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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810143029.3 (22)申请日 2018.02.11 (71)申请人 云南省烟草农业科学研究院 地址 650031 云南省昆明市圆通街33号 (72)发明人 白戈谢贺姚恒杨大海 李永平张谊寒 (74)专利代理机构 昆明知道专利事务所(特殊 普通合伙企业) 53116 代理人 谢乔良张玉 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) (54)发明名称 一种烟草rbcl基因片段及其应用 (57)摘要 本发明公开。
2、了一种烟草rbcl基因片段， 所述 rbcl基因片段序列如SEQNo.1所示。 所述烟草 rbcl基因片段可用于鉴定烟草成分， 即将所述 rbcl基因片段作为烟草成分标记， 在成分分析中 若检测出相同序列片段， 就说明成分组成中存在 烟草。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 108192897 A 2018.06.22 CN 108192897 A 1.一种烟草rbcl基因片段， 其特征在于， 所述rbcl基因片段序列如SEQ No.1所示。 2.一种权利要求1所述烟草rbcl基因片段鉴定烟草成分的应用， 其特征在于， 将所述 rbcl基因片段作为烟草成分标记， 在成分分。
3、析中若检测出相同序列片段， 就说明成分组成 中存在烟草。 3.一种应用权利要求1所述的烟草rbcl基因片段鉴定烟草成分的方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： （1） 提取待测样品总DNA； （2） PCR扩增： 以总DNA为模板， 根据烟草rbcl基因片段， 设计特异性引物对进行PCR扩 增， 回收和纯化PCR扩增产物； （3） 克隆与测序： 将所述PCR产物插入重组载体， 然后将所述重组载体转入大肠杆菌， 扩 繁后提取质粒， 对质粒进行测序； （4） 确定成分： 将测序结果与所述rbcl基因片段序列进行对比， 确定所述样品是否含有 烟草成分。 4.根据权利要求3所述鉴定烟草成分的方法， 其。
4、特征在于， 所述特异性引物为： Rbcl-检测-F： CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC； Rbcl-检测-R： AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG。 5.根据权利要求3所述鉴定烟草成分的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增体系为50 L体 系： DNA模板1 L， 上下游引物 （10 mol/L） 各1 L， 5buffer 10 L， dNTP （10 mmol/L） 1 L, DNA聚合酶 0.5 L， 最后加ddH2O至50 L； PCR扩增反应条件为： 98预变性5min； 98变 性30s， 58退火30s， 72延伸30s, 30个循环；。
5、 72延伸5 min； 4保存。 6.根据权利要求5所述鉴定烟草成分的方法， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为phusion、 KOD Plus或EasyTaq PCR SuperMix。 7.根据权利要求3所述鉴定烟草成分的方法， 其特征在于， 所述测序的方法为Sanger法 测序。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108192897 A 2 一种烟草rbcl基因片段及其应用 技术领域 0001 本发明属于遗传工程技术领域， 进一步属于成分分析技术领域， 具体涉及一种烟 草rbcl基因片段及其应用。 背景技术 0002 在烟草是重要的经济作物， 烟草中含生物碱约1%9%及芸香苷、 有机酸、。
6、 脂肪、 树 脂、 蛋白质、 糖、 香料等物质。 在化工、 农药和医药等领域有十分广泛的用途。 烟草具有很强 的生理活性， 我国传统医药有许多利用烟草治病的记载。 同时烟草行业也为国家缴纳了大 量的利税， 为国家的经济建设做出重要的贡献， 尤其对偏远地区如云南， 贵州等地区的发展 做出的贡献更为突出。 尤其是通过烟草的栽培种植可以极大的改善边远山区农民的收入， 能够使社会保持稳定。 0003 因为利益驱动， 目前市场上存在大量的假烟， 里面可能掺杂着其它的植物材料， 极 大的损害了消费者的身体健康， 同时存在一些非法售卖私烟的行为， 这些行为是违法的， 也 给国家税收造成重大的损失， 目前需要。
7、一种有效的方法检测查获的制品里面是否含有烟草 成份， 一旦含有烟草成份， 则说明该制品违反了烟草专卖法。 0004 目前烟草制品检验方式主要是感官检验和理化检验。 这些传统鉴别方式主 要凭 借业内人士的经验积累， 也存在着经验主义不能定性的缺点。 随着科学技术的发展， 分子生 物学鉴定 技术逐渐渗透到各个生物领域， 但在烟草制品成份检测领域应用还很少。 0005 为此， 本发明发现了一种烟草rbcl基因片段， 并研发了利用此基因片段鉴定烟草 成分的方法。 发明内容 0006 本发明的第一目的在于提供一种烟草rbcl基因片段， 所述rbcl基因片段序列如 SEQ No.1所示。 0007 本发明。
8、的第二目的在于提供一种所述烟草rbcl基因片段鉴定烟草成分的应用， 即 将所述rbcl基因片段作为烟草成分标记， 在成分分析中若检测出相同序列片段， 就说明成 分组成中存在烟草。 0008 本发明的第三目的在于提供一种应用所述的烟草rbcl基因片段鉴定烟草成分的 方法， 其特征在于， 包括如下步骤： （1） 提取待测样品总DNA； （2） PCR扩增： 以总DNA为模板， 根据烟草rbcl基因片段， 设计特异性引物对进行PCR扩 增， 回收和纯化PCR扩增产物； （3） 克隆与测序： 将所述PCR产物插入重组载体， 然后将所述重组载体转入大肠杆菌， 扩 繁后提取质粒， 对质粒进行测序； （4）。
9、 确定成分： 将测序结果与所述rbcl基因片段序列进行对比， 确定所述样品是否含有 烟草成分。 说明书 1/4 页 3 CN 108192897 A 3 附图说明 0009 图1三个烟草品种PCR扩增产物； 图中， M-分子量标记； 图2 CTAB法提取混合样品DNA； 图中， M-分子量标记， 1-混合样品； 图3 混合样品PCR扩增产物； 图中， M-分子量标记， 2-混合样品。 具体实施方式 0010 下面对本发明作进一步的说明， 但不以任何方式对本发明加以限制， 基于本发明 教导所做的任何变换或替换， 均属于本发明的保护范围。 0011 本发明所述的一种烟草rbcl基因片段， 其特征在。
10、于， 所述rbcl基因片段序列如SEQ No.1所示。 所述烟草rbcl基因片段可用于鉴定烟草成分， 将所述rbcl基因片段作为烟草成 分标记， 在成分分析中若检测出相同序列片段， 就说明成分组成中存在烟草。 0012 应用所述的烟草rbcl基因片段鉴定烟草成分的方法包括如下步骤： （1） 提取待测样品总DNA； （2） PCR扩增： 以总DNA为模板， 根据烟草rbcl基因片段， 设计特异性引物对进行PCR扩 增， 回收和纯化PCR扩增产物； （3） 克隆与测序： 将所述PCR产物插入重组载体， 然后将所述重组载体转入大肠杆菌， 扩 繁后提取质粒， 对质粒进行测序； （4） 确定成分： 将测。
11、序结果与所述rbcl基因片段序列进行对比， 确定所述样品是否含有 烟草成分。 0013 采用CTAB法、 TPS法等常规方法提取总DNA。 0014 作为本发明的一种优选， 特异性引物为 Rbcl-检测-F： CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC； Rbcl-检测-R： AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG。 0015 作为本发明的一种优选， 所述PCR扩增体系为50 L体系： DNA模板1 L， 上下游引 物 （10 mol/L） 各1 L， 5buffer 10 L， dNTP （10 mmol/L） 1 L, DNA聚合酶 0.5 L， 最 后加dd。
12、H2O至50 L； PCR扩增反应条件为： 98预变性5 min； 98变性30s， 58退火30s， 72 延伸30s, 30个循环； 72延伸5 min； 4保存。 所述DNA聚合酶可以为phusion、 KOD Plus 或EasyTaq PCR SuperMix。 0016 作为本发明的一种优选， 所述测序的方法为Sanger法测序。 然后利用GenBank或 BOLD等数据库进行blast分析。 0017 本发明在NCBI上搜索所有植物的保守序列， 如rbcl， psbA，psbD及matK， 采用生物 信息学方法分析这些序列， 挑选在所有物种中均保守的区域设计通用引物， 通用引物包。
13、含 基因区域要含有足够多的多态性以能够区分不同植物。 本发明选择rbcl基因， 所述rbcl基 因片段可以用于烟草成分的鉴定。 再通过设计合成特异引物， 采用PCR技术检测样品中的烟 草成分。 该使用方法快速、 准确、 灵敏， 可在生产现场应用。 说明书 2/4 页 4 CN 108192897 A 4 0018 实施例1: rbcl基因片段的获得 以烟草主栽品种云烟87、 K326、 红花大金元为材料提取DNA。 水浴加热CTAB提取液至60 65， 取愈伤组织或叶片0.2 g， 液氮研磨成粉末， 加入600 L的CTAB提取液 （表1） ， 研磨 成匀浆； 将匀浆液转入1.5 mL Epp。
14、endorf管， 6065水浴1h； 加入等体积的酚-氯仿-异戊 醇 （25： 24： 1） ， 颠倒混合； 常温下， 12000 r/min 离心15min； 用枪小心将上清转移到新离心 管中， 注意不要吸动中间的蛋白质层； 12000 r/min, 离心10min， 将上清转移到新管中， 仍 旧要注意不要触动中间的蛋白质层； 向上清中加入0.6倍至等体积异丙醇， 彻底颠倒混匀， 使DNA从溶液中析出， 形成絮状沉淀； 用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀， 放到已经加入70乙醇 的1.5 mL Eppendorf管中， 颠倒管子几次， 以洗涤DNA， 溶解其中含有的色素等物质； 离心， 倒出管中的。
15、酒精， 并用枪将剩余的液体尽量吸净， 真空浓缩仪干燥之后， 向管中加入适量TE 缓冲液溶解DNA。 电泳检测提取的DNA。 0019 表1 CTAB 缓冲液配置方法 采用特异引物扩增烟草rbcL基因片段。 PCR扩增体系为50 L体系： DNA模板1 L， 上下 游引物 （10 mol/L） 各1 L， 5buffer 10 L， dNTP （10 mmol/L） 1 L, Phusion DNA Polymerase 0.5 L， 最后加ddH2O至50 L； PCR扩增反应条件为： 98预变性5min； 98变 性30s， 58退火30s， 72延伸30s,30个循环； 72延伸5 min。
16、； 4保存。 将获得的PCR产物 进行电泳检测， 可以看出电泳能够获得清晰条带 （图1） 。 0020 由图1可见： 三个主栽品种均能够得到1500 bp左右的条带。 将获得的PCR产物插入 重组载体， 再转入大肠杆菌。 将获得的大肠杆菌单克隆扩繁并提取质粒。 具体步骤如下： 将做好转化的菌落放到2 mL的LB培养基溶液中37震荡培养过夜。 将摇好的大肠杆菌 菌液倒入2 mL离心管中， 然后在12000 r/min的转数下离心2 min。 除去上清， 留下沉淀。 向 离心管的沉淀中加入250 L的P1溶液， 然后充分震荡。 接下来向离心管中加入250 L的P2 溶液， 然后轻轻的震荡。 然后向。
17、离心管中加入350 L N1 溶液， 上下翻转7-8次混合均匀， 此 步骤不要剧烈震荡， 以免将质粒变成开环结构。 0021 将离心管在12000 r/min下离心10 min， 然后将上清液小心的移入试剂盒的纯化 柱中， 然后将纯化柱放入离心机， 在12000 r/min下离心1min。 弃去上清液相， 然后在纯化柱 上加入500 L的PE溶液， 将纯化柱放入离心机在12000 r/min下离心1 min， 重复上述步骤。 弃去上清， 将纯化柱在12000 r/min下离心1 min。 此时将纯化柱重新放到一个新的离心管 上， 将纯化柱管口打开， 静止5 min， 充分将滤膜晾干， 以免乙醇。
18、污染。 在滤膜上加30 L的 水， 然后静止1 min， 让质粒充分的溶解在水中。 然后将纯化柱在12000 r/min下离心1 min。 说明书 3/4 页 5 CN 108192897 A 5 此时得到的液相即为质粒。 0022 将质粒送交invitrogen公司进行测序， 获得烟草rbcL基因全长片。 将获得的烟草 rbcL基因全长片段在NCBI上进行blast比对， 从而获得rbcL基因保守序列进而能够进行烟 草制品或疑似烟草制品组成成份的检测。 检测序列的选择为该区域要含有足够多的多态性 以能够区分不同植物， 同时要满足该区域上下游能够设计出保守引物， 该引物在不同物种 间具有通用性。
19、。 本发明优选获得一对检测引物为： Rbcl F: ATGAGTTGTAGGGAGGGATTTATG； Rbcl R: TTACTTATCCAAAACGTCCACTGCTG。 0023 通过PCR扩增， 克隆与测序， 得到本发明所述的rbcl基因片段。 0024 实施例2: 对植物混合样品进行烟草成分检测 由于没有伪劣烟草制品因此只能采用双盲实验， 在植物样品中混杂少量烟草成份， 以 便检测实验方法的敏感性。 植物样品的选择以选择近缘物种及远缘物种共同掺杂， 这样能 够检验该序列对烟草成分的检测效率。 0025 提取混合样品的DNA， 采用CTAB法提取混合样品的DNA， 方法同实施例1。 电。
20、泳检测 获得的DNA （图2） 。 以提取获得的DNA为模板， 用rbcl检测引物进行PCR扩增。 PCR扩增体系与 反应条件同实施例1。 检测引物序列如下所示： Rbcl-检测-F： CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC； Rbcl-检测-R： AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG。 0026 将扩增产生的PCR产物进行电泳检测， 可以看到扩增产生了大约400 bp的片段 （图 3） 。 将PCR产物进行克隆和测序， 具体方法同实施例1。 0027 20个质粒的测序结果与rbcl基因片段进行对比， 结果表明： 20克隆里面有2个烟草 的rbcl序列。 说。
21、明书 4/4 页 6 CN 108192897 A 6 SEQUENCE LISTING 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草rbcl基因片段及其应用 2018 1 PatentIn version 3.5 1 420 DNA 烟草 1 atgagttgta gggagggatt tatgtcacca caaacagaga ctaaagcaag tgttggattc 60 aaagctggtg ttaaagagta caaattgact tattatactc ctgagtacca aaccaaggat 120 actgatatat tggcagcatt ccgagtaact cctcaacctg。
22、 gagttccacc tgaagaagca 180 ggggccgcgg tagctgccga atcttctact ggtacatgga caactgtatg gaccgatgga 240 cttaccagcc ttgatcgtta caaagggcga tgctaccgca tcgagcgtgt tgttggagaa 300 aaagatcaat atattgctta tgtagcttac cccttagacc tttttgaaga aggttctgtt 360 accaacatgt ttacttccat tgtaggtaac gtatttgggt tcaaagccct gcgcgctcta 420 序列表 1/1 页 7 CN 108192897 A 7 图 1 图 2 说明书附图 1/2 页 8 CN 108192897 A 8 图 3 说明书附图 2/2 页 9 CN 108192897 A 9 。