淀菌体， 并稀释成含1106cfu/mL的菌液， 然后将菌液按1的比例加至100mL的对虾 饵料去除液中， 281、 160rpm下振荡培养5d， 每天定时取样， 测定样品液中的氨氮(。
33、NH4+- N)、 亚硝酸氮(NO2-N)含量， OD600， 以未添加菌株的作为对照处理， 每个处理设3次重复。 0068 2)实验结果 0069 实验结果分别见表2。 实验结果表明： 白翎芽孢杆菌BBHS-01对对虾饵料去除液具 有明显的去除效果， 在实验期间随着该菌株的生长， 可显著去除饵料去除液中的无机氮成 分， 其中对NH4+-N、 NO2-N的最高去除率分别为60.34、 92.40。 0070 表2白翎芽孢杆菌BBHS-01于不同培养时间对饵料浸出液的去除效果 0071 0072 实施例3芽孢杆菌BSXS-1602与白翎芽孢杆菌BBHS-01的拮抗实验 0073 分别取芽孢杆菌B。
34、SXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01于2216E固体培养基划线， 置于 28培养24h后， 分别挑取单菌落在2216E固体培养基上进行十字划线， 将划线的平板于28 培养24h后， 检查菌株生长情况， 拮抗实验划线培养结果表明两菌株均不存在拮抗作用。 0074 实施例4芽孢杆菌BSXS-1602对水体污染物的去除实验 0075 (1)对虾饵料固体平板生长情况检测： 0076 芽孢杆菌BSXS-1602于281在20g/L的对虾饵料培养基(市售对虾饵料 20g研 成细粉， 灭菌陈海水1000mL， 浸泡48h后离心取上清， 加琼脂25g， 调pH 7.8， 121， 灭菌 20min)。
35、上长势好， 生长迅速， 培养24h的菌落直径可达2mm左右。 0077 (2)对虾饵料浸出液的去除效果检测： 0078 1)芽孢杆菌BSXS-1602对对虾饵料浸出液的去除效果实验 0079 实验所用的测试液为： 市售对虾饵料20g研成细粉， 灭菌陈海水1000mL， 浸泡48h 说明书 6/9 页 8 CN 108865940 A 8 后， 离心取上清， 加亚硝酸钠0.058g， 调pH 7.8， 分装成100mL/瓶， 于121， 灭菌20min。 0080 将芽孢杆菌BSXS-1602的24h活化培养物8000rpm离心10min， 以无菌生理盐水洗剂 沉淀菌体， 并稀释成含1106cf。
36、u/mL的菌液， 然后将菌液按1的比例加至100mL的对虾饵 料浸出液中， 28、 160rpm连续振荡培养5d， 每天定时取样， 测定样品液中的氨氮(NH4+-N)、 亚硝酸氮(NO2-N)含量， 菌体生长量， 以不加菌作为对照处理， 每个处理设3次重复。 0081 2)实验结果 0082 实验结果分别见表5。 实验结果表明： 芽孢杆菌BSXS-1602对对虾饵料浸出液中的 NH4+-N和NO2-N具有明显的去除效果， 在实验期间随着该菌株的生长， 可显著去除饵料浸出 液中的无机氮成分， 其中对NH4+-N和NO2-N的最高去除率分别为52.35、 97.23。 0083 表5芽孢杆菌BSX。
37、S-1602于不同培养时间对饵料浸出液的去除效果 0084 0085 实施例5复合菌制剂对水体污染物的去除实验 0086 本实施例的复合菌制剂是由芽孢杆菌BSXS-1602、 白翎芽孢杆菌BBHS-01 以10:1 的细菌数比例复合而成。 0087 实验所用的测试液为： 市售对虾饵料20g研成细粉， 灭菌陈海水1000mL， 浸泡48h后 离心取上清， 加亚硝酸钠0.058g， 调pH 7.8， 分装成100mL/瓶， 于121， 灭菌20min。 0088 将芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01分别经24h活化培养、 扩大培养， 再 分别经28液态发酵， 然后将芽孢杆菌BS。
38、XS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01按照10:1的细菌 数比例混合， 以无菌生理盐水洗剂沉淀菌体， 将混合菌体稀释， 制成浓度为1106cfu/mL的 菌液， 然后将菌液按1的比例加至100 mL的对虾饵料浸出液中， 28、 160rpm连续振荡培 养5d， 每天定时取样， 测定样品液中的氨氮(NH4+-N)、 亚硝酸氮(NO2-N)含量， 菌体生长量， 以不加菌作为对照处理， 每个处理设3次重复。 实验结果分别见表6。 实验结果表明： 芽孢杆 菌BSXS-1602对对虾饵料浸出液中的NH4+-N和NO2-N具有明显的去除效果， 在实验期间随着 该菌株的生长， 可显著去除饵料去除液中的无。
39、机氮成分， 其中对NH4+-N和NO2-N的最高去除 率分别为93.66、 100。 0089 表6复合菌制剂于不同培养时间对饵料去除液的去除效果(15d) 说明书 7/9 页 9 CN 108865940 A 9 0090 0091 实施例6芽孢杆菌BSXS-1602菌粉对凡纳滨对虾生长的促进作用 0092 本实施例的芽孢杆菌BSXS-1602的菌粉， 制备方法如下： 将芽孢杆菌 BSXS-1602活 化、 扩大培养， 经28液态发酵， 8000rpm离心收集菌体， 加入膨润土作为载体， 将菌体与膨 润土搅拌均匀， 45烘干， 制成菌量为100500 亿/g的菌粉。 0093 将本实施例的芽。
40、孢杆菌BSXS-1602菌粉分别按0.05、 0.1、 0.15、 0.2的质 量百分比分别添加到对虾配合饲料中， 以不添加菌粉的处理组作为对照组， 每个处理设3次 重复， 连续喂食凡纳滨对虾(对虾初始体重为0.60.08g)45 天， 实验结束时， 添加0.05 芽孢杆菌BSXS-1602菌粉的处理组凡纳滨对虾平均增重率为283.3， 饵料系数为1.65； 添 加0.1芽孢杆菌BSXS-1602菌粉的处理组凡纳滨对虾平均增重率为297.5， 饵料系数为 1.57； 添加0.15芽孢杆菌BSXS-1602菌粉的处理组凡纳滨对虾平均增重率为318.4， 饵 料系数为1.51； 添加0.2芽孢杆菌。
41、BSXS-1602菌粉的处理组凡纳滨对虾平均增重率为 318.9， 饵料系数为1.48； 对照组凡纳滨对虾平均增重率为261.8， 饵料系数为2.04。 0094 本发明的芽孢杆菌BSXS-1602菌粉方便存储和使用， 能促进水产动物的食欲， 作为 饲料添加剂投喂凡纳滨对虾时， 能够有效的降低饵料系数， 促进凡纳滨对虾生长。 0095 实施例7以芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的的混合菌粉对凡纳滨对虾生长的促 进作用 0096 本实施例的以芽孢杆菌BSXS-1602为主要成分的的混合菌粉， 其制备方法如下： 将 芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01分别活化、 扩大培养， 。
42、再分别经28液态发酵， 然后将芽孢杆菌BSXS-1602和白翎芽孢杆菌BBHS-01 按照15:1的细菌数比例混合， 8000rpm 离心收集菌体， 加入膨润土和黄原胶作为载体(膨润土与黄原胶的质量比为5:1)， 将菌体与 膨润土、 黄原胶搅拌均匀， 45烘干， 制成总菌量为100500亿/g的菌粉。 0097 将本实施例的混合菌粉分别按0.01、 0.05、 0.08、 0.1的质量百分比分别 添加到对虾配合饲料中， 以不添加混合菌粉的处理组作为对照组， 每个处理设3次重复， 连 续喂食凡纳滨对虾(对虾初始体重为0.60.08g)45天， 实验结束时， 添加0.01混合菌粉 的处理组凡纳滨对。
43、虾平均增重率为281.7， 饵料系数为1.68； 添加0.05混合菌粉的处理 组凡纳滨对虾平均增重率为299.3， 饵料系数为1.59； 添加0.08混合菌粉的处理组凡纳 滨对虾平均增重率为 317.2， 饵料系数为1.48； 添加0.1混合菌粉的处理组凡纳滨对虾 平均增重率为320.2， 饵料系数为1.45； 对照组凡纳滨对虾平均增重率为261.8， 饵料系 数为2.04。 0098 本发明的混合菌粉方便存储和使用， 能促进水产动物的食欲， 作为饲料添加剂投 喂凡纳滨对虾时， 能够有效的降低饵料系数， 促进凡纳滨对虾生长。 说明书 8/9 页 10 CN 108865940 A 10 0099 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出： 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进， 这些改进应视为本发明的保 护范围。 说明书 9/9 页 11 CN 108865940 A 11 图1 图2 说明书附图 1/1 页 12 CN 108865940 A 12 。