技术领域
本发明通常涉及D-丙氨酸的制备技术领域，且特别地，涉及生产高纯度D-丙氨酸的方法。
背景技术
D-丙氨酸作为L-丙氨酸光学异构体，存在于大多数有机组织中，如作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素的组成成分，是一种重要的手性有机化合物。
目前D-丙氨酸主要应用于药物生产和食品添加剂上。
药用上，D-丙氨酸是制药行业进行手性合成的手性原料，主要用于手性药物、药物中间体的合成。目前主要用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇和多肽等。D-丙氨酸本身也是生产维生素B6的原料。D-丙氨酸具有伯胺基，能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成VANSlyke反应，分解为氮气和有机酸，从而抑制了致癌物质二甲基亚硝胺DMNA的生成。因此，D-丙氨酸作为一种新的癌基因治疗方法在临床上被应用。
在食品添加剂工业，D-丙氨酸主要应用于增加化学调味料的调味效果，改善人工甜味剂的味感，改善有机酸的酸味。因为D-丙氨酸本身具有强甜味，味感值是4，是氨基酸中最甜的一种。它可以和L-天冬氨酸合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-tea-methylthiet anylamine)。阿力甜甜味品质好，味道纯正，没有异味和不愉快的后味，而且只有部分阿力糖参与机体代谢，其最大的产热量只相当于相当甜度蔗糖的0.02％，符合人们目前对低热食品的追求。在糖尿病人的功能食品上具有重要作用。这些应用为该产品提供了巨大的市场空间。
现在D-丙氨酸的制取方法主要是微生物发酵法和化学合成法。
微生物发酵法可以通过短杆乳酪酵母将D-环丝氨酸生成D-丙氨酸制得。但是产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副反应，分离较复杂、污染大。而且由于丙氨酸的外消旋的活泼性，产物D-丙氨酸的光学纯度比较低。
D-丙氨酸的化学合成方法有两种，一种是利用不对称合成法直接得到D-丙氨酸，另一种是通过化学合成法得到DL-丙氨酸的混旋体，再利用各种光学拆分方法，得到D-丙氨酸。化学合成法采用多种原料和工艺路线，成本较低，生产规模大，适应于工业化生产。但所得到的产物皆为DL-混型丙氨酸，必须进行光学拆分，才可以得到D-丙氨酸。目前用于分离DL-丙氨酸的方法因步骤多，成本高，工业化比较困难。而且化学合成反应机制复杂，工艺过程长；需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，生产成本极高。
目前国外工业化生产D-丙氨酸普遍采用“氨基酸酰化酶拆分法”，该法利用的氨基酸价格昂贵，生产成本仍然较高，只能用于小规模工业化生产。
由于D-丙氨酸的生理作用被不断发现，其应用越来越广泛，需要研究开发一种适合大规模工业化、能显著降低生产成本的D-丙氨酸生产技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明以低浓度DL-丙氨酸作为底物，并在调节发酵液pH时添加DL-丙氨酸底物，缩短发酵周期，在36-42小时完成发酵周期，制备高浓度D-丙氨酸。至少基于此目的完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
(1)将微生物接种到含有1.0％-1.5％w/v DL-丙氨酸的发酵培养基中，并在适于微生物生长的环境下培养所述微生物；
(2)当L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比小于1:4，且发酵液的pH大于7.0时，添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液，以控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内；
(3)当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9％以下时，结束含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液的添加。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的浓度为40-60％w/v。
在某些实施方式中，所述的方法中，在发酵期间DL-丙氨酸的添加总量与起始DL-丙氨酸的质量比为1:0.8至1:1.2。
在某些实施方式中，所述的方法中，当培养所述微生物6小时后，开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液。
在某些实施方式中，所述的方法中，还包括(4)向所述发酵液中加入硅藻土和活性炭，蒸发浓缩，过滤取清液，并浓缩结晶。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述步骤(4)的浓缩结晶包括：
当所述清液浓缩至所述发酵液体积的10％-20％时，向所述清液中加入同体积的异丙醇，搅拌、离心并烘干得到D-丙氨酸。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述硝酸水溶液中硝酸的浓度为5-15％w/v。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述发酵培养基包含0.5％-1.0％玉米浆、0.05％-0.1％磷酸二氢钠、0.1％-0.2％硫酸镁和10-120％维生素H。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述硅藻土在所述发酵液中的浓度为1.5-2％w/v，所述活性炭在所述发酵液中的浓度为2.5％-3.0％w/v。
在某些实施方式中，所述的方法中，所述微生物是在30°-32°的斜面上培养24-26小时获得。
有益效果：
(1)本发明中以低浓度DL-丙氨酸作为发酵底物，在发酵过程中边调节发酵液体的pH值边向发酵液体中添加一定量的DL-丙氨酸，控制发酵反应过程中发酵底物的浓度，提高发酵效率。
(2)本发明中生产D-丙氨酸的整个发酵周期为36-42小时，缩短生产周期，提高生产效率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。除非另有说明，否则％指质量体积百分比。例如，9％是指100毫升体积中含有9克物质。
本发明所述的DL-丙氨酸是指同时含有D-丙氨酸和L-丙氨酸的混合物。对于混合物中D-丙氨酸和L-丙氨酸的比例没有特别限定。优选地，作为起始原料的混合物中具有等量的D和L-丙氨酸。
如本发明所用的微生物是具有高L-异构体降解活性的菌株。优选，所述微生物是指能够降解L-丙氨酸，而对D-丙氨酸不降解的菌株。本发明所述微生物可使用现有技术中已知的任何菌株，也可使用通过已知技术获得的具有本发明所述功能的任何菌株。作为获取本发明所述菌株的已知方法包括：
在富含有机质的土壤中采集土样的步骤，所述土样为距离地面5-15cm的土壤；优选地，所述土壤为富含酵母菌的果园、菜园或野果生长区域；对所述土样中菌株进行增殖培养的步骤；所述土样中的所有菌株进行培养分离的步骤；从所有菌株中获取目标菌株的步骤。所述目标菌株是指对L-丙氨酸降解能力很高的菌株。
在某些实施方案中，所述微生物为能够分泌氨基酸氧化酶、L-异构体消旋酶或其他能够降解L-丙氨酸的酶的菌株。例如，所述微生物为假丝酵母、乳酸发酵短杆菌DCSR-26、乳酸发酵短杆菌HR5-43、Bacillus Brevis ATCC 8185、Ala-D45、Pseudomaonas striata或刺孢小银汉霉9980菌株。
本发明中需要保持微生物的活性，所述活性是指微生物具有增殖、繁殖或生长的活力。优选地，所述微生物不能为裂解状态。微生物的裂解降低反应速率。
本发明中控制发酵过程中的pH值是重要的。随着发酵过程的进行，发酵液中的pH值会降低。发明人发现当pH值低于6.5时，L-丙氨酸的降解变弱，反应效率降低。优选地的pH值低于6.8。另一方面，如果pH值高于7.0，则应时间会延长。优选地，控制发酵过程中的pH在6.5-7.0之间，更优选6.6-6.8之间。
本发明在反应过程中，优选当D-丙氨酸的晶体形式占总体积的9％以下时结束添加，优选当晶体占8％以下时结束添加。例如5％时结束添加。在某些实施方案中，发酵液中溶解状态的D-丙氨酸优选为10％以上，优选12％以上，更优选15％以上，最优选16％。
本发明中，利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液调节发酵培养基中发酵液体的pH值，在利用硝酸水溶液进行发酵液体pH值调节的同时向发酵液体中加入DL-丙氨酸，使得发酵液体中发酵底物浓度与发酵液体的pH值相匹配，在控制发酵液体pH值时，控制添加DL-丙氨酸的速度和质量，保持培养基中的菌体密度，提高D-丙氨酸生产效率。其中，DL-丙氨酸的质量占硝酸水溶液和DL-丙氨酸总质量的百分数为40-60％，优选地，DL-丙氨酸的质量占硝酸水溶液和DL-丙氨酸总质量的百分数为45-55％，例如，DL-丙氨酸的质量占硝酸水溶液和DL-丙氨酸总质量的百分数为45％、50％或55％。且，DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的质量体积浓度为50-55g/L，例如，DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的质量体积浓度为50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L或55g/L。
本发明的发酵过程中需要控制L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内。L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比低于1:4，则反应速度放缓。另一方面，如果高于1:2，则反应速度同样下降。需要说明的是，当最后一次增加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液后，随着反应的进行，此时L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比可小于1:4，甚至为0。
本发明中发酵期间DL-丙氨酸的添加总量与起始DL-丙氨酸的质量比为1:0.8至1:1.2。优选1:1。
优选地，在开始发酵培养6小时以上之后，开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液。如果时间过短，例如在开始发酵后第5小时以内添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液，则不利于控制L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在适当的范围内。如果开始发酵培养后10小时以上之后，开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液，则L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比会过低，不利于反应速度的提升。优选在开始发酵后第6-10小时之间，例如7小时、8小时、9小时开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液。
本发明的微生物培养条件优选如下所述：
把微生物菌种在斜面上31℃培养24小时，接入到消毒好的培养基中，其中培养基的成分为15克DL-丙氨酸、10克玉米浆、120微克维生素H、0.8克磷酸二氢钠、1.2克硫酸镁，培养基体积定容到1000毫升在摇床上振荡培养61小时，发酵过程控制底物浓度和pH值，流加共计150克的DL-丙氨酸，然后在发酵液中加入19克的硅藻土、20.8克的活性炭，86℃加热43分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把发酵清液浓缩到原来的120毫升，加入98％的异丙醇120毫升，搅拌在室温条件下使D-丙氨酸结晶28小时，离心、烘干得到D-丙氨酸成品55克。
实施例
实施例1
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为30.5°的斜面上培养25小时，然后将微生物接种到发酵培养基中，所述培养基包含：1.5gDL-丙氨酸、0.8g玉米浆、120μg维生素H、0.9g磷酸二氢钠和0.1g硫酸镁，且培养基体积定容到100毫升。
在摇床上振荡培养6小时后，检测L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5，发酵液的pH为7.5，利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓度和pH值，控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内；其中所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为50％，当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为2％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计15g。
向发酵液体中加入硅藻土1.8g、活性炭2.5g，在86℃温度加热32分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15％)，再加入98％的异丙醇15毫升，在室温条件下搅拌，当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9％时，结束发酵，D-丙氨酸结晶25小时，离心、烘干得到D-丙氨酸成品5.3g。整个发酵过程36小时。
实施例2
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31°的斜面上培养24小时，然后将微生物接种到发酵培养基中，所述培养基包含：15gDL-丙氨酸、10g玉米浆、120μg维生素H、0.8g磷酸二氢钠和1.2g硫酸镁，且培养基体积定容到1000毫升。
在摇床上振荡培养6.5小时，检测L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:4.5，发酵液的pH为8时，利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓度和pH值，控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内；其中，所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为45％。当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为5％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计150g。
向发酵液体中加入硅藻土19g、活性炭20.8g，在86℃温度加热43分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到120毫升(发酵液体的12％)，再加入98％的异丙醇120毫升，在室温条件下搅拌，当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9％时，结束发酵，D-丙氨酸结晶28小时，离心、烘干得到D-丙氨酸成品55g。整个发酵过程40小时。
实施例3
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31°的斜面上培养26小时，然后将微生物接种到发酵培养基中，所述培养基包含：13gDL-丙氨酸、10g玉米浆、150μg维生素H、0.68g磷酸二氢钠和1.5g硫酸镁，且培养基体积定容到1000毫升。
在摇床上振荡培养7小时，L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:6，且发酵液的pH为8.5时，利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓度和pH值，控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内；其中，所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为55％。当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为8.1％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计130g。
向发酵液体中加入硅藻土16g、活性炭2.5g，在89℃温度加热40分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到160毫升(发酵液体的16％)，再加入98％的异丙醇160毫升，在室温条件下搅拌，D-丙氨酸结晶25小时，当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9％时，结束发酵，离心、烘干得到D-丙氨酸成品58g。整个发酵过程35小时。
对比例1
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为30°的斜面上培养28小时，然后将微生物接种到100毫升发酵培养基中，所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为15％以外与实施例1中的培养基相同。
在摇床上振荡培养48小时，在发酵过程中利用硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中的pH值在6.5-7.0内。继续反应直至L-丙氨酸为0。
向发酵液体中加入硅藻土1.8g、活性炭2.5g，在86℃温度加热32分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15％)，再加入98％的异丙醇15毫升，在室温条件下搅拌，离心、烘干得到D-丙氨酸成品。整个发酵过程65小时。
对比例2
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31°的斜面上培养24小时，然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中，所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为15％以外与实施例2中的培养基相同。
在摇床上振荡培养5小时，检测发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:1.5，发酵液的pH6.8，利用含有50％DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中的pH值在6.5-6.8内。当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为12.2％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计25g。
向发酵液体中加入硅藻土1.8g、活性炭2.5g，在86℃温度加热32分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15％)，再加入98％的异丙醇15毫升，在室温条件下搅拌，离心、烘干得到D-丙氨酸成品。整个发酵过程70小时。
对比例3
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31°的斜面上培养24小时，然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中，所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为13％以外与实施例3中的培养基相同。
在摇床上振荡培养12小时，检测发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5，发酵液的pH7.6，利用含有50％DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内。当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为2.3％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计15g。
向发酵液体中加入硅藻土1.8g、活性炭2.5g，在86℃温度加热32分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15％)，再加入98％的异丙醇15毫升，在室温条件下搅拌，离心、烘干得到D-丙氨酸成品。整个发酵过程45小时。
对比例4
把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31°的斜面上培养24小时，然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中，所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为13％以外与实施例3中的培养基相同。
在摇床上振荡培养12小时，检测发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5，发酵液的pH7.6，利用含有50％DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内。当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为10％时，结束添加，继续反应直至L-丙氨酸为0。伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计118g。
向发酵液体中加入硅藻土1.8g、活性炭2.5g，在86℃温度加热32分钟，过滤，取清液，真空浓缩，把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15％)，再加入98％的异丙醇15毫升，在室温条件下搅拌，离心、烘干得到D-丙氨酸成品。整个发酵过程69小时。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。