技术领域
本发明涉及一种固定化木瓜蛋白酶的方法，包括了用于固定化木瓜蛋白酶固定化载体的合成方法，具体为聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性树脂载体(PAN-GA)的合成方法。
背景技术
随着高分子材料科学的不断发展，近几年来，聚合物改性材料越来越受到人们的重视。聚合物改性就是通过物理、化学或机械的方法来克服聚合物材料固有缺陷、提高材料性能、降低材料成本、赋予材料新功能等的一种简单易行的方法。与其它载体相比，具有特殊功能的改性载体拥有巨大发展潜力，广泛应用于各个领域而利用聚合物改性材料来进行酶的固定化，也是固定化酶载体发展的一个趋势。
大孔交联树脂微球作为固定化酶载体具有比强度高、相对密度低、比表面积大等特征，使其在固定化酶中表现出了独特的优越性。例如，有人选用聚苯乙烯系大孔树脂作为酶固定化载体，通过接枝改性的方法来改善载体的亲水性，用来固定化酶，但这类材料在合成过程中使用了氯甲醚，且在改性过程中有氯化氢生成，不仅原子利用率不高，对环境也不友好。
专利201310182565.1公开了《一种聚丙烯腈固定化酶的制备方法》，通过静电纺丝法制备聚丙烯腈纳米纤维膜，用于固定化酶。这种方法做出的纤维强度低，寿命短，产量低，纤维结构也不好，在微观环境还要控制相互排斥的射流，过程比较复杂、条件难以控制。
袁春桃在《壳聚糖与丙烯腈接枝共聚物的制备以及国定化酶的研究》中，采用接枝共聚法合成了一种壳聚糖-g-丙烯腈载体用于酶的固定化。此种方法合成的聚合物接枝率较低、副反应多，由于引发剂的使用是所得产物易降解、稳定性差、熔点低、机械强度低等缺点，而且后续处理繁琐，因此使其应用受到一定的限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种固定化木瓜蛋白酶的方法。本发明所采用的用于固定化木瓜蛋白酶的载体(PAN-GA)，能克服现有技术所合成的载体在酶固定化过程中，由于刚性碰撞造成的酶活力损失。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：
1)、称取0.1mg聚丙烯腈树脂(PAN)，加入100～300ml的反应溶剂，浸泡溶胀10～14h后；加入0.65～0.7g(较佳为0.68g)的氨基葡萄糖盐酸盐(GA)和0.85～0.9g(较佳为0.88g)粉末状的K2CO3，在氮气保护下以150～250rpm的搅拌速度先搅拌1～3h；然后升温至90～110℃(较佳为100℃)，继续在氮气保护下磁力搅拌反应11～13h；反应结束后，过滤，收集滤渣；
2)、将步骤1)所得的滤渣先用无水乙醇浸泡洗涤至洗涤液为无色，然后依次进行酸洗和水洗；然后于45～55℃(较佳为50℃)真空干燥至恒重，得PAN-GA载体；
3)、称取10mg的PAN-GA载体，加入浓度为2.5～3.5mg/mL(较佳为3mg/mL)的Nal04溶液2.8～3.2mL(较佳为3mL)，避光氧化28～32min(较佳为30min)，然后用无水乙醇和水依次洗涤后(备注说明：洗涤次数一般为3-4次，每次，无水乙醇的用量为30ml，去离子水的用量为50ml)；再加入8～12ml(较佳为10mL)的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液(PBS)，然后加入0.18～0.22mg(较佳为0.2mg)木瓜蛋白酶；于20～30℃(较佳为25℃)的固定化温度、转速为100～150rpm下恒温振荡固定3.5～4.5h(较佳为4h)后，过滤分离(可收集滤液)；
所得滤饼用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液(PBS)进行反复冲洗(一般冲洗8～10次)后，于36～38℃的真空干燥器内干燥4.5～5.5h(较佳为于37℃干燥5h)，得固定化木瓜蛋白酶。
作为本发明的固定化木瓜蛋白酶的方法的改进：所述步骤1)中的反应溶剂为乙二醇(ED)。
作为本发明的固定化木瓜蛋白酶的方法的进一步改进：所述pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液为0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)。
作为本发明的固定化木瓜蛋白酶的方法的进一步改进：所述Nal04溶液以pH＝4.0，0.1mol/L的HAc-NaAc缓冲液作为溶剂进行配制。
作为本发明的固定化木瓜蛋白酶的方法的进一步改进：步骤2)中的依次进行酸洗和水洗具体为：用1mol/L的盐酸溶液(用量约为20mL)浸泡2～4小时，然后用去离子水洗涤至洗涤液为中性。
在本发明中，没有明确告知温度的，均是指在常规(20～30℃)下进行。
在本发明中：
聚丙烯腈树脂(PAN，亦名聚丙烯腈树脂微球、聚丙烯腈微球等)选用D－160型大孔吸附树脂，交联度7％DVB，含氮量22.18％，功能基含量：15.83CN mmol/g；例如可购自中蓝晨光化工研究院。
本发明选用具有比表面积大，机械强度高、稳定性好、价格低、易制备、易分离的大孔交联聚丙烯腈树脂微球作为固定化酶改性载体，相比其他载体具有更强的优越性。而且聚丙烯腈分子表面含有大量活泼的氰基，容易进行化学改性，使其带有特殊的官能团，可为酶的固定化提供有效的结合位点和一个简单、温和的固定化过程。
糖基化的表面可以有效吸附特异性蛋白，这是公认的“糖苷的影响”。有鉴于此，本发明运用配位场理论和量子化学计算方法，选取聚丙烯腈为母体，与含有糖基的氨基葡萄糖物质进行表面化学改性，改善其表面的亲水性和生物相容性，进而制备出新型的糖基化聚丙烯腈树脂载体用于木瓜蛋白酶的固定化，可望实现“集簇效应”。
本发明制备的酶固定化载体具有介孔直径大小的空隙，能够提供较大的外表面积及改性后表面含有较多糖基等特点，因此有利于利于木瓜蛋白酶等大分子物质的吸附，与传统的生物处理技术相比，该技术投资少、效率高、成本低，具有显著的经济效益和社会效益，有望在酶固定化技术等领域推广使用，具有重要的理论价值和良好的应用前景。
具体而言：
本发明，选用氨基葡萄糖盐酸盐(GA)作为功能基，经过化学改性引入到大孔树脂聚丙烯腈母体上，从而制得了新型柔性树脂载体(PAN-GA)，在载体表面构建柔性功能基修饰层，可为固定化酶提供有效的结合位点和一个简单、温和的固定化过程。
本发明探讨了反应溶剂、反应温度、反应物质量比和反应时间对树脂增重率的影响，并确定了合成反应的最佳工艺条件。运用元素分析方法、红外分析和热重分析对合成的柔性树脂载体结构进行了表征，推断柔性功能基团以加成反应的形式接枝到聚丙烯腈微球上。
运用红外技术方法，对合成的聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性树脂载体(PAN-GA)进行结构鉴定，探讨反应路径及树脂结构，包括如下步骤：
①取少量聚丙烯腈微球与KBr混合，研磨、压片，在NICOLET-380红外光谱仪上测定其红外光谱，光谱范围4000cm-1～400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。
②按照上述步骤①中的方法分别测定载体(PAN-GA)和配体氨基葡糖糖盐酸盐的红外光谱。
③通过对聚丙烯腈微球、配体以及合成后的载体(PAN-GA)的红外图谱的对比分析，推测出树脂合成反应的可能反应路径及树脂结构。
运用热重分析(TGA)对上述合成的载体(PAN-GA)进行结构鉴定，并进一步说明了柔性功能基的成功引入。
具体如下：
准确称取充分干燥后的上述载体(PAN-GA)样品分别为6.0～8.0mg，使用梅特勒TGA/DSC1型同步热分析仪进行热重分析。
分析条件：载气：氮气；载气流量：20mL/min；升温程序：20℃/min，起止温度：50℃～1000℃。
采用本发明方法制备而得的柔性载体(PAN-GA)增重的计算公式如下所示：
式中：△G－反应后载体(PAN-GA)的增重率/％；
W0－为反应前聚丙烯腈树脂(PAN)的质量/g；
W1－为反应后载体(PAN-GA)的质量/g。
将本发明步骤2)制备而得的载体(PAN-GA)，按照步骤3)所述方法进行木瓜蛋白酶的固定。
取一定量的酶溶液、滤液和水洗液，分别加入到含有4mL的2％的酪蛋白溶液和1mL0.1mol/L PBS缓冲液(pH＝7.0，5mmol/L的L-Cys和1mmol/L EDTA)试管中，在37℃水浴中反应30min，然后立即加入5mL10％的三氯乙酸(TCA)终止反应，然后将反应物混合均匀后于水浴中静置10min过滤，滤液在275nm处测定吸光值。空白对照组则在加入酶之前，先加5mL10％TCA，其余步骤相同。
酶活力测定方法：
酶活力单位定义为在测定条件下(温度37℃，pH7.2)，每分钟催化酪蛋白水解生成l ug酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。
固定化酶的活力回收率是指固定化酶总活力与固定化过程加入溶液酶总活力之比，以百分数表示。
固定化酶或游离酶的相对活力(％)：指在同组试验中以活力最高的为100，与其余的固定化酶或溶液酶的活力之比，通常以百分数表示。
固定化酶或游离酶的剩余酶活力(％)：指在同组实验中以未处理前的固定化酶或溶液酶的活力为100，与处理以后(包括热、酸、碱、试剂、固定化、冷藏等)所显示的活力之比，以百分数表示。
采用本发明方法制备而得的载体(PAN-GA)具有如下技术优势：
1、本发明运用元素分析方法和红外光谱技术对合成的柔性树脂载体结构进行了表征，结果表明柔性功能基团中氨基与聚丙烯腈母体中氰基发生核加成反应而接枝到聚丙烯腈母体上，该反应原子利用率高(原料中的原子尽可能多地转化到产品中)；不向或少向环境中排放有毒有害的副产物，较好的体现了绿色化学的特征，具有明显的经济效益和环境效益。
2、通过对聚丙烯腈微球、柔性功能基以及合成后载体(PAN-GA)的TGA曲线分析，得到了载体热稳定性的变化情况。结果表明：载体在325℃和400℃才开始分解，机械强度高，具有较高的热稳定性。
3、本发明以亲水性氨基葡萄糖功能基为柔性链，利用化学接枝法将聚丙烯腈树脂微球进行改性，亲水柔性链的成功引入使其在酶的固定化过程中可以有效维持酶蛋白的正常构象，减少酶的失活。所得的固定化酶活力回收率高达80.6％，是采用未改性聚丙烯腈树脂微球的固定化水平的21.9倍。
4、采用本发明制得的聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性树脂载体(PAN-GA)固定化木瓜蛋白酶的热稳定性、贮藏稳定性都明显高于游离酶。说明运用本发明方法制得的载体(PAN-GA)作为酶的固定化载体为木瓜蛋白酶提供了一种友好的微环境，能够较好的保持酶蛋白分子的生物活性及催化活性，具有一定的应用价值。
5、采用本发明方法制得的载体(PAN-GA)，用于固定化木瓜蛋白酶，其制备工艺简单、操作简便、反应条件温和、原料易得、成本低，不需要特殊设备，常规工艺就可以进行。
6、本发明制备所得的固定化木瓜蛋白酶具有较高的热稳定性、贮藏稳定性、有机溶剂耐受性和重复稳定性，具有一定的实际应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为PAN、GA和PAN-GA的红外光谱图；
图2为PAN-GA树脂合成路线图；
图3为PAN、GA和PAN-GA的热重曲线图；
图4为木瓜蛋白酶在载体PAN-GA上的固定化过程；
图5为温度对固定化酶和游离酶相对活力的影响；
图6固定化酶的重复使用性能；
图7固定化酶和游离酶的存储稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描绘本发明，但本发明的内容并不限于此。
备注：以下实施例中的水洗均为用去离子水进行洗涤。
实施例1、一种用于固定化木瓜蛋白酶的载体的合成方法，以聚丙烯腈树脂(PAN)为母体，氨基葡萄糖盐酸盐(GA)为配体，对聚丙烯腈微球进行化学接枝，具体为依次进行以下步骤：
①、准确称取0.1mg聚丙烯腈树脂(PAN)，移入100mL的三颈瓶中，再加入100ml的溶剂---乙二醇(ED)，浸泡溶胀12h后，加入0.68g的氨基葡萄糖盐酸盐(GA)和0.88g K2CO3粉末，在氮气保护下以200rpm的搅拌速度先在常温下搅拌2h；然后迅速升温至100℃，磁力搅拌反应12h；反应结束后，过滤，收集滤渣。
②、将步骤①收集的滤渣先用无水乙醇浸泡洗涤至洗涤液为无色，然后先酸洗(即用20mL、1mol/L的盐酸溶液浸泡3小时)，再用水洗涤直至洗涤液为中性，于50℃条件下真空干燥至恒重，得聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性树脂载体(PAN-GA)，备用。
实验1、运用红外技术方法，对上述合成的聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性树脂载体(PAN-GA)进行结构鉴定，探讨其反应路径及树脂结构。具体步骤如下：
①取少量聚丙烯腈微球与KBr混合，研磨、压片，在NICOLET-380红外光谱仪上测定其红外光谱，光谱范围4000cm-1～400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。
②按照上述步骤①中的方法分别测定新型载体(即PAN-GA)和配体氨基葡萄糖盐酸盐(GA)的红外光谱。
③通过对聚丙烯腈微球、配体以及合成后新型载体(即PAN-GA)的红外图谱(见图1)的对比分析，推测出树脂合成反应的反应路径及树脂结构(见图2)。
图1是PAN、GA和PAN-GA的红外光谱图。由图1分析可知，在3500～3000cm-1范围内GA出现了3344cm-1、3292cm-1、3097cm-1、3039cm-1四个分裂较明显的强吸收峰,这是因为GA分子中存在多个羟基,它们属于氨基葡萄糖分子中的羟基(－OH)和氨基(－NH2)的伸缩振动吸收峰。而对比PAN-GA光谱，反应后此范围内的峰型变为了宽峰，说明氨基葡萄糖分子中的氨基发生了反应。在1700～1500cm-1范围内，GA分子有1619cm-1和1584cm-1、1539cm-1三个吸收峰，它们分别是NH2和N-H的变角振动吸收峰。而在反应后，在1627cm-1和1580cm-1附近出现了一对宽峰，说明－NH2参与了反应。同时反应后聚丙烯腈中的特征吸收峰(C≡N)的明显减弱，以及1539cm-1峰的消失和1121cm-1、1062cm-1(氨基葡萄糖分子中C-O-H的仲羟基和伯羟基吸收峰)，896cm-1(糖环吸收峰)的出现，都可以证明氨基葡萄糖分子已经接枝到聚丙烯腈母体上了。
推测PAN-GA载体的合成路径如图2所示。
实验2、运用热重分析(TGA)对上述合成的新型载体(即PAN-GA)进行结构鉴定，并进一步说明了柔性功能基的成功引入。实验条件为：N2为保护气体，温度由25℃升至1000℃，升温速度为20℃/min。实验结果如图3所示。
实施例2、将实施例1所得的PAN-GA载体进行木瓜蛋白酶固定化，具体如下：
称取10mg的PAN-GA载体，加入浓度为3mg/mL的Nal04溶液(pH＝4.0，0.1mol/L的HAc-NaAc缓冲液配制)3.00mL，避光氧化30min，用无水乙醇和水依次洗涤3-4次(每次，无水乙醇的用量为30ml，去离子水的用量为50ml)；再加入10mL的0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)，然后加入0.2mg的木瓜蛋白酶，在固定化温度为25℃，转速为100rpm下，恒温振荡固定4h后，过滤，收集滤液，并分离出滤饼(为制得的固定化木瓜蛋白酶)，所得滤饼用0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)进行反复冲洗8～10次后，37℃条件下放入真空干燥器干燥5h后，得固定化木瓜蛋白酶，酶固定化过程见图4。测得其酶固定率为67.9％。
对比例1、将实施例1步骤①中的氨基葡萄糖盐酸盐(GA)分别改成N-乙酰氨基葡萄糖、壳聚糖，其余等同于实施例1。所得的载体称为载体A、载体B。按照上述实施例2所述的方法用于木瓜蛋白酶的固定化实验，其与实施例1所得的载体PAN-GA的对比数据如表1所示：
表1、不同配体合成的载体对酶固定率的影响
对比例2、将实施例1中的步骤①中的反应溶剂由乙二醇(ED分别)改成N,N一二甲基甲酰胺(DMF)、甲苯(Toluol)、l,4-二氧六环(Dioxane)、二甲亚砜(DMSO)，其余等同于实施例1。
对上述所得的4种载体以及实施例1所得的载体PAN-GA测定其增重率和酶固定化率，探讨不同溶剂对合成载体的增重率和酶固定率影响实验。结果如下表2所示：
表2、反应溶剂对合成载体的增重率和酶固定率的影响
溶剂 树脂增重率△W(％) 酶固定率(％) 甲苯(Toluol) 14.8 17.1 l,4-二氧六环(Dioxane) 9.7 12.9 二甲亚砜(DMSO) 23.5 36.4 N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 19.1 29.4 乙二醇(ED)(本发明) 41.7 67.9
从表2的结果可以看出，树脂PAN-GA分别在溶剂ED中增重率和酶固定率最高，其值分别为35.9％和67.9％，原因在于溶剂对基质的充分溶胀性，也由此表明了反应溶剂是影响树脂合成的重要因素之一。所以本发明选定PAN-GA树脂载体的最佳反应溶剂为乙二醇(ED)。
对比例3、将实施例1中的步骤①中的反应温度由100℃分别改成60℃，80℃，120℃，140℃，其余等同于实施例1。
对上述所得的4种载体以及实施例1所得的载体PAN-GA测定其增重率和酶固定化率，探讨不同温度对合成载体的增重率和酶固定率影响实验。结果如下表3所示：
表3、反应温度对合成树脂增重率和酶固定率的影响
反应温度 树脂增重率△W(％) 酶固定率％ 60℃ 8.5 19.1 80℃ 13.4 29.9 100℃(本发明) 41.7 67.9 120℃ 31.1 41.9 140℃ 27.2 31.7
在其他条件不变的情况下，通过改变反应温度，探讨不同的温度对合成树脂増重率和酶国定率的影响。从表3中可以看出，在试验温度范围内，当温度为100℃时，树脂PAN-GA的增重率达到最大，此时的酶固定率也达到最大。这是因为温度太低，不利于功能基的进攻，使反应难以进行完全；随着温度的升高，化合物在有机溶剂中的溶解度增大，反应物活性增加，反应速率加快，增重率也增大；但温度过高，合成反应易发生副反应，所以温度超过100℃时会导致其增重率的下降，而继续升温会导致溶剂挥发而损失，不利于树脂的合成，同时考虑到当反应温度过高，树脂的高分子骨架容易遭到损坏，所以试验选择最高温度为100℃。我们综合实验条件及合成效率的考虑，确定PAN-GA树脂的最佳合成温度为100℃。
对比例4、将实施例1中步骤①中中的反应物用量GA(g):K2CO3(g)由0.68:0.88分别改为0.17:0.22、0.34:0.44、1.02:1.32、1.36:1.76，其余等于同实施例1。
对上述所得的4种载体以及实施例1所得的载体PAN-GA测定其增重率和酶固定化率，探讨不同反应物用量对合成载体的增重率和酶固定化率影响实验。结果如下表4所示：
表4、GA和K2CO3用量对树脂PAN-GA增重率和酶固定率的影响
GA(g):K2CO3(g) 树脂增重率△W(％) 酶固定率％ 0.17:0.22 21.6 23.6 0.34:0.44 31.4 36.8 0.68:0.88(本发明) 41.7 67.9 1.02:1.32 38.1 41.2 1.36:1.76 34.9 39.2
对于一定量的树脂微球而言，随着反应物浓度的增加，树脂增重率也增加，而当反应物浓度增加到一定时，其增重率有所降低，主要是因为此反应体系属于非均相体系，转化率不仅受到反应物浓度的影响，还受到空间位阻效应的影响。所以当加入的反应物的量较少时，反应物与聚丙烯腈充分反应，增重较明显；而当树脂表面的结合位点达到饱和时，再增加反应物用量也不能过多地使其结合上去，反而由于反应物浓度过大，紧密聚集在一起不利于扩散，阻碍反应进行。所以当0.10g聚丙烯腈微球时，氨基葡萄糖(GA)和碳酸钾(K2CO3)的最佳加入量分别为0.68g和0.88g。
试验1：固定化酶和游离酶(实施例2所得的固定化木瓜蛋白酶和常规的木瓜蛋白酶)的最佳反应温度：
对应取适量10mg的固定化酶和游离酶，分别在不同的酶催化反应温度(30℃～80℃)范围内，按照酶活力测定方法测定相应的酶活。
对环境温度敏感也是酶的特点之一。温度不仅会影响酶催化反应的速率，也能影响酶的稳定性，使酶蛋白分子变性，而且还能影响酶分子的空间结构和酶的催化效应，在这几种因素综合影响下产生了一个最适反应温度。
由图5可以看出，游离酶的最适温度为50℃，且曲线走向趋势较为陡峭，说明游离酶的催化反应受温度影响较大，而经固定化后，最适温度提高了10℃，且在50℃～80℃范围内都保持了较高的酶活，最适温度范围变宽，可能因为木瓜蛋白酶经载体固定化后得到了一种更加稳定的结构，使得变性速度受环境温度的影响减小。酶固定化后最适反应温度的上升，是由于酶分子与载体之间存在的多点连接，稳定了酶的构象，防止了酶因受热发生肽链折叠伸展变形，导致酶活性的下降。酶最适温度的提高，不仅提高了酶催化效率，还使酶催化反应能够在较高温度的环境下进行，在加工和实际应用中具有重要意义。
试验2：固定化酶和游离酶的热稳定性
对应取适量10mg的固定化酶和游离酶，在环境温度为25℃、35℃、55℃、65℃中保温处理不同时间(30min、60min、90min、120min、150min、180min)，然后迅速用冰水降温至4℃，然后按照酶活力测定方法，在37℃下测定相应的酶活(参照本发明中所述的酶活力测定方法)。
酶的稳定性是指酶活性在一定环境条件，比如时间、温度、有机溶剂、机械作用等因素影响下保持活力的能力。
实验结果得出：游离酶和固定化酶在低温25℃和35℃处理下均能保持较高的稳定性，当温度提高为55℃时，随着保温时间的延长，酶活力均呈现明显的下降趋势，在180min时游离酶和固定化酶残留活力为40％和69％。当温度为65℃时，保温60min后，固定化木瓜蛋白酶的残留活性约为85％，而游离酶只有57％；保温180min后，固定化酶的残留活力还剩57％左右，而此时游离酶的活力只剩21％。可能由于木瓜蛋白酶与树脂载体结合后，酶活性中心部位和酶分子的空间构象的微环境发生了某些改变，抗热变性能增强。由此可见，固定后的木瓜蛋白酶比游离木瓜蛋白酶的具有更高的热稳定性。这对酶在实际应用中具有重要的意义。
试验3：固定化木瓜蛋白酶和游离木瓜蛋白酶的有机溶剂稳定性
对应取适量10mg的固定化酶和游离酶，分别加入浓度为10％和90％(V/V)的乙腈、乙醇和DMF有机试剂混合液5ml中，常温下放置处理1h，然后按照酶活力测定方法，在37℃下测定相应的酶活(参照本发明中所述的酶活力测定方法)。
备注说明：上述有机试剂混合液是用0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液进行配制的。
表5、有机试剂对固定化酶和游离酶的影响
从表5中的数据很明显可以看出，游离酶经不同浓度的3种有机溶剂处理后，酶活力均有较大的损失，表现出了较差的稳定性。而且浓度越高酶活力损失越严重。而木瓜蛋白酶经固定化后，无论是在高浓度和低浓度的有机溶剂下进行处理后，均表现了较高的剩余酶活，稳定性明显高于游离酶。有机试剂影响酶的活性和稳定性主要是因为：一方面，有机试剂可以直接和酶作用，破坏酶的空间构象，从而影响酶的活性中心和稳定性；另一方面，有机试剂可通过与产物或底物的直接作用而影响酶的活性。而酶经载体固定后，载体对酶具有一定的保护作用，使得有机容剂与酶无法直接接触，而且酶与载体结合后，使得酶的空间结构更加稳定，不易被破坏，稳定性得到了提高。
试验4：固定化酶和游离酶的重复稳定性
分别取适量10mg的固定化酶，加入2.00mL2％(质量％)酪蛋白溶液，37℃反应30min，过滤分离固定化酶，用PBS缓冲液(0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液)洗涤。在相同条件下重复以上步骤并测定相应的酶活，得重复反应8次的固定化酶。
图6表示了固定化酶的循环使用次数和相对活力之间的关系。由图6可知固定化酶在经过5次的重复使用后，活性可保留80％以上，使用8次以后，活性保留仍然在60％以上。可能是因为一些酶分子靠吸附作用与载体结合得不够紧密，加之部分酶在使用时脱落，并且在回收过程中，酶也有不同程度的损失，所以导致了酶的部分失活。相对于游离酶不能重复使用而言，固定化酶能够进行多次重复使用，明显提高了酶的使用效率，降低成本。良好的重复使用性能，不仅可以有效地降低成本，也使连续催化反应工艺设计成为可能，具有实际应用价值。
试验5：分别将固定化酶和游离酶在4℃pH7.0的PBS缓冲液中保存若干天，然后按照酶活力测定方法，于不同的时间间隔内测定相应的酶活。
从图7可以看出，固定于载体上的木瓜蛋白酶与游离酶相比表现出了较高的存储稳定性，在相同保存条件下(4℃)放置7d，游离酶随着保存时间的延长，酶活力下降很快，保存效果不好，其剩余活力仅剩下17％，而两种固定化酶在在缓冲液中保存7d后，其剩余活力均在80％以上，表现出了较好的贮藏稳定性。
上述试验说明了运用本发明方法制得聚丙烯腈-氨基葡萄糖柔性载体(PAN-GA)作为酶的固定化载体为木瓜蛋白酶提供了一种友好的微环境，能够较好的保持酶蛋白分子的生物活性及催化活性，具有一定的应用价值。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。