技术领域
本发明涉及一种细胞分散剂，具有的含有EDTA、胰蛋白酶和胶原酶。
背景技术
细胞分离常用的方法分为悬浮细胞的分离方法和实体组织材料的细胞分离方法。
悬浮细胞的分离方法，组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养；若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
(1)机械分散法
若组织纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。
(2)消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：
胰蛋白酶分散技术是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
由于胰蛋白酶的活力和纯度等因素对细胞分散的影响较大，而胶原酶分离效果好，但价格高，增加成本。迫切需要一种成本低，分离效果好的细胞分散剂。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种细胞分散试剂，该试剂分离细胞效果好，且成本低。进一步，本发明还提供一种细胞分散方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种细胞分散剂，含有离子螯合剂、胶原酶和胰蛋白酶。EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)，是一种螯合剂(chelatingagent)，能与组织内的Ca2+、Mg2+离子螯合而使细胞分离。EDTA作用温和，在一般情况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。
进一步地，离子螯合剂为EDTA，浓度为0.01-0.1％；胰蛋白酶为胰蛋白酶，浓度为0.2-1％；胶原酶的浓度为0.05-0.5％
更进一步地，离子螯合剂浓度为0.02％、胶原酶I浓度为0.1％和胰蛋白酶浓度为0.2％。
细胞分散剂的各组分可以提前混匀加入到细胞块中，也可以分别加入到细胞块中。
附图说明
图1为实施例1在有EDTA、胰蛋白酶和胶原酶I的情况下获得的试样中的细胞的显微镜照；
图2为参考例中在没有氟树脂粒子的情况下搅拌后细胞悬浮液中的细胞的显微镜照片；
图3为比较例1中仅有EDTA情况下分散细胞的显微镜照片；
图4为比较例2中仅有胶原酶I情况下分散细胞的显微镜照片；
图5为比较例3中仅有胰蛋白酶情况下分散细胞的显微镜照片。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权项的范围内，可以适当的进行变更实施。
本发明的细胞分散方法是一种在液体培养基中将数个细胞凝集成的细胞块分离成单一细胞的分散方法，其特征在于将细胞块和细胞分散剂在液体培养基中混合。
本说明书中所说的“细胞块”指数个细胞凝集而成的物质。在本发明中，比如可将轻蹭生物粘膜所采集的、因粘液凝集在一起的细胞作为细胞块使用。具体来说，细胞块包括轻蹭宫颈部、鼻腔和咽喉所采集的、含有细胞的物质等。在本发明中，也可以将数个细胞凝集而成的物质保存在酒精溶液中作为细胞块使用。还可以将从生物采集的细胞培养后所获得的细胞培养物作为细胞块使用。
在本说明书中，所谓“分散细胞块”指从细胞块分离出组成细胞块的细胞，比如使这些细胞分散在溶液中。本发明中的分散目标细胞块指单一个体之间、聚合体之间或单一个体和聚合体凝集的巨大结构体。上述细胞块有可能影响细胞诊断或流式细胞技术的测定。而本发明中被分散的“分散后细胞”的状态以2～6个细胞凝集的聚合体的状态或单一个体的状态为宜，最好为单一个体的状态。
在本说明书中，使细胞分散的液体培养基可以使用水溶液、水溶性有机溶剂以及水溶液和水溶性有机溶剂的混合溶剂。最好是水溶液或水溶液和水溶性有机溶剂的混合溶剂。
实施例1
将从宫颈部位采集的细胞用含酒精的细胞保存液[豪洛捷有限公司(HologicInc.)制，商品名：PreservCyt(注册商标)]固定，得到细胞试样。将此细胞试样以190×g在室温下离心分离5分钟，回收细胞。分别取1ml细胞作为细胞悬浮液作为待测样本，共7组。
按下表的浓度(终浓度)分别在在1ml细胞悬浮液中加入EDTA、胰蛋白酶和胶原酶I消化液，于37℃水域中作用30min。然后用台盼蓝试剂(浓度0.1％)染色，混匀。分别用显微镜观察7组细胞悬浮液。
表1：不同浓度细胞分散剂
EDTA 胰蛋白酶 胶原酶I 对照组 比较例1 0.02％ / / 比较例2 / / 0.1％ 比较例3 / 0.2％ / 实验组1 0.02％ 0.2％ 0.1％
结果显示，使用EDTA、胰蛋白酶和胶原酶I处理的细胞保持了细胞形态，同时分散为单个细胞(如图1)，而没用分散剂、仅用EDTA、胰蛋白酶或胶原酶I的细胞悬液中的细胞凝集成细胞块(如图2-4)。
实施例2
肝脏组织细胞的分散，具体如下：
(1)取小鼠肝脏组织，把组织块剪碎，呈1～5mm3大小的组织块。
(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。
(3)消化加入消化液(胰蛋白酶浓度0.2％，胶原酶I浓度0.1％，EDTA浓度0.02％)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1～2次)，
若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。
(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，显微镜下观察消化情况。
结果显示，细胞细胞保持了细胞形态，同时分散为单个细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。