技术领域
本发明涉及基因检测方法，尤其是涉及BAFF基因实时荧光PCR检测方法 及其相关试剂盒。
背景技术
BAFF（B cell activation factor）,B细胞激活因子，肿瘤坏死因子家族成员，属于 Ⅱ跨膜蛋白，与同属于同一家族的APRIL有高度的同源性，在结构上两者是通过 不同的D-E环结合它们共同受体，从而导致不同亲和。经蛋白酶水解形成可溶性 [16]，可溶性BAFF在血清中主要是以三聚体的形式存在[M.Cao,P.Cao,H.Yanet al.,Appl BiochemBiotechnol,2009,157（3）:562-574]，是由免疫细胞分泌，包括 肥大细胞，嗜中性粒细胞，DC细胞及B和T细胞等。BAFF促进B细胞及T细胞的 增殖及分化，对成熟B细胞产生及维持有重要的作用，基因扰乱BAFF基因会导 致成熟B2细胞和MZ B细胞明显的缺陷[Y.Laabi,A.Strasser,Science,2000,289 （5481）:883-884]。BAFF可以结合TNFR家族的三种受体：TACI(transmembrane activator,calcium modulator,and cyclophilin ligand interactor)，BCMA（B cell maturation Ag)和BAFF-R(BAFF-receptor)。TACI和BCMA也可以结合APRIL， BCMA和TACI对B细胞的成熟及发育是必不可少，另外有研究表明TACI是BAFF 负调节受体，引起B细胞的凋亡，调节B细胞的稳定。B细胞增殖主要是通过是由 BAFF的第三受体BAFF-R进行诱导。
BAFF也参与自身免疫性疾病的发展。在自身免疫性疾病，如SLE，RA， 病人血清中发现BAFF明显高于正常人，在BAFF的转基因小鼠中出现了严重的 淋巴细胞紊乱和自身免疫性疾病的症状。BAFF的过量表达会促进低亲和性的自 身反应B细胞的聚集，也会促进T细胞的过度活化，分化为效应T细胞，及抗 凋亡因子Bcl2的表达和Th1细胞因子的分泌，从而引起自身免疫系统的紊乱； 目前对于BAFF过量表达主要是通过血清浓度的直接检测，检测周期长，并且没 有在国内医院系统内大范围的使用。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明目的在于提供一种方便和快捷检测 BAFF基因表达的引物和试剂盒。
本发明所采用的技术方案如下：
BAFF基因实时荧光PCR检测引物：
正向引物（SEQ ID NO.1）：GATGACT CCACAGAAAG
反向引物（SEQ ID NO.2）：ACAGCAGTTTCAAGC；
并利用上述引物对进行荧光PCR检测的试剂盒，试剂盒包括一种检测溶液， 其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2×)、正向引物10μM、反向引物10μM、 Rox Dye（50×）；
其中所述正向引物和方向引物为上诉的引物对。
利用本试剂盒进行检测的步骤如下：
1）提取待检测样品的RNA，并反转录DNA溶液。
2）反应体系：取2ul步骤1）中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检 测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul；加入到实时荧光反 应管中，进行离心；
3）将步骤2）的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测：
预变性94℃/30s，1次循环；变性95℃/5s，延伸66℃/100s，40次循环。
本发明采用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对BAFF基因进行鉴定， 具有检测实时性和高效性，并可以对早期BAFF基因表达进行检测，用于早期判 断自身免疫性疾病，另外可以对病人进行个性诊断和治疗过程中，BAFF的基因 表达情况的检测，并判断病人复发和加重病情的可能性。
附图说明
图1是本发明实施例1检测试剂实时荧光PCR检测特异性扩增曲线；
图2是实施例1中PCR扩增数值对比；
图3是阴性对照和检测样品ELISA检测对比。
具体实施方式
根据实施例和附图对本发明作进一步的说明。
实施例1所示：
1.设计BAFF基因实时荧光检测引物，针对BAFF cDNA的胞外区进行设计 引物：
正向引物：GATGACT CCACAGAAAG
反向引物：ACAGCAGTTTCAAGC；
2.构建利用上述引物对进行荧光PCR检测的试剂盒，试剂盒包括一种检测 溶液，其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2×)、正向引物10μM、反向引物 10μM、Rox Dye（50×）；
3.检验样品的制备
离心待检测样品和阴性对照血液，提取下层细胞的RNA，并反转录cDNA 溶液，低温保存备用；其中检测样品取自系统性红斑狼疮病人血液（1-6）作为 检测对象，取6份正常人血清阴性对照。
4.PCR反应
取2ul步骤3）中所得的cDNA溶液，并与上述试剂盒中的检测溶液14ul 进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul；加入到实时荧光反应管中，进行 离心；
预变性94℃/30s，1次循环；变性95℃/5s，延伸66℃/100s，40次循环。
4.结果判断和分析。
如图1所示的PCR扩增曲线，附图2对阴性对照和病人进行荧光性比对分 析。图1所示的扩增曲线表相本引物对具有良好的特异性，如附图2所示，检测 样品1-6具有较阴性对照具有较高的BAFF基因表达情况。
5.对病人样品中的血清利用BAFF抗体进行ELISA验证检测，所述的BAFF 抗体购自BioVision公司。如附图3所示，其中“***”表示p<0.001，具有明显 性差异，其中样品6没有显著性差异；如样品6外，ELISA检测结果与实时荧光 PCR检测的趋势相符。
其中，利用实时荧光PCR检测BAFF基因表达后，分析检测样品1-6相对 于阴性对照具有显著的差异，利用ELISA验证时，确定病人1-5血清中BAFF 的浓度较高，进而判断为BAFF依赖性系统自身免疫性疾病，针对BAFF进行药 物使用；对病人6再进行其他方面的分析。
上述实验表明，本发明所述的引物对具有良好的特异性，可用于BAFF基因 表达检测，用于区别病人自身免疫性疾病的病因。