技术领域
本发明涉及糖类化合物的化学合成，特别是低聚糖的合成方法。
背景技术
多糖类化合物广泛存在于动物、植物和微生物中。作为生命过程三大组 成物质之一，它广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节，如免疫细 胞间信息的传递与感受，细胞的转化、分裂及再生等活动。近年来，大量药 理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫受体， 提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小，安全性 高，抑瘤效果好等优点。
由于低聚糖能清除生物体内过多的氧自由基，提高机体的免疫机能，而 被广泛应用于治疗癌症，艾滋病及病毒性疾病，而目前主要是从天然物中提 取，使得这类药物成本高，价格昂贵，应用受到限制。目前科学工作中正试 图通过化学方法合成低聚糖。化学方法合成低聚糖有两种方法：一种是传统 的溶液化学合成方法，这种方法存在着反应步骤较多，最终产物的收率低， 反应条件下非反应性基团的保护以及合成过程中立体构型等问题。另一种方 法则为固相载体法，它大大简化了经典的溶液化学方法所必须的合成过程， 提高了反应的选择性，加快了主反应，抑制了副反应，同时使低聚糖的自动 合成变为可能。
现有固相载体法所用固相载体一般采用具有一定交联度的苯乙烯和二乙 烯基苯的共聚物，其中载体与糖单元可通过糖苷键、硫苷键、非糖苷键和二 元醇基团相连接。固相载体上糖链的延伸通过糖苷化反应完成，最后，用四 丁基铵(TBAR)将合成的低聚糖从载体上解离下来。现有固相载体法合成低 聚糖所用单体为烯糖，烯糖合成步骤多，产率低，价格昂贵，使其应用受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低聚糖的合成方法，用廉价易得的糖链上含 有环氧基或通过反应能在糖链上形成环氧基的糖单体为原料，通过固相载体 法合成糖单元可控制的低聚糖，拓宽低聚糖的来源。
本发明的低聚糖的合成方法是以糖链含有环氧基或通过化学反应能在糖 链中形成环氧基的糖单体为原料，载体与糖单体之间通过偶联剂连接，载体 上糖链的延伸，通过非糖苷链进行；最后用铵盐将合成的低聚糖从载体上解 离下来。
本发明的低聚糖的合成方法更具体的制备方法包括如下步骤：
(1).对载体、铁粉、四氯化碳混合物进行搅拌并滴加单质溴，于20℃ ～30℃反应1～2小时，并在55℃～65℃温度下加热至单质溴的棕色消失为止， 除去溶剂，水洗后烘干待用；所述原料的重量份数用量：
载体 60～120
铁粉 0.06～0.12
四氯化碳 100～200
单质溴 16～32，
所述载体是通用的苯乙烯-二乙烯基苯共聚体，可从市场购买，也可以用本发 明的方法制备；
(2).搅拌和通氮气的同时，在(1)的合成产物中加入10～20重量份 镁，100～200重量份二甲苯或者甲苯，得到灰色反应产物，加入13～26重量 份二甲基二氯硅烷或者二苯基二氯硅烷，反应3～6小时，除去溶剂；
(3).在(2)的反应产物中，加入200～400重量份数四氢呋喃，5～10重 量份数无水氯化锌，80～160重量份数1，2-异丙叉-5，6-脱水-α，d-呋喃葡萄 糖，在60～65℃、通氮气的情况下，搅拌反应10～15小时，过滤除去溶剂， 残留物水洗后，真空干燥；
(4).在(3)的产物中加入30～60重量份数四丁基氟化铵、20～40重量 份数乙酸、100～200重量份数四氢呋喃，反应8～16小时，过滤，残渣用四氢 呋喃洗涤，经萃取、干燥、蒸干得产物低聚糖。
第(1)步所述四氯化碳可以用四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、丁酮、己 二酸二甲酯、二氯甲烷、或者三氯甲烷代替。
第(3)步所述四氢呋喃可以用N，N-二甲基甲酰胺、丁酮、己二酸二甲 酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷代替。
第(3)步所述无水氯化锌可以用无水氯化镉、无水氯化铜、无水氯化镍、 无水氯化铁、或无水氯化钴代替。
第(4)步所述四丁基氟化铵可以用四乙基溴化胺、四丁基溴化胺、四乙 基氯化胺、四丁基氯化胺、或者四乙基氟化胺代替。
第(4)步所述四氢呋喃可以用N，N-二甲基甲酰胺、丁酮、或者己二酸 二甲酯代替。
第(4)步可用三氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得产物低聚糖。
第(1)所述载体可以通过下述方法合成：
在80±5℃，氮气保护和搅拌下，滴加过氧化二苯甲酰、二乙烯基苯、 苯乙烯、二甲苯混和液，在80±5℃保温2～4小时，100±5℃保温1～3小时， 降温至20～40℃出料，烘干后粉碎成粒径小于100nm的颗粒。所述原料的重 量份数用量：
苯乙烯 49～100
二乙烯基苯 5～15
过氧化二苯甲酰 2～6
二甲苯 100～200
所述低聚糖合成反应机理如下：
1.合成用糖单体使用糖链上含有环氧基或通过反应能在糖链上形成环氧 基的单糖衍生物。并且，糖链上只有一个羟基。其余羟基被保护。如：
等。
2.糖链上羟基的保护一般使用丙酮、二苯甲酮等，按糖∶丙酮(或二苯甲 酮等)＝1∶2～4的原料比投料，10～20℃的条件下反应使糖链上的羟基被保护。
3.载体苯环经卤代、与Mg粉反应形成格氏试剂后，与偶联剂按载体中苯 基∶偶联剂摩尔比＞2投料，20～25℃，氮气保护下反应2～6小时；糖单元通 过偶联剂与载体相连，偶联剂包括二甲基二氯硅烷、二苯基二氯硅烷等。
4.通过糖单元上的羟基与载体上的糖单元环氧基在7中催化剂作用下， 50～60℃，氮气保护，反应10～15小时，实现糖链的延伸。
5.按胺盐∶偶联剂摩尔比＞1投料，20～35℃，反应6～12小时，将合成的 低聚糖从载体上解离下来，所用胺盐如四乙基溴化胺、四丁基溴化胺、四乙 基氯化胺、四丁基氯化胺、四乙基氟化胺、四丁基氟化胺等。
6.通过控制偶联剂与糖单体的摩尔比，控制合成的低聚糖中糖单元数目， 如偶联剂∶糖单体＝1∶4，合成产物为四聚糖。
7.反应用的催化剂为无水氯化锌、无水氯化镉、无水氯化铜、无水氯化镍、 无水氯化铁、无水氯化钴。
8.合成反应所用溶剂为：四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、丁酮、己二酸 二甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷。
合成过程可用图1说明：将偶联剂接到载体苯环上后，利用偶联剂分子 中的活性基团与糖单体羟基反应，载体上的糖单体再与另一糖单体反应使糖 链延伸，最后用胺盐将合成的低聚糖从载体上解离下来，得到低聚糖产物。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
针对目前固相载体法合成低聚糖采用稀糖为糖单元及载体上糖链通过糖 苷键延伸存在的技术问题和难点，以糖链上含有环氧基的糖单元为单体，糖 链传递采用糖单体上的羟基与载体上的糖单元的环氧基反应，避免了采用稀 糖为糖单元进行固相载体法合成低聚糖存在的问题，拓宽了用于固相载体法 合成低聚糖的糖单体种类及合成低聚糖的种类。
稀糖为六碳糖，目前固相载体法合成低聚糖以稀糖为原料，所得的低聚 糖均为低聚葡萄糖，对于其它低聚糖合成限于原料，通过该方法合成困难。 同时稀糖的合成步骤多，产率低，不便于大规模工业生产，使其应用受到限 制。
本发明的合成方法则不同，只要能在糖链上形成环氧基或通过反应能在 糖链上形成环氧基的糖类衍生物(包括五碳糖和六碳糖)均可用于固相载体 法合成低聚糖，同时载体上糖链延伸通过非糖苷链和糖苷链进行，这样单糖 糖链上的环氧基在任何位置均不影响反应，如：
可合成低聚五碳糖
可合成低聚六碳糖
由于原料来源范围增大，合成低聚糖的种类增多，在此基础上可以研究 出便于工业化生产的原料及工艺。这一技术的应用会促进低聚糖固相载体法 合成的发展。
附图说明
图1是本发明方法合成原理示意图；
图2是本发明方法得到的低聚糖的红外光谱分析结果；
图3是图2所述低聚糖的质谱图；
图4是图2所述低聚糖体外清除自由基的测试结果。
具体实施方式
载体的合成
原料配比如下
苯乙烯(化学纯) 49.50克
二乙烯基苯(化学纯) 0.5克
过氧化二苯甲酰(化学纯) 2.5克
二甲苯(分析纯) 50克
工艺：
用一装有电动搅拌器的500ml四口圆底烧瓶，其中一口装有球形冷凝管 (冷凝管上端与油封管相连)。一口与氮气瓶相连，一口装滴液漏斗。在四口 瓶中加入25g二甲苯，升温至80±5℃，在氮气保护条件下，用1～2小时滴 加，过氧化二苯甲酰溶解在二乙烯基苯，苯乙烯和剩余二甲苯中形成的混和 液，滴加完毕后，在80±5℃保温一小时，100±5℃保温二小时，降温至(40 ℃出料，在干净的马口铁板上烘干，粉碎成粒径约100nm的颗粒备用。
低聚糖的合成：
在一装有电动搅拌器的三口瓶中加入载体6g、铁粉0.0056g、四氯化碳 5g。三口瓶一端连接装有单质溴1.6g、四氯化碳5g的滴液漏斗；另一口安 装球形冷凝管，冷凝管上端安装一个与烧杯水面相连的漏斗。在搅拌下滴加 单质溴，于20℃～30℃反应一小时，并在60℃下加热至单质溴的棕色消失为 止，减压蒸除溶剂，水洗2～3次，烘干待用。
在一装有电动搅拌器的三口圆底烧瓶中加入上述合成的产物，二甲苯 10g，三口圆底烧瓶一口接Y形管，Y形管上一口接球形冷凝管、冷凝管上端 与氮气瓶相连，Y形管上另一口用于加料，三口圆底烧瓶另一口与油封管相 连。在搅拌和通氮气的情况下，加入1g镁粉。反应如太激烈，则在冰水浴中 冷却。反应产物为灰色。上述反应结束后，在室温(20～25℃)下加入1.3g二 甲基二氯硅烷，搅拌，在通氮气的情况下反应4小时，减压蒸干溶剂。
在上述反应产物中，加入四氢呋喃20g、无水氯化锌0.5g、8.0g 1，2-异 丙叉-5，6-脱水-α，d-呋喃葡萄糖，在60～65℃、通氮气的情况下，搅拌反应 10小时，反应结束后，过滤除去溶剂，残留物水洗2～3次，真空干燥。
在250ml三口圆底烧瓶中，加入真空干燥后的产物、四丁基氟化铵3.0g、 乙酸2g、四氢呋喃10g，搅拌下在25℃～30℃反应8小时。过滤，残渣用四 氢呋喃洗涤2～3次，合并洗液，减压蒸馏浓缩后，加入50ml水，用100ml 三氯甲烷萃取3次，萃取液用水洗涤2次，并用无水硫酸钠干燥。干燥液减 压蒸干得产物低聚糖。
合成产物低聚糖经溴化钾压片后，进行红外光谱分析，结果示于图2。该 图表明，所合成的化合物存在多聚糖羟基的νOH3386cm-1吸收峰，νc-o 1050cm-1吸收峰，并且这两个吸收峰均很强。
图3为合成产物的质谱图。质谱分析结果表明，分子离子峰为665，和 四聚葡萄糖(分子量666)形成的分子离子质荷比一致，同时存在质荷比503 的碎片离子峰，它和四聚葡萄糖裂解生成的主要碎片离子三聚葡萄糖碎片离 子质荷比(503)一致。根据以上测定结果，确定合成产物为四聚葡萄糖，分子 量为666。
以DPPH(2，2-Diphenyl-1-picryl-hydrazylradical二苯代苦味酰基自 由基)进行低聚糖体外清除自由基实验。DPPH是一种稳定的自由基，其结构 中含有三个苯环，一个N原子上有一个孤对电子，其乙醇溶液显紫色，在517nm 附近有强吸收，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，颜色 由紫色向黄色变化，在517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由 基被清除的程度呈线性关系。据此可评价低聚糖清除自由基的能力或其生物 活性的大小。由于该测定方法简单，可靠、重现性好现已成为测定体外消除 自由基的重要方法之一。将样品用乙醇稀释至0.01％，取2ml于试管中，再 加入2ml浓度为0.2mmol的DPPH甲醇溶液，混合均匀，用分光光度计在517nm 处测定其吸光度Ai(每5min测定一次直至吸光度恒定)；同时测2mlDPPH溶液 +2ml甲醇混合液的吸光度Ac和2ml样品液+2ml甲醇混合后的收光度Aj，按 下式计算抑制率(低聚糖对自由基的清除率)。
抑制率(％)＝〔1-(Ai-Aj)/Ac〕×100％
以吸光度的差值对时间作图，得到图4所示的低聚糖清除自由基的测试 结果。表1列出了数据处理的情况。
表1低聚糖生物活性测定数据处理结果
数据 平均值
DPPH对照组 0.832
低聚糖 0.548
图4及表1的结果说明，合成的低聚糖抑制自由基的抑制率为34.2％， 具有一定的清除自由基活性。