技术领域：
本发明涉及用人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端31肽作为抗原，制备抗细胞 质胸苷激酶-IgY抗体及以IgY抗体为有效成分的肿瘤诊断组合物。
背景技术：
癌症被当代人称为“不治之症”，已成为威胁人类健康和生命的主要疾病之 一，国内治愈率仅为10％左右，其治愈率低主要原因是目前尚未理想的早期诊断 方法，多数患者就诊时已是晚期，因此提高治愈率关键在于“三早”，即早期发 现，早期诊断和早期治疗。现国内已有数十种肿瘤标记物如AFP(甲胎球蛋白)、 CEA(癌胚抗原)、HCG(绒毛膜促性腺激素)、PSA(前列腺特别抗原)、VCA(喉 癌抗原)、CA(癌抗原)等系列，其检测灵敏度仍较差或仅因检测个别器官而受 到局限性。例如，PSA检测前列腺癌的效果并不理想，CA-15-3仅仅是检测乳腺 癌，CA19-9仅仅是肠癌，由于治疗监控的效果仍不佳，美国临床肿瘤协会 (ASCO)在2002已经建议不再推荐使用。在恶性肿瘤的早期诊断中，肿瘤标志 物的检测已成为临床诊断的重要手段，肿瘤标志在肿瘤普查、诊断、判断预后 和转归，评价治疗效果和高危人群随访观察等方面都有较大的实用价值。
胸苷激酶(TK，ATP：thymidine 5′-phosphotransferase，EC.2.7.1.21，简称 TK)，一种嘧啶补救途径的酶，催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种 同功酶的形式出现：细胞质TK1和线粒体TK2。TK1的水平在细胞周期的G1 和S期交界处开始升高，随着细胞进入G1晚期，TK1酶的水平逐渐急剧上升，直 至S和G2期交界处。然而TK2仅能在静止期细胞中见到，在增殖细胞中水平 非常低[1-2]。由于TK1活性是与细胞生长状态紧密联系，因此TK1可以作为一 种好的标记物来检测增殖细胞的增殖活性和恶性肿瘤的增殖度[3-4]。1984年，采 用胸苷类似物，[125I]-5-碘-2′-脱氧尿苷作为底物，发展了检测血清TK1(STK)的 放射性同位素方法，并将它作为人血清学细胞增殖标记物[5]。在健康对照组中 STK的活性相对较低，但在增殖性细胞和肿瘤细胞中有显著的增加[6-8]。此法测 定虽有较高的灵敏度，但测定的是TK总活性，即TK1和TK2的活性(其中也 包括来源于组织器官中的增殖较快的细胞—肿瘤、非肿瘤细胞的增殖，即恶性、 良性或其它非肿瘤组织等等)。在使用放射性同位素方法测定中，[125I]-5-碘-2′- 脱氧尿苷并非是TK1活性分析的专一性底物，所以在TK1的活性测定中，对pH 和温度非常敏感，常产生不准确结果，因此在临床应用上有很大的局限性。
制备抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体在国际上尚未有报道。采用增强化学发光 点印迹法(Enhanced chemiluminescent(ECL)dot blot)针对恶性肿瘤作血清 学的早期诊断，建立癌症测定的指标，目前在国内外尚属首创。
发明内容：
本发明采用人宫颈癌细胞的TK1 C-端31肽(TK1的氨基酸序列从195-225) 作为抗原的设计，见(图1)。经化学合成的氨基酸多肽(31肽)作为半抗原， 与偶联分子(BSA)联接成大分子抗原，再经免疫母鸡获得IgY抗体，最后 成功地制备和纯化了抗TK1-IgY抗体。
本发明采用了以下技术方法：
1、抗原的设计
选择TK1作为抗原是它来源于癌细胞，而TK1进行调控细胞周期活性变化 的关键是氨基酸序列。
我们选择抗原的氨基酸序列是人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端的31肽 (TK1的氨基酸序列从195到225，见图1)作抗原，而实验结果已显示出我 们制备的抗TK1抗体对肿瘤TK1分子的高度特异性。
由于我们选用了这种调控细胞周期的活性多肽作为半抗原，因而制备的抗 体可作为监视肿瘤细胞增殖速度的分子探针，也为广谱型肿瘤的早期检查提供 了理论基础。通过对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检查，我们测得的阳性 率为83～93％，这分别高于以上介绍的肿瘤标志物的阳性捡出率。
选用这种调控细胞周期活性的TK1-C端多肽半抗原，分别对癌组织或肿 瘤细胞株中的TK 1抗原作特异性、稳定性及制备方法等方面比较，其 结果是应用多肽抗原制备的抗体为最优方案。这种多肽抗原具有性质稳 定，不易失活，便于长期保存的良好特性。
2、抗体的制备和纯化
应用上述抗原去免疫母鸡而制备出抗TK1-IgY抗体的方法，其特征在于：
(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在着分子遗传差异性；
(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；
(3)与传统的兔免疫制备多克隆抗体比较，IgY具备有内源分子均一性(只 产生一种类型的抗体分子，即IgY)，这可大大降低非正常免疫反应的噪声，而 提高正常免疫反应的灵敏度。
利用上述抗原免疫产蛋的母鸡，再从卵黄中分离纯化而得到抗体 粗品。用31肽制备抗体纯化亲和柱对IgY粗品进行亲和纯化，制备出 与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgY抗体。
3、TK1-IgY的鉴定
用三种细胞株分别鉴定抗体纯度：(1)重组人TK1工程株 (pT7 hTK1)，(2)一种表达TK1阳性的野生型淋巴瘤细胞株 (CEM-TK+)，(3)一种表达TK1阴性的细胞株(CEM-TK-，用抗5-溴 脱氧尿苷筛选得到的)，以这三种细胞株为标准来鉴定抗体的特异 性。天然TK1是从上述细胞萃取物中经SDS电泳，天然胶电泳和 等电点聚集分离以后，进行西部免疫印迹，测定了其纯度和分子 量。我们制备的抗体与重组人TK1工程株(pT7 hTK1)表达的TK1 作免疫印迹实验比较，证实了该抗体具有纯度高，无非特异性免 疫交叉反应，以其测定的分子量、等电点等都与文献报道的一致 [9-10]。
本发明的肿瘤诊断组合物是利用上述抗体，制备用于血清学检测的增强化 学发光点印迹检测和组织学检测的免疫组化检测组合物。其中增强化学发光点 印迹检测组合物是由以下物质组成：
抗TK1-IgY抗体 1瓶
羊抗鸡生物素化IgG 1瓶
辣根过氧化物酶(Avdin-HRP) 1瓶
ECL Western Blot检测试剂 1瓶
硝基纤维素膜 1卷
该检测方法采用增强化学发光点印迹法，对肿瘤的捡出灵敏度为10-11～10-12g/L，能鉴别良性和恶性肿瘤，这为肿瘤的早期捡出和鉴别提供了方法学依据。 此方法灵敏度与放免法相当，但没有放射污染，且检测成本低廉，便于保存。
本发明中免疫组化检测组合物由以下物质组成：
抗TK1-IgY抗体 1瓶
羊抗鸡生物素化IgG 1瓶
辣根过氧化物酶(HRP) 1瓶
应用上述检测试剂具有检测灵敏度高，同进口的同类型产品相比具有更高 的性能价格比。
本发明的优点：
由于抗TK1抗体是检测人血清、组织中微量TK1分子的高灵敏度探针，因 此，它可直接用于探测肿瘤的基础研究，健康普查、早期诊断、鉴别良性和恶 性肿瘤。它与目前在国内应用的肿瘤检测试剂相比有以下特点：
1、广谱性。
TK1是细胞S期DNA合成的关键酶之一。肿瘤扩增必须依赖此酶的参与方可 进行，因而它可作为监视细胞快速增殖的分子探针，也为广谱性肿瘤的早期检 查打下理论基础，因此能够对多种肿瘤血清及组织标本进行检查。
2、恶性肿瘤与良性肿瘤的鉴别。
对于恶性肿瘤与良性肿瘤；或良性肿瘤向恶性肿瘤的转化在临床上有相当 高的研究价值。TK1作为肿瘤检测的最突出特点是检测值与肿瘤恶变程度呈正比 关系，这为正常细胞、良性肿瘤与恶变肿瘤的临界值(或称阈值)的建立奠定 定量基础。
3、检测方法的灵敏度
该检测方法采用增强化学发光，对肿瘤的捡出灵敏度为10-11～10-12g/L， 这为肿瘤的早期微量标志分子捡出提供了方法学依据。此方法与放免法的灵敏 度相当，但没有放射污染，操作简便。如果能与国内主流的化学发光分析仪器 配合使用，可使TK1抗体的检测灵敏度提高到10-15～10-18g/L水平，这将大幅 度提升检测早期肿瘤的阳性率。
4、组合物的商业应用前景
TK1检测试剂主要由IgY抗体组成，这种抗体分子的稳定性远大于传统IgG， 因而很便于商业运输、贮存等流通环节的操作。这无疑可延长试剂的使用期， 降低试剂的潜在成本，因而是其它同类肿瘤检测试剂不具备的优点。另外，TK1 检测方法灵敏，其中的一抗、二抗及三抗试剂消耗量极少，可使肿瘤检测的费 降低，这很便于大范围肿瘤早期诊断的推广和应用。
附图说明：
图1：人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端的31肽氨基酸序列
具体实施方式：
本发明将通过以下实施例作进一步的描述：
实施例1：细胞质胸苷激酶活性部位氨基酸序列的获得。
HeLa细胞中的TK1是一种分子量为96kD的四聚体分子，其单体是由234个 氨基酸组成，TK1的C-端40个氨基酸(氨基序从195到234)是TK1调控细胞 周期活性变化的关键序列。若要消除这其中的40个氨基酸，则TK1将失去调控 细胞周期的活性。如果消除末端的10个氨基酸，TK1仍显示出调控细胞周期的 活性。我们经过活性筛选实验研究，选出的氨基酸序列是从211到225的15 肽和氨基酸序列从195到225的31肽。这种多肽经人工合成，再与偶 联分子(BSA)联接成抗原的抗体制备技术，已证实了用TK1-31肽抗原 (氨基酸序列从195到225)制备的抗体特异性好于15肽，这是本发明中 选用31肽作为免疫抗原的依据。
实施例2：细胞培养。
采用常规细胞培养方法，将实验所用的CEM TK+，CEM TK-细胞进行 培养(使用含10％小牛血清的1640培养液)，当培养瓶中细胞数長到 40×106时，将收获的细胞进行处理。
实施例3：pT7 hTK1工程株的制备与纯化。
按文献[6]提供的方法制备。纯化的hTK1(剪去了N端15个氨基酸) 经天然胶电泳和SDS电泳鉴定为一条带，分子量为22Kd。用ECL Western Blot方法进一步分析，hTK1与纯化的抗TK1-IgY抗体产生免 疫反应，在22Kd位置见到一条清晰印迹带。
实施例4：TK活性分析。采用放射免疫沉淀方法对TK1酶活性分 析。测定结果表明在CEM TK+的细胞株中，TK1酶活性是随着抗体浓度 增加而升高呈正比关係。在CEM TK-细胞株无TK1酶活性反应。
实施例5：抗-TK1 IgY抗体制备。鸡的免疫及粗品抗体制备按 Philip方法[11]进行，将KLH-TK1 31肽用PBS缓冲液溶解后，再与福 氏完全佐剂按1∶1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经两次给鸡用福氏 不完全佐剂与抗原混合液的加强免疫，四周后每天收集鸡蛋在4℃下 储存。IgY抗体的粗品纯化参照Akita等的水稀释法[12]，用有网眼的 漏斗将蛋黄与蛋白分离，完整的蛋黄用无离子水洗涤干净后用摄子去 掉蛋黄表皮，收集蛋黄液。用6倍体积的蒸餾水稀释蛋黄液，拌搅均 匀后调pH5.2，在4℃下放置过夜。蛋黄液以1,200×g，离心30分钟， 至100ml，加硫酸胺至60％飽和度，4℃下过夜。以8,000×g，离心20 分钟，将离心的沉淀用双蒸水稀释至100ml，加乙醇稀释至25％乙醇浓 度，-20℃放置30分钟后，以10,000×g冷凍离心20分钟，离心的上 清液用pH7.0，30mmol/L PBS稀释至一定浓度，混匀后再次以10,000g ×g，冷凍离心20分钟，取上清液冷凍干燥后，置-20℃保存。
实施例6：IgY抗体亲和层析纯化。300mg经CNBr活化的 Sepharose 4 Fast Flow冷冻干燥凝胶用冷的pH2.5，1mmol/L HCl溶 胀后直接装层析柱，抽真空洗涤200ml体积。2.0mg TK1-31肽(C-31 肽)在pH6.5，0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl缓冲液里溶解后加到 小层析柱里摇摆混匀1小时。用3倍柱体积冷的碳酸缓中液(pH6.5， 0.1mo l/L，NaHCO3)抽滤洗涤未偶联的肽，再用pH7.0，1.0mol/L乙 酸胺洗涤2～3倍柱体积，4℃过夜。用pH3.0，0.1mol/L，0.5mol/L NaCl醋酸缓冲液洗涤吸附过剩的肽。用偶联缓冲液(pH6.5，0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl)在小型层析系统上洗涤至无蛋白为止(280nm /OD≤0.01)，TBS缓冲液(pH8.0，0.1mol/L Tris/HCl，0.5mol/L NaCl) 平衡过夜。6.0mg IgY抗体粗品加少量的PBS缓冲液(pH5.5，20mmol /L)溶解，以0.02ml/每分钟的泵速上样于亲和柱，用TBS缓冲液 (pH8.0，0.1mol/L Tris/HCl，0.5mol/L NaCl)洗涤无杂蛋白为止 (280nm/OD≤0.01)，用甘氨酸缓冲液(pH3.0，0.1mol/L Glycine) 洗脱IgY抗体，以0.01ml/每分钟的泵速收集洗脱峰。将1.0ml/ 管的洗脱峰分别进行蛋白含量及免疫活性测定，最后合併洗脱峰，调 溶液pH至8.0，加等量的甘油至50％，加NaN3至0.05％，-20℃保存。
实施例7：抗体的纯度测定。按常规的天然胶(Native gel)电泳， IEF电泳泳对纯化的IgY抗体进行了纯度、分子量、等电点测定。SDS 电泳中标记分子量的标准蛋白为MW9.3-183.2Kd，IEF水平等电聚焦电 泳条件：2000V，50mA，20W，4℃，70分钟。蛋白质样品等电点测定： 用表面pH电极以0.5cm等距测定凝胶的pH梯度后作标准曲线求得。
实施例8：免疫沉淀。将培养处于对数期的细胞(CEM TK+，CEM TK-， LM TK+，LM TK-)用PBS缓冲液洗涤，800×g离心，重复处理2次。离 心的沉淀部分按细胞数40×106细胞/ml，加入1ml样品缓冲液(pH7.6， 10mmol/L Tris，5.0mmol/L MgCl2，5.0mmol/L NaF，250mmol/L 蔗糖，1.0mmol/L PMSF，2.0mmol/LDDT，0.25％NP-40)，放冰浴 里保温30分钟，8,000×g离心5分钟，离心的上清液加甘油至50％， -70℃保存。1.0ml细胞提取液(1mg蛋白/ml)加30μg亲和层析纯 化的IgY抗体，在4℃下过夜，然后加入生物素化-羊抗鸡IgG*抗体(1mg /ml)2μl混匀，冰浴放置2小时后加入蛋白G-Sepharose，4℃下转动 30分钟。以15,000×g离心的沉淀物用3倍体积的细胞抽提缓冲液洗 涤后，再改用2倍体积的pH7.6，10mmol/L Tris/HCl缓冲液洗涤， 最后得到的沉淀物用IgY抗体作Western Blot分析。
实施例9：ECL Western Blot分析。用培养的对数期细胞(CEM+， CEM-)抽提液进行SDS电泳；天然胶电泳，将电泳凝胶上的蛋白质用 Trans-Blot半干电转移仪转移到PVDF转印膜上，晾干保存。将蛋白 转移的PVDF膜片在甲醇中浸30秒，用双蒸水洗去膜上的甲醇。加10％ 脱脂奶粉/TBS缓冲液(pH7.5，20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl) 于每个反应槽中，室温下震摇4小时。移去槽中的溶液，用TBST缓冲 液(pH7.5，20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl，0.1％吐温-20)震摇 洗涤3次(15分钟/每次)，加生物素化羊抗鸡-IgG抗体(按反应的缓冲 液体积，以1∶2万倍稀释抗体)，室温下震摇反应1小时。用TBST缓 冲液震摇洗涤3次(15分钟/每次)，加入抗生物素蛋白-HRP(按反应的 缓冲液体积，以1∶1.5万倍稀释)，室温下震摇反应1小时。移去反应 液，用TBST缓冲液洗涤3次。加ECL发光试剂精确反应1分钟，甩干 后加上一层薄膜，迅速移去膜里的空气，放入底片夹内与X光胶片夹 紧，在暗室内感光2～5分钟后，立即显影、定影，然后进行蛋白印迹 图谱分析。
实施例10：免疫组化及图像分析。TK1-IgY抗体染色采用石腊包 埋切片，常规ABC-免疫组化染色法处理肿瘤组织标本，第一抗体，抗 TK1-IgY抗体稀释1∶10，作为第二抗体的生物素化-羊抗鸡抗体为 1∶200稀释，作为过氧化物酶的联接复合物(抗生物素蛋白-HRP)以 1∶100稀释。图像分析时，用正常组织，癌组织及癌旁区的免疫组化 切片各6个视野进序测定，结果以100个细胞计算染色强度指数，0表 示0-5％的细胞染色；+表示有5-25％细胞染色；++表示有25-50％；+++ 表示50％以上的细胞染色。
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