技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及利用实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型的试剂盒。
背景技术
EB病毒(Epstein—Barr virus，EBV)又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 4(HHV-4))，属于γ疱疹病毒科。不仅人群普遍易感，而且一旦感染很难清除。EB病毒在器官移植患者等免疫功能不全的人群中，常引起威胁生命的严重疾病，甚至导致患者死亡。多个研究也表明EB病毒与多种恶性肿瘤相关，如恶性淋巴瘤、胃癌等。此外，EB病毒感染还会引起儿童的噬血细胞综合征等恶性血液疾病。因此快速准确诊断EB病毒感染至关重要。
EBV为双链DNA病毒，其基因组全长约180kb,共编码90多个基因，如EBNAl、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C等基因。由于不同来源的EBV毒株存在基因变异和生物学功能的差异，因此不同分型的EBV变异毒株和EBV相关疾病的相互关系一直是倍受关注的热点问题。有研究已发现了多种EBV变异型，包括1/2分型(根据EBNA2和EBNA3基因的连锁多态性，EBV可分为1、2两型)、F/f分型(BamHI F片段缺乏或出现)、C/D分型(BamHI Wl/11片段交界处丢失或保留)。同时，也有研究表明不同分型的EBV临床株具有地域差异性。其中，C/D基因分型呈现地域分布，亚洲以C型多见，而其它地区则以D型多见。多个研究也表明D型变异与EBVaGC密切相关。而一直以来，EBV基因分型的分析多通过限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和测序分析来进行。1992年Apolioni等最先根据BamH1位点的缺失情况提出PCR加酶切的方法鉴定EBV临床株C/D分型，此方法一直被沿用至今。但此方法过于繁琐，且灵敏度较低，不利于临床标本的快速灵敏分型。由此可见，快速灵敏地诊断EB病毒C/D基因分型也是非常重要的。
众所周知，EB病毒分离培养较为困难，目前临床诊断EB病毒的常用方法包括血清学方法和PCR方法。而血清学方法检测不仅费时，而且操作复杂。近几年兴起的荧光PCR技术具有准确性高，重复性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测及基因分型等医学研究领域中。该方法完全闭管检测，避免了交叉污染，且结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，加强了结果的可靠性。多种Taqman荧光探针的应用及荧光定量PCR仪的发展，使利用多通道荧光定量PCR仪进行实时EB病毒基因分型的检测及鉴别成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒，是一种双探针实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒，由定量PCR反应液、C型标准品、D型标准品、阳性对照品、阴性对照品、病毒DNA抽提裂解液、操作说明书、盒体、盒盖组成，定量PCR反应液含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、EB病毒C/D基因通用上游引物，EB病毒C/D基因通用下游游引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶。盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、C型标准品管、D型标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管、病毒DNA抽提裂解液管，PCR反应液由单管分装，矩阵排列，其中：
上游引物序列为:5’-ATACTCCCGCCATGCGACT-3’，
下游引物序列为：5’-CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3’
C型探针为：5’FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3’
D型探针为：5’VIC-CCTGCGGATCCCGATG-MGB 3’。
C型标准品序列为：
atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cccgctttcg gcgcccctgc ggaccccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga D型标准品序列为：
atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cctgctttcg gcgcccctgc ggatcccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga其中病毒DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5％SDS。
阳性对照品为EB病毒Raji株和临床株的灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水。
本发明提供的定量试剂盒保存在-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一个目的是提供的双探针实时荧光PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒在鉴别EB病毒C/D基因分型中的应用。
本发明试剂盒是将Taqman探针引入到EB的C/D基因分型中，在C/D基因两端的保守区设计引物，在C/D基因的分型位置设计两种探针，一种探针识别C分型的序列，另一种探针识别D分型。在一个反应管中，利用荧光定量PCR技术快速鉴定EB的C/D基因分型。通过对C型临床株，D型标准株Raji株及中国地区EB临床株的C/D基因的序列进行分析，我们在C型和D型共同的两端保守区内设计了一对PCR的引物序列为：F 5’-ATACTCCCGCCATGCGACT-3’，R5’-CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3’。在C型临床株的保守区而与D型不同的区域设计探针用于识别C型基因型的EB病毒，其序列为5’FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3’，其5’端用荧光基团FAM标记，3’端用猝灭基团MGB标记。在D型标准株及临床株的保守区而与C型不同的区域设计探针用于识别C型基因型的EB病毒，其序列为5’VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3’，其5’端用荧光基团VIC标记，3’端用猝灭基团MGB标记。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为1×102-1×109拷贝/ml。
(1)EB病毒DNA提取：取EB病毒感染患者的50μL血浆或血清于EP管中，加入50μL病毒DNA抽提裂解液,置于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μl上清作为PCR模板。
(2)扩增检测：在双色或以上的荧光定量PCR仪上进行，PCR体系共50μL，其中PCR定量反应液45μL，检测样品(提取产物，标准品，阳性对照，阴性对照)5μL。具体反应程序为94℃2min；循环中94℃15s，60℃45s，循环中的最后一步分别采集FAM通道荧光和VIC通道荧光，共循环40次。
(3)荧光定量结果分析：
a.双探针CT值均等于40，则为EB阴性标本；
b.C探针或D探针其中之一CT≤35，判定为相应的C/D分型；
c.C探针和D探针CT值均≤35，则判定为混合分型；
d.CT值在35和40之间的，重做之后大于37的为阴性。
根据所获得的标准曲线，计算各待测样本的EB病毒的滴度(拷贝数/ml)。
本发明运用实时荧光定量PCR技术，采用EB病毒通用引物和C型和D型双特异荧光探针，开发研制出用于EB病毒C/D基因型分型的检测试剂盒。并通过对临床上的EB病毒感染患儿的血清标本进行检测分型，旨在为临床上的EB病毒进行快速准确的C/D基因型分型的鉴定，同时为临床上不同C/D基因分型的EB病毒感染和疾病发生发展的关系提供实验手段及实验依据。本发明利用荧光定量PCR技术，设计了C/D基因型分型的特异探针，比传统的巢式PCR结合酶切鉴定的方法更加简便，快速和准确。为临床上EB病毒C/D分型的鉴定提供可靠的实验手段。
附图说明
图1是试剂盒结构示意图。
图2是标本检测结果图。
图3是标本分型后产物的测序图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步说明。应该理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制该发明的范围。
实施例1
参见图1,一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒，由定量PCR反应液(1)、C型标准品(2)、D型标准品(3)、阳性对照品(4)、阴性对照品(5)、病毒DNA抽提裂解液(6)、操作说明书(7)、盒体组成(8)、盒盖(9)构成。盒体(8)设有容器孔，分别放置PCR反应液(1)、C型标准品(2)、D型标准品(3)、阳性对照品(4)、阴性对照品(5)、病毒DNA抽提裂解液(6)，PCR反应液(1)由单管分装，矩阵排列，其中定量PCR反应液(1)含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、EB病毒C/D基因基因通用上游引物、EB病毒C/D基因基因通用下游引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中：
上游引物序列为:5’-ATACTCCCGCCATGCGACT-3’，
下游引物序列为：5’-CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3’
C型探针为：5’FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3’，
D型探针为：5’VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3’。
C型标准品序列为：
atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cccgctttcg gcgcccctgc ggaccccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga D型标准品序列为：
atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cctgctttcg gcgcccctgc ggatcccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga
病毒DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5％SDS。
阳性对照品为EB病毒临床株和Raji株的灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水。本发明提供的定量试剂保存在-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2双探针实时荧光定量PCR法检测C型临床株和D型标准株Raji株
一.材料：临床株(C型)及Raji株(D型)均为本实验室保存。
二.引物和探针的设计与合成
从Genbank中调取临床株及Raji株的C/D的基因序列，应用MegAlign软件分析其基因序列，在C/D分型病毒的保守区设计上下游引物，在两种病毒的不同区域(分型区)设计特异性的探针。
上游引物序列为:5’-ATACTCCCGCCATGCGACT-3’，
下游引物序列为：5’-CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3’
C型探针为：5’FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3’，
D型探针为：5’VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3’。
引物为擎科生物合成，探针为上海优为格生物科技有限公司合成。
三.C/D型EB病毒株DNA的抽提
取标准株病毒上清液50μL于EP管中，加入50μL病毒DNA抽提裂解液置于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μL上清作为PCR模板。
四.C/D型EB病毒株的实时荧光PCR实验
对上述两种临床株及Raji株进行单管C/D分型的荧光PCR检测，结果表明临床株C型探针为阳性，D型探针为阴性。Raji株D型探针为阳性，C型探针为阴性。我们设计的分型探针无任何交叉信号出现，具有很高的特异性。具体CT值参见表1。
表1EB病毒标准株的荧光定量PCR的C/D分型结果
病毒株 C型 D型 临床株 25.16±0.65 40.00±0 Raji株 40.00±0 22.32±0.39
实施例3双探针荧光定量PCR检测临床病毒株C/D分型的应用
一.标本检测：
选取2016年3月1日-8月31日内的EB病毒感染患儿的血液标本88例，及30例未感染EB病毒儿童的血液为对照。每例取EDTA抗凝血液1ml进行C/D双探针分型的实时荧光定量PCR检测。
二.临床标本检测结果：
30例未感染EB病毒儿童的血液标本均未检测到荧光信号，EB病毒感染为阴性。62例EB病毒感染儿童的血液标本均为EB病毒感染阳性，其中为C型EB病毒感染58例，D型EB病毒感染4例。其中临床标本的C/D分型的PCR扩增曲线参照图2。为了进一步验证结果的可靠性，我们随机选取了5例标本扩增后的产物进行了测序，结果证明产物均为对应分型的EB病毒的C/D基因(4例C型EB病毒，1例D型EB病毒)，结果参照图3。双探针实时荧光定量PCR鉴别EB病毒C/D基因分型试剂盒不仅可以快速检测出EB病毒感染的阳性标本，也可以对EB病毒C/D基因进行准确的分型。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 荧光定量PCR测定EB病毒C/D基因分型试剂盒及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> EB病毒C/D基因分型上游通用引物(人工序列Unknown)
<400> 1
atactcccgc catgcgact 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> EB病毒C/D基因分型下游通用引物(人工序列Unknown)
<400> 2
ctgtcacaac ctcactgtca t 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> EB病毒C基因分型探针(人工序列Unknown)
<400> 3
cctgcggacc ccgat 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> EB病毒D基因分型探针(人工序列Unknown)
<400> 4
cctgcggatc ccgat 15
<210> 5
<211> 157
<212> DNA
<213> EB病毒C型标准品(人工序列Unknown)
<400> 5
atactcccgc catgcgactg ctcgccccct cccaggcctc cctggtgagc ccttgccgct 60
ccccgcattc ccgctttcgg cgcccctgcg gaccccgatg acagcaggcc tttccttccc 120
ccgttaatga aaagaatgac agtgaggttg tgacaga 157
<210> 6
<211> 157
<212> DNA
<213> EB病毒D型标准品(人工序列Unknown)
<400> 6
atactcccgc catgcgactg ctcgccccct cccaggcctc cctggtgagc ccttgccgct 60
ccccgcattc ctgctttcgg cgcccctgcg gatcccgatg acagcaggcc tttccttccc 120
ccgttaatga aaagaatgac agtgaggttg tgacaga 157