生产高纯度D丙氨酸的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710722210.5 (22)申请日 2017.08.22 (71)申请人 山西恩泽生物技术有限公司 地址 030599 山西省吕梁市阳渠村南 (72)发明人 赵建刚王娜 (74)专利代理机构 北京科石知识产权代理有限 公司 11595 代理人 刘艳春高元吉 (51)Int.Cl. C12P 13/06(2006.01) (54)发明名称 生产高纯度D-丙氨酸的方法 (57)摘要 提供生产高纯度D-丙氨酸的方法， 该方法包 括： 将微生物接种到含有1.0-1.5w/vDL

2、-丙 氨酸的发酵培养基中进行发酵的步骤； 当发酵液 的pH大于7.0， 且L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比 小于1:4时， 添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至 发酵液， 以控制pH值在6.5-7.0之间。 以低浓度 DL-丙氨酸作为底物， 并在调节发酵液pH时添加 DL-丙氨酸底物， 缩短发酵周期， 在36-42小时完 成发酵周期， 制备高浓度D-丙氨酸。 权利要求书1页 说明书6页 CN 107365810 A 2017.11.21 CN 107365810 A 1.一种生产高纯度D-丙氨酸的方法， 其包括以下步骤： (1)将微生物接种到含有1.0-1.5w/v DL-丙氨酸的发酵培养基中，

3、并在适于微生 物生长的环境下培养所述微生物； (2)当L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比小于1:4， 且发酵液的pH大于7.0时， 添加含有DL- 丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液， 以控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4 至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内； (3)当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9以下时， 结束含有DL-丙氨酸的硝 酸水溶液的添加。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中所述DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的浓度为40-60 w/v。 3.根据权利要求1所述的方法， 其中在发酵期间DL-丙氨酸的添加总量与起始DL-丙氨 酸的质量比为1:0.8至1:1.2。

4、4.根据权利要求1所述的方法， 其中当培养所述微生物6小时后， 开始添加含有DL-丙氨 酸的硝酸水溶液至发酵液。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中还包括步骤(4)向所述发酵液中加入硅藻土和活性 炭， 蒸发浓缩， 过滤取清液， 并浓缩结晶。 6.根据权利要求5所述的方法， 其中所述步骤(4)的浓缩结晶包括： 当所述清液浓缩至所述发酵液体积的10-20时， 向所述清液中加入同体积的异丙 醇， 搅拌、 离心并烘干得到D-丙氨酸。 7.根据权利要求1所述的方法， 其中所述硝酸水溶液中硝酸的浓度为5-15w/v。 8.根据权利要求1所述的方法， 其中所述发酵培养基包含0.5-1.0玉米浆、 0.05

5、- 0.1磷酸二氢钠、 0.1-0.2硫酸镁和10-120维生素H。 9.根据权利要求5所述的方法， 其中所述硅藻土在所述发酵液中的浓度为1.5-2w/v， 所述活性炭在所述发酵液中的浓度为2.5-3.0w/v。 10.根据权利要求1所述的方法， 其中所述微生物是在30 -32 的斜面上培养24-26小时 获得。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107365810 A 2 生产高纯度D-丙氨酸的方法 技术领域 0001 本发明通常涉及D-丙氨酸的制备技术领域， 且特别地， 涉及生产高纯度D-丙氨酸 的方法。 背景技术 0002 D-丙氨酸作为L-丙氨酸光学异构体， 存在于大多数有机组织中，

6、如作为细胞壁肽 壁糖或肽抗生素的组成成分， 是一种重要的手性有机化合物。 0003 目前D-丙氨酸主要应用于药物生产和食品添加剂上。 0004 药用上， D-丙氨酸是制药行业进行手性合成的手性原料， 主要用于手性药物、 药物 中间体的合成。 目前主要用于生产新型广谱抗生素、 D-丙氨醇和多肽等。 D-丙氨酸本身也是 生产维生素B6的原料。 D-丙氨酸具有伯胺基， 能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成 VANSlyke反应， 分解为氮气和有机酸， 从而抑制了致癌物质二甲基亚硝胺DMNA的生成。 因 此， D-丙氨酸作为一种新的癌基因治疗方法在临床上被应用。 0005 在食品添加剂工业， D-丙氨酸主

7、要应用于增加化学调味料的调味效果， 改善人工 甜味剂的味感， 改善有机酸的酸味。 因为D-丙氨酸本身具有强甜味， 味感值是4， 是氨基酸中 最甜的一种。 它可以和L-天冬氨酸合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-tea-methylthiet anylamine)。 阿力甜甜味品质好， 味道纯正， 没有异味和不愉快的后味， 而且只有部分阿力 糖参与机体代谢， 其最大的产热量只相当于相当甜度蔗糖的0.02， 符合人们目前对低热 食品的追求。 在糖尿病人的功能食品上具有重要作用。 这些应用为该产品提供了巨大的市 场空间。 0006 现在D-丙氨酸的制取方法主要是微生物发酵法和化学合成法。 0007

8、 微生物发酵法可以通过短杆乳酪酵母将D-环丝氨酸生成D-丙氨酸制得。 但是产物 浓度低， 生产周期长， 设备投资大， 有副反应， 分离较复杂、 污染大。 而且由于丙氨酸的外消 旋的活泼性， 产物D-丙氨酸的光学纯度比较低。 0008 D-丙氨酸的化学合成方法有两种， 一种是利用不对称合成法直接得到D-丙氨酸， 另一种是通过化学合成法得到DL-丙氨酸的混旋体， 再利用各种光学拆分方法， 得到D-丙氨 酸。 化学合成法采用多种原料和工艺路线， 成本较低， 生产规模大， 适应于工业化生产。 但所 得到的产物皆为DL-混型丙氨酸， 必须进行光学拆分， 才可以得到D-丙氨酸。 目前用于分离 DL-丙氨酸

9、的方法因步骤多， 成本高， 工业化比较困难。 而且化学合成反应机制复杂， 工艺过 程长； 需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂， 生产成本极高。 0009 目前国外工业化生产D-丙氨酸普遍采用 “氨基酸酰化酶拆分法” ， 该法利用的氨基 酸价格昂贵， 生产成本仍然较高， 只能用于小规模工业化生产。 0010 由于D-丙氨酸的生理作用被不断发现， 其应用越来越广泛， 需要研究开发一种适 合大规模工业化、 能显著降低生产成本的D-丙氨酸生产技术。 发明内容 说明书 1/6 页 3 CN 107365810 A 3 0011 为了解决上述问题， 本发明以低浓度DL-丙氨酸作为底物， 并在调节发酵液p

10、H时添 加DL-丙氨酸底物， 缩短发酵周期， 在36-42小时完成发酵周期， 制备高浓度D-丙氨酸。 至少 基于此目的完成了本发明。 具体地， 本发明包括以下内容。 0012 (1)将微生物接种到含有1.0-1.5w/v DL-丙氨酸的发酵培养基中， 并在适于 微生物生长的环境下培养所述微生物； 0013 (2)当L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比小于1:4， 且发酵液的pH大于7.0时， 添加含有 DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液， 以控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在 1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内； 0014 (3)当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9以

11、下时， 结束含有DL-丙氨酸 的硝酸水溶液的添加。 0015 在某些实施方式中， 所述的方法中， 所述DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的浓度为40- 60w/v。 0016 在某些实施方式中， 所述的方法中， 在发酵期间DL-丙氨酸的添加总量与起始DL- 丙氨酸的质量比为1:0.8至1:1.2。 0017 在某些实施方式中， 所述的方法中， 当培养所述微生物6小时后， 开始添加含有DL- 丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液。 0018 在某些实施方式中， 所述的方法中， 还包括(4)向所述发酵液中加入硅藻土和活性 炭， 蒸发浓缩， 过滤取清液， 并浓缩结晶。 0019 在某些实施方式中， 所述的方法中， 所

12、述步骤(4)的浓缩结晶包括： 0020 当所述清液浓缩至所述发酵液体积的10-20时， 向所述清液中加入同体积的 异丙醇， 搅拌、 离心并烘干得到D-丙氨酸。 0021 在某些实施方式中， 所述的方法中， 所述硝酸水溶液中硝酸的浓度为5-15w/v。 0022 在某些实施方式中， 所述的方法中， 所述发酵培养基包含0.5-1.0玉米浆、 0.05-0.1磷酸二氢钠、 0.1-0.2硫酸镁和10-120维生素H。 0023 在某些实施方式中， 所述的方法中， 所述硅藻土在所述发酵液中的浓度为1.5-2 w/v， 所述活性炭在所述发酵液中的浓度为2.5-3.0w/v。 0024 在某些实施方式中，

13、 所述的方法中， 所述微生物是在30 -32 的斜面上培养24-26 小时获得。 0025 有益效果： 0026 (1)本发明中以低浓度DL-丙氨酸作为发酵底物， 在发酵过程中边调节发酵液体的 pH值边向发酵液体中添加一定量的DL-丙氨酸， 控制发酵反应过程中发酵底物的浓度， 提高 发酵效率。 0027 (2)本发明中生产D-丙氨酸的整个发酵周期为36-42小时， 缩短生产周期， 提高生 产效率。 具体实施方式 0028 现详细说明本发明的多种示例性实施方式， 该详细说明不应认为是对本发明的限 制， 而应理解为是对本发明的某些方面、 特性和实施方案的更详细的描述。 0029 应理解本发明中所述

14、的术语仅仅是为描述特别的实施方式， 并非用于限制本发 说明书 2/6 页 4 CN 107365810 A 4 明。 另外， 对于本发明中的数值范围， 应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之 间的每个中间值。 在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围 内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。 这些较小范围的上限和下限可独立 地包括或排除在范围内。 0030 除非另有说明， 否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规 技术人员通常理解的相同含义。 虽然本发明仅描述了优选的方法和材料， 但是在本发明的 实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的

15、任何方法和材料。 本说明书中提到的所 有文献通过引用并入， 用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。 在与任何并入的 文献冲突时， 以本说明书的内容为准。 0031 关于本文中所使用的 “包含” 、“包括” 、“具有” 、“含有” 等等， 均为开放性的用语， 即 意指包含但不限于。 关于本文中所使用的 “和/或” ， 包括所述事物的任一或全部组合。 除非 另有说明， 否则指质量体积百分比。 例如， 9是指100毫升体积中含有9克物质。 0032 本发明所述的DL-丙氨酸是指同时含有D-丙氨酸和L-丙氨酸的混合物。 对于混合 物中D-丙氨酸和L-丙氨酸的比例没有特别限定。 优选地， 作为起

16、始原料的混合物中具有等 量的D和L-丙氨酸。 0033 如本发明所用的微生物是具有高L-异构体降解活性的菌株。 优选， 所述微生物是 指能够降解L-丙氨酸， 而对D-丙氨酸不降解的菌株。 本发明所述微生物可使用现有技术中 已知的任何菌株， 也可使用通过已知技术获得的具有本发明所述功能的任何菌株。 作为获 取本发明所述菌株的已知方法包括： 0034 在富含有机质的土壤中采集土样的步骤， 所述土样为距离地面5-15cm的土壤； 优 选地， 所述土壤为富含酵母菌的果园、 菜园或野果生长区域； 对所述土样中菌株进行增殖培 养的步骤； 所述土样中的所有菌株进行培养分离的步骤； 从所有菌株中获取目标菌株的

17、步 骤。 所述目标菌株是指对L-丙氨酸降解能力很高的菌株。 0035 在某些实施方案中， 所述微生物为能够分泌氨基酸氧化酶、 L-异构体消旋酶或其 他能够降解L-丙氨酸的酶的菌株。 例如， 所述微生物为假丝酵母、 乳酸发酵短杆菌DCSR-26、 乳酸发酵短杆菌HR5-43、 Bacillus Brevis ATCC 8185、 Ala-D45、 Pseudomaonas striata或 刺孢小银汉霉9980菌株。 0036 本发明中需要保持微生物的活性， 所述活性是指微生物具有增殖、 繁殖或生长的 活力。 优选地， 所述微生物不能为裂解状态。 微生物的裂解降低反应速率。 0037 本发明中控

18、制发酵过程中的pH值是重要的。 随着发酵过程的进行， 发酵液中的pH 值会降低。 发明人发现当pH值低于6.5时， L-丙氨酸的降解变弱， 反应效率降低。 优选地的pH 值低于6.8。 另一方面， 如果pH值高于7.0， 则应时间会延长。 优选地， 控制发酵过程中的pH在 6.5-7.0之间， 更优选6.6-6.8之间。 0038 本发明在反应过程中， 优选当D-丙氨酸的晶体形式占总体积的9以下时结束添 加， 优选当晶体占8以下时结束添加。 例如5时结束添加。 在某些实施方案中， 发酵液中 溶解状态的D-丙氨酸优选为10以上， 优选12以上， 更优选15以上， 最优选16。 0039 本发明中

19、， 利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液调节发酵培养基中发酵液体的pH值， 在利用硝酸水溶液进行发酵液体pH值调节的同时向发酵液体中加入DL-丙氨酸， 使得发酵 液体中发酵底物浓度与发酵液体的pH值相匹配， 在控制发酵液体pH值时， 控制添加DL-丙氨 说明书 3/6 页 5 CN 107365810 A 5 酸的速度和质量， 保持培养基中的菌体密度， 提高D-丙氨酸生产效率。 其中， DL-丙氨酸的质 量占硝酸水溶液和DL-丙氨酸总质量的百分数为40-60， 优选地， DL-丙氨酸的质量占硝酸 水溶液和DL-丙氨酸总质量的百分数为45-55， 例如， DL-丙氨酸的质量占硝酸水溶液和 DL-丙氨

20、酸总质量的百分数为45、 50或55。 且， DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的质量体积 浓度为50-55g/L， 例如， DL-丙氨酸在硝酸水溶液中的质量体积浓度为50g/L、 51g/L、 52g/L、 53g/L、 54g/L或55g/L。 0040 本发明的发酵过程中需要控制L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内。 L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比低于1:4， 则反应速度放缓。 另一方面， 如果高于1:2， 则反应 速度同样下降。 需要说明的是， 当最后一次增加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液后， 随着反应 的进行， 此时L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比可小于1:4， 甚至为0。 00

21、41 本发明中发酵期间DL-丙氨酸的添加总量与起始DL-丙氨酸的质量比为1:0.8至1: 1.2。 优选1:1。 0042 优选地， 在开始发酵培养6小时以上之后， 开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液 至发酵液。 如果时间过短， 例如在开始发酵后第5小时以内添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶 液， 则不利于控制L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在适当的范围内。 如果开始发酵培养后10 小时以上之后， 开始添加含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液， 则L-丙氨酸与D-丙氨酸的 质量比会过低， 不利于反应速度的提升。 优选在开始发酵后第6-10小时之间， 例如7小时、 8 小时、 9小时开始添加含有DL

22、-丙氨酸的硝酸水溶液至发酵液。 0043 本发明的微生物培养条件优选如下所述： 0044 把微生物菌种在斜面上31培养24小时， 接入到消毒好的培养基中， 其中培养基 的成分为15克DL-丙氨酸、 10克玉米浆、 120微克维生素H、 0.8克磷酸二氢钠、 1.2克硫酸镁， 培养基体积定容到1000毫升在摇床上振荡培养61小时， 发酵过程控制底物浓度和pH值， 流 加共计150克的DL-丙氨酸， 然后在发酵液中加入19克的硅藻土、 20.8克的活性炭， 86加热 43分钟， 过滤， 取清液， 真空浓缩， 把发酵清液浓缩到原来的120毫升， 加入98的异丙醇120 毫升， 搅拌在室温条件下使D-

23、丙氨酸结晶28小时， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品55克。 0045 实施例 0046 实施例1 0047 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为30.5 的斜面上培养25小 时， 然后将微生物接种到发酵培养基中， 所述培养基包含： 1.5gDL-丙氨酸、 0.8g玉米浆、 120 g维生素H、 0.9g磷酸二氢钠和0.1g硫酸镁， 且培养基体积定容到100毫升。 0048 在摇床上振荡培养6小时后， 检测L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5， 发酵液的 pH为7.5， 利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓度 和pH值

24、， 控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5- 7.0内； 其中所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为50， 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨 酸的量为2时， 结束添加， 继续反应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基中的 DL-丙氨酸质量共计15g。 0049 向发酵液体中加入硅藻土1.8g、 活性炭2.5g， 在86温度加热32分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15)， 再加入98的异丙醇15毫升， 在室 温条件下搅拌， 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9时， 结束发酵， D-丙氨酸结 说明

25、书 4/6 页 6 CN 107365810 A 6 晶25小时， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品5.3g。 整个发酵过程36小时。 0050 实施例2 0051 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31 的斜面上培养24小时， 然后将微生物接种到发酵培养基中， 所述培养基包含： 15gDL-丙氨酸、 10g玉米浆、 120 g维 生素H、 0.8g磷酸二氢钠和1.2g硫酸镁， 且培养基体积定容到1000毫升。 0052 在摇床上振荡培养6.5小时， 检测L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:4.5， 发酵液 的pH为8时， 利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液

26、控制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓 度和pH值， 控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在 6.5-7.0内； 其中， 所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为45。 当晶体形式的D-丙氨酸占总D- 丙氨酸的量为5时， 结束添加， 继续反应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基 中的DL-丙氨酸质量共计150g。 0053 向发酵液体中加入硅藻土19g、 活性炭20.8g， 在86温度加热43分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到120毫升(发酵液体的12)， 再加入98的异丙醇120毫升， 在 室温条件下搅拌， 当晶体形式的D-丙

27、氨酸占总D-丙氨酸的量为9时， 结束发酵， D-丙氨酸 结晶28小时， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品55g。 整个发酵过程40小时。 0054 实施例3 0055 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31 的斜面上培养26小时， 然后将微生物接种到发酵培养基中， 所述培养基包含： 13gDL-丙氨酸、 10g玉米浆、 150 g维 生素H、 0.68g磷酸二氢钠和1.5g硫酸镁， 且培养基体积定容到1000毫升。 0056 在摇床上振荡培养7小时， L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:6， 且发酵液的pH为 8.5时， 利用含有DL-丙氨酸的硝酸水溶液控

28、制发酵培养基中发酵液体中DL-丙氨酸浓度和 pH值， 控制所述发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5- 7.0内； 其中， 所述硝酸水溶液DL-丙氨酸的浓度为55。 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨 酸的量为8.1时， 结束添加， 继续反应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基中 的DL-丙氨酸质量共计130g。 0057 向发酵液体中加入硅藻土16g、 活性炭2.5g， 在89温度加热40分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到160毫升(发酵液体的16)， 再加入98的异丙醇160毫升， 在 室温条件下搅拌， D-丙氨酸结晶25

29、小时， 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为9 时， 结束发酵， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品58g。 整个发酵过程35小时。 0058 对比例1 0059 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为30 的斜面上培养28小时， 然后将微生物接种到100毫升发酵培养基中， 所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为15以 外与实施例1中的培养基相同。 0060 在摇床上振荡培养48小时， 在发酵过程中利用硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵 液体中的pH值在6.5-7.0内。 继续反应直至L-丙氨酸为0。 0061 向发酵液体中加入硅藻土1.8g、 活性炭2.5g，

30、 在86温度加热32分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15)， 再加入98的异丙醇15毫升， 在室 温条件下搅拌， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品。 整个发酵过程65小时。 0062 对比例2 说明书 5/6 页 7 CN 107365810 A 7 0063 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31 的斜面上培养24小时， 然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中， 所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为15 以外与实施例2中的培养基相同。 0064 在摇床上振荡培养5小时， 检测发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量

31、比为1:1.5， 发酵液的pH6.8， 利用含有50DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中发酵液体中的pH 值在6.5-6.8内。 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸的量为12.2时， 结束添加， 继续反 应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基中的DL-丙氨酸质量共计25g。 0065 向发酵液体中加入硅藻土1.8g、 活性炭2.5g， 在86温度加热32分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15)， 再加入98的异丙醇15毫升， 在室 温条件下搅拌， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品。 整个发酵过程70小时。 0066 对比例3 0067 把微

32、生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31 的斜面上培养24小时， 然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中， 所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为13 以外与实施例3中的培养基相同。 0068 在摇床上振荡培养12小时， 检测发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5， 发 酵液的pH7.6， 利用含有50DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中L-丙氨酸与D-丙氨 酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内。 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸 的量为2.3时， 结束添加， 继续反应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基中的

33、 DL-丙氨酸质量共计15g。 0069 向发酵液体中加入硅藻土1.8g、 活性炭2.5g， 在86温度加热32分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15)， 再加入98的异丙醇15毫升， 在室 温条件下搅拌， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品。 整个发酵过程45小时。 0070 对比例4 0071 把微生物菌种(Bacillus Brevis ATCC 8185)在斜率为31 的斜面上培养24小时， 然后将微生物接种到1000毫升发酵培养基中， 所述培养基除了DL-丙氨酸的含量变为13 以外与实施例3中的培养基相同。 0072 在摇床上振荡培养12小时， 检测

34、发酵液中L-丙氨酸与D-丙氨酸的质量比为1:5， 发 酵液的pH7.6， 利用含有50DL-丙氨酸的硝酸水溶液控制发酵培养基中L-丙氨酸与D-丙氨 酸的质量比在1:4至1:2范围内和pH值在6.5-7.0内。 当晶体形式的D-丙氨酸占总D-丙氨酸 的量为10时， 结束添加， 继续反应直至L-丙氨酸为0。 伴随着硝酸水溶液加入培养基中的 DL-丙氨酸质量共计118g。 0073 向发酵液体中加入硅藻土1.8g、 活性炭2.5g， 在86温度加热32分钟， 过滤， 取清 液， 真空浓缩， 把清液浓缩到15毫升(发酵液体的15)， 再加入98的异丙醇15毫升， 在室 温条件下搅拌， 离心、 烘干得到D-丙氨酸成品。 整个发酵过程69小时。 0074 在不背离本发明的范围或精神的情况下， 可对本发明说明书的具体实施方式做多 种改进和变化， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 由本发明的说明书得到的其他实 施方式对技术人员而言是显而易见得的。 本申请说明书和实施例仅是示例性的。 说明书 6/6 页 8 CN 107365810 A 8