荧光定量PCR测定EB病毒C/D基因分型试剂盒及应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810174673.7 (22)申请日 2018.03.02 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 李伟尚世强陶然舒强 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 赵杭丽 (51)Int.Cl. C12M 1/00(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 荧光定量PCR测定

2、EB病毒C/D基因分型试剂 盒及应用 (57)摘要 本发明提供一种实时荧光定量PCR检测EB病 毒C/D基因分型试剂盒， 由定量PCR反应液、 C型标 准品、 D型标准品、 阳性对照品、 阴性对照品、 病毒 DNA抽提裂解液、 操作说明书、 盒体、 盒盖组成。 本 发明运用实时荧光定量PCR技术， 采用EB病毒通 用引物和C型和D型双特异荧光探针， 通过对EB病 毒感染患儿的血清标本进行检测分型， 为EB病毒 进行快速准确的C/D基因型分型的鉴定， 同时为 不同C/D基因分型的EB病毒感染和疾病发生发展 的关系提供实验手段及实验依据。 本发明设计合 理， 其特异探针比传统的巢式PCR结合酶切鉴

3、定 的方法更加简便， 快速和准确， 为EB病毒C/D分型 的鉴定提供可靠的实验手段。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 108179097 A 2018.06.19 CN 108179097 A 1.一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， 由定量PCR 反应液(1)、 C型标准品(2)、 D型标准品(3)、 阳性对照品(4)、 阴性对照品(5)、 病毒DNA抽提裂 解液(6)、 操作说明书(7)、 盒体(8)、 盒盖(9)组成， 其中定量PCR反应液(1)含有PCR缓冲液、 Mgcl2、 dNTPs、 EB病毒C/D基因基因通用上游引物

4、、 EB病毒C/D基因基因通用下游引物、 C型荧 光探针、 D型荧光探针、 Taq DNA聚合酶， 上游引物序列为:5 -ATACTCCCGCCATGCGACT-3 ， 下游引物序列为： 5 -CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3 C型荧光探针为： 5 FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3 ， D型荧光探针为： 5 VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3 。 2.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， C型标准品序列为： D型标准品序列为： 3.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/

5、D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， 病毒DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5SDS。 4.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， 阳性对照品为EB病毒临床株和Raji株的灭活DNA样品， 阴性对照品为无菌注射 用水。 5.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， C型荧光探针的5 端用荧光基团FAM标记， 3 端用猝灭基团MGB标记； D型荧光探 针的5 端用荧光基团VIC标记， 3 端用猝灭基团MGB标记。 6.根据权利

6、要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， PCR反应液(1)由单管分装， 矩阵排列。 7.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 其特征在于， 所述试剂保存在-20， 减少反复冻融。 8.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒在 鉴别EB病毒C/D基因分型中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108179097 A 2 荧光定量PCR测定EB病毒C/D基因分型试剂盒及应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及荧光定量PCR检测试剂盒， 具体涉及利

7、用实时荧光 定量PCR检测EB病毒C/D基因分型的试剂盒。 背景技术 0002 EB病毒(EpsteinBarr virus， EBV)又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 4(HHV-4)， 属于疱疹病毒科。 不仅人群普遍易感， 而且一旦感染很难清除。 EB病毒在器官 移植患者等免疫功能不全的人群中， 常引起威胁生命的严重疾病， 甚至导致患者死亡。 多个 研究也表明EB病毒与多种恶性肿瘤相关， 如恶性淋巴瘤、 胃癌等。 此外， EB病毒感染还会引 起儿童的噬血细胞综合征等恶性血液疾病。 因此快速准确诊断EB病毒感染至关重要。 0003 EBV为双链DNA病毒， 其基因组全

8、长约180kb,共编码90多个基因， 如EBNAl、 EBNA2、 EBNA3A、 EBNA3B、 EBNA3C等基因。 由于不同来源的EBV毒株存在基因变异和生物学功能的差 异， 因此不同分型的EBV变异毒株和EBV相关疾病的相互关系一直是倍受关注的热点问题。 有研究已发现了多种EBV变异型， 包括1/2分型(根据EBNA2和EBNA3基因的连锁多态性， EBV 可分为1、 2两型)、 F/f分型(BamHI F片段缺乏或出现)、 C/D分型(BamHI Wl/11片段交界处丢 失或保留)。 同时， 也有研究表明不同分型的EBV临床株具有地域差异性。 其中， C/D基因分型 呈现地域分布，

9、亚洲以C型多见， 而其它地区则以D型多见。 多个研究也表明D型变异与 EBVaGC密切相关。 而一直以来， EBV基因分型的分析多通过限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP)和测序分析来进行。 1992年 Apolioni等最先根据BamH1位点的缺失情况提出PCR加酶切的方法鉴定EBV临床株C/D分型， 此方法一直被沿用至今。 但此方法过于繁琐， 且灵敏度较低， 不利于临床标本的快速灵敏分 型。 由此可见， 快速灵敏地诊断EB病毒C/D基因分型也是非常重要的。 0004 众所周知， EB病毒分离培养较为困难， 目前

10、临床诊断EB病毒的常用方法包括血清 学方法和PCR方法。 而血清学方法检测不仅费时， 而且操作复杂。 近几年兴起的荧光PCR技术 具有准确性高， 重复性好等特点， 已广泛用于基因表达研究、 病原体检测及基因分型等医学 研究领域中。 该方法完全闭管检测， 避免了交叉污染， 且结果判断由计算机完成， 简化了操 作步骤， 加强了结果的可靠性。 多种Taqman荧光探针的应用及荧光定量PCR仪的发展， 使利 用多通道荧光定量PCR仪进行实时EB病毒基因分型的检测及鉴别成为可能。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒， 是一 种双探针实时荧光定量P

11、CR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒， 由定量PCR反应液、 C型标准品、 D型标准品、 阳性对照品、 阴性对照品、 病毒DNA抽提裂解液、 操作说明书、 盒体、 盒盖组成， 定 量PCR反应液含有PCR缓冲液、 Mgcl2、 dNTPs、 EB病毒C/D基因通用上游引物， EB病毒C/D基因 通用下游游引物、 荧光探针、 Taq DNA聚合酶。 盒体设有容器孔， 分别放置PCR反应液管、 C型 标准品管、 D型标准品管、 阳性对照品管、 阴性对照品管、 病毒DNA抽提裂解液管， PCR反应液 说明书 1/5 页 3 CN 108179097 A 3 由单管分装， 矩阵排列， 其中： 0006

12、 上游引物序列为:5 -ATACTCCCGCCATGCGACT-3 ， 0007 下游引物序列为： 5 -CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3 0008 C型探针为： 5 FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3 0009 D型探针为： 5 VIC-CCTGCGGATCCCGATG-MGB 3 。 0010 C型标准品序列为： 0011 atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cccgctttcg gcgcccctgc ggaccccgat gacagcaggc

13、ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga D型标准品序列为： 0012 atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cctgctttcg gcgcccctgc ggatcccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga其中病毒DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5SDS。 00

14、13 阳性对照品为EB病毒Raji株和临床株的灭活DNA样品， 阴性对照品为无菌注射用 水。 0014 本发明提供的定量试剂盒保存在-20， 尽量减少反复冻融。 0015 本发明的另一个目的是提供的双探针实时荧光PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂 盒在鉴别EB病毒C/D基因分型中的应用。 0016 本发明试剂盒是将Taqman探针引入到EB的C/D基因分型中， 在C/D基因两端的保守 区设计引物， 在C/D基因的分型位置设计两种探针， 一种探针识别C分型的序列， 另一种探针 识别D分型。 在一个反应管中， 利用荧光定量PCR技术快速鉴定EB的C/D基因分型。 通过对C型 临床株， D型标准株

15、Raji株及中国地区EB临床株的C/D基因的序列进行分析， 我们在C型和D 型共同的两端保守区内设计了一对PCR的引物序列为： F 5 -ATACTCCCGCCATGCGACT-3 ， R5 -CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3 。 在C型临床株的保守区而与D型不同的区域设计探针用于 识别C型基因型的EB病毒， 其序列为5 FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3 ， 其5 端用荧光基团 FAM标记， 3 端用猝灭基团MGB标记。 在D型标准株及临床株的保守区而与C型不同的区域设 计探针用于识别C型基因型的EB病毒， 其序列为5 VIC-CCTGCGGATCCCGAT-M

16、GB 3 ， 其5 端用 荧光基团VIC标记， 3 端用猝灭基团MGB标记。 0017 本发明试剂盒使用方法： 0018 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照， 标准品用无菌去离子水稀释为1102-1 109拷贝/ml。 0019 (1)EB病毒DNA提取： 取EB病毒感染患者的50 L血浆或血清于EP管中， 加入50 L病 毒DNA抽提裂解液,置于100煮沸10min， 12000r/min离心5min， 取5 l上清作为PCR模板。 0020 (2)扩增检测： 在双色或以上的荧光定量PCR仪上进行， PCR体系共50 L， 其中PCR定 量反应液45 L， 检测样品(提取产物， 标准品， 阳

17、性对照， 阴性对照)5 L。 具体反应程序为94 2min； 循环中9415s， 6045s， 循环中的最后一步分别采集FAM通道荧光和VIC通道荧 光， 共循环40次。 0021 (3)荧光定量结果分析： 0022 a.双探针CT值均等于40， 则为EB阴性标本； 说明书 2/5 页 4 CN 108179097 A 4 0023 b.C探针或D探针其中之一CT35， 判定为相应的C/D分型； 0024 c.C探针和D探针CT值均35， 则判定为混合分型； 0025 d.CT值在35和40之间的， 重做之后大于37的为阴性。 0026 根据所获得的标准曲线， 计算各待测样本的EB病毒的滴度(

18、拷贝数/ml)。 0027 本发明运用实时荧光定量PCR技术， 采用EB病毒通用引物和C型和D型双特异荧光 探针， 开发研制出用于EB病毒C/D基因型分型的检测试剂盒。 并通过对临床上的EB病毒感染 患儿的血清标本进行检测分型， 旨在为临床上的EB病毒进行快速准确的C/D基因型分型的 鉴定， 同时为临床上不同C/D基因分型的EB病毒感染和疾病发生发展的关系提供实验手段 及实验依据。 本发明利用荧光定量PCR技术， 设计了C/D基因型分型的特异探针， 比传统的巢 式PCR结合酶切鉴定的方法更加简便， 快速和准确。 为临床上EB病毒C/D分型的鉴定提供可 靠的实验手段。 附图说明 0028 图1是

19、试剂盒结构示意图。 0029 图2是标本检测结果图。 0030 图3是标本分型后产物的测序图。 具体实施方式 0031 本发明结合附图和具体实施例做进一步说明。 应该理解， 实施例仅用于说明目的， 而不用于限制该发明的范围。 0032 实施例1 0033 参见图1,一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因基因分型试剂盒， 由定量PCR 反应液(1)、 C型标准品(2)、 D型标准品(3)、 阳性对照品(4)、 阴性对照品(5)、 病毒DNA抽提裂 解液(6)、 操作说明书(7)、 盒体组成(8)、 盒盖(9)构成。 盒体(8)设有容器孔， 分别放置PCR反 应液(1)、 C型标准品(2)、

20、 D型标准品(3)、 阳性对照品(4)、 阴性对照品(5)、 病毒DNA抽提裂解 液(6)， PCR反应液(1)由单管分装， 矩阵排列， 其中定量PCR反应液(1)含有PCR缓冲液、 Mgcl2、 dNTPs、 EB病毒C/D基因基因通用上游引物、 EB病毒C/D基因基因通用下游引物、 荧光 探针、 Taq DNA聚合酶。 其中： 0034 上游引物序列为:5 -ATACTCCCGCCATGCGACT-3 ， 0035 下游引物序列为： 5 -CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3 0036 C型探针为： 5 FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MGB 3 ， 0037 D型探针为

21、： 5 VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3 。 0038 C型标准品序列为： 0039 atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttgccgc tccccgcatt cccgctttcg gcgcccctgc ggaccccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga D型标准品序列为： 0040 atactcccg ccatgcgact gctcgccccc tcccaggcct ccctggtgag cccttg

22、ccgc tccccgcatt cctgctttcg gcgcccctgc ggatcccgat gacagcaggc ctttccttcc cccgttaatg aaaagaatga cagtgaggtt gtgacaga 说明书 3/5 页 5 CN 108179097 A 5 0041 病毒DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5SDS。 0042 阳性对照品为EB病毒临床株和Raji株的灭活DNA样品， 阴性对照品为无菌注射用 水。 本发明提供的定量试剂保存在-20， 尽量减少反复冻融。 0043 实施例2双探针实时荧光定量PC

23、R法检测C型临床株和D型标准株Raji株 0044 一.材料： 临床株(C型)及Raji株(D型)均为本实验室保存。 0045 二.引物和探针的设计与合成 0046 从Genbank中调取临床株及Raji株的C/D的基因序列， 应用MegAlign软件分析其基 因序列， 在C/D分型病毒的保守区设计上下游引物， 在两种病毒的不同区域(分型区)设计特 异性的探针。 0047 上游引物序列为:5 -ATACTCCCGCCATGCGACT-3 ， 0048 下游引物序列为： 5 -CTGTCACAACCTCACTGTCAT-3 0049 C型探针为： 5 FAM-CCTGCGGACCCCGAT-MG

24、B 3 ， 0050 D型探针为： 5 VIC-CCTGCGGATCCCGAT-MGB 3 。 0051 引物为擎科生物合成， 探针为上海优为格生物科技有限公司合成。 0052 三.C/D型EB病毒株DNA的抽提 0053 取标准株病毒上清液50 L于EP管中， 加入50 L病毒DNA抽提裂解液置于100煮沸 10min， 12000r/min离心5min， 取5 L上清作为PCR模板。 0054 四.C/D型EB病毒株的实时荧光PCR实验 0055 对上述两种临床株及Raji株进行单管C/D分型的荧光PCR检测， 结果表明临床株C 型探针为阳性， D型探针为阴性。 Raji株D型探针为阳性，

25、 C型探针为阴性。 我们设计的分型探 针无任何交叉信号出现， 具有很高的特异性。 具体CT值参见表1。 0056 表1EB病毒标准株的荧光定量PCR的C/D分型结果 0057 病毒株C型D型 临床株25.160.6540.000 Raji株40.00022.320.39 0058 实施例3双探针荧光定量PCR检测临床病毒株C/D分型的应用 0059 一.标本检测： 0060 选取2016年3月1日-8月31日内的EB病毒感染患儿的血液标本88例， 及30例未感染 EB病毒儿童的血液为对照。 每例取EDTA抗凝血液1ml进行C/D双探针分型的实时荧光定量 PCR检测。 0061 二.临床标本检测

26、结果： 0062 30例未感染EB病毒儿童的血液标本均未检测到荧光信号， EB病毒感染为阴性。 62 例EB病毒感染儿童的血液标本均为EB病毒感染阳性， 其中为C型EB病毒感染58例， D型EB病 毒感染4例。 其中临床标本的C/D分型的PCR扩增曲线参照图2。 为了进一步验证结果的可靠 性， 我们随机选取了5例标本扩增后的产物进行了测序， 结果证明产物均为对应分型的EB病 毒的C/D基因(4例C型EB病毒， 1例D型EB病毒)， 结果参照图3。 双探针实时荧光定量PCR鉴别 EB病毒C/D基因分型试剂盒不仅可以快速检测出EB病毒感染的阳性标本， 也可以对EB病毒 C/D基因进行准确的分型。

27、说明书 4/5 页 6 CN 108179097 A 6 0063 本发明是结合最佳实施例进行描述的， 然而在阅读了本发明的上述内容后， 本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。 说明书 5/5 页 7 CN 108179097 A 7 序列表 浙江大学 荧光定量PCR测定EB病毒C/D基因分型试剂盒及应用 6 SIPOSequenceListing 1.0 1 19 DNA EB病毒C/D基因分型上游通用引物(人工序列Unknown) 1 atactcccgc catgcgact 19 2 21 DNA EB病毒C/D基因分型下

28、游通用引物(人工序列Unknown) 2 ctgtcacaac ctcactgtca t 21 3 15 DNA EB病毒C基因分型探针(人工序列Unknown) 3 cctgcggacc ccgat 15 4 15 DNA EB病毒D基因分型探针(人工序列Unknown) 4 cctgcggatc ccgat 15 5 157 DNA EB病毒C型标准品(人工序列Unknown) 5 atactcccgc catgcgactg ctcgccccct cccaggcctc cctggtgagc ccttgccgct 60 ccccgcattc ccgctttcgg cgcccctgcg gac

29、cccgatg acagcaggcc tttccttccc 120 ccgttaatga aaagaatgac agtgaggttg tgacaga 157 6 序列表 1/2 页 8 CN 108179097 A 8 157 DNA EB病毒D型标准品(人工序列Unknown) 6 atactcccgc catgcgactg ctcgccccct cccaggcctc cctggtgagc ccttgccgct 60 ccccgcattc ctgctttcgg cgcccctgcg gatcccgatg acagcaggcc tttccttccc 120 ccgttaatga aaagaatgac agtgaggttg tgacaga 157 序列表 2/2 页 9 CN 108179097 A 9 图1 图2 说明书附图 1/2 页 10 CN 108179097 A 10 图3 说明书附图 2/2 页 11 CN 108179097 A 11