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1、(10)申请公布号 CN 103966186 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966186 A (21)申请号 201410137657.2 (22)申请日 2014.04.08 C12N 9/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路 30 号南京工业大学江浦校区生工大楼 B408 室 (72)发明人 黄和 江凌 李晓彤 李霜 胡燚 (74)专利代理机构 江苏致邦律师事务所 32230 代理人 徐蓓 (54) 发明名称 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性 的方法。
2、 (57) 摘要 本发明属于酶工程技术领域， 涉及一种提高 枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 热稳定性的方法。本发明 以枯草芽孢杆菌脂肪 A 为研究对象， 首先从 RCSB 数据库中获取其晶体结构， 再利用分子动力学分 析其不同 Loop 区域的柔性 ； 经由上述理性分析， 并结合 “脯氨酸效应” 理论， 将筛选得到柔性较高 Loop 区域的甘氨酸残基突变为脯氨酸 ； 再通过分 子动力学模拟验证筛选得到的突变结果 ； 最终， 通过枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株的热稳定性实 验， 验证热稳定性改造的热点残基。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国。
3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103966186 A CN 103966186 A 1/1 页 2 1. 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 1) 获取枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 晶体结构， 通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较 高的 Loop 区域 ； 2) 结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高 Loop 区域的甘氨酸残基 ； 3) 基于对酶结构与功能关系的认知， 采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位 点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 蛋白结构稳定性的影响 ； 4) 。
4、构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变体并验证其热稳定性， 获得热稳定性得到提高的 枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 1） 所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 晶体结构并通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的 Loop 区域的方法具体为 ： 通过 检索蛋白数据库 RCSB 数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的晶体结构， 使用软件 Pymol0.9 分析枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的三维结构， 利用分子动力学方法， 得到枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的 Rmsf 值， 从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 柔性较大的区域。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其。
5、特征在于步骤 2） 所述的结合脯氨酸理论效应分析 确定位于柔性较高 Loop 区域的甘氨酸残基的方法是 ： 根据步骤 1） 得到的枯草芽孢杆菌 脂肪酶 A 的 RMSF 图， 利用 Pymol 可视化软件， 结合脯氨酸效应理论 , 确定位于柔性较高 Loop 区域的 Gly 残基作为突变位点突变为 Pro， 分别为 Gly153Pro、 Gly155Pro、 Gly158Pro、 Gly111Pro、 Gly116Pro、 Gly46Pro、 Gly52Pro。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤3） 所述的采用分子模拟技术解析将相 关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶 。
6、A 蛋白结构稳定性的影响的方法 ： 通 过分析均方根偏差 RMSD 与均方根涨落 RMSF 参数， 来分析引入的 Pro 突变位点对枯草芽孢 杆菌脂肪酶 A 热稳定性的贡献， 确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 热稳定性的重要氨基 酸位点是 Gly52Pro 和 Gly158Pro。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于分子动力学模拟技术具体为 ： 所有动力学 模拟均采用 GROMACS4.5.4 进行， 体系在中性条件下， 溶剂模型 SPC， 力场为 GROMOS9653a6， 温度为 400K， 相应地抗衡离子中和体系电荷 ； 体系首先采用最速下降法能量最小化 （Steepes。
7、t Descent）进行优化 ； 然后固定蛋白， 采用压力 Parrinello-Rahman， 与温度 V-rescale 进行 500 ps 约束优化 ； 最后进行分子动力学模拟， 放松蛋白， 时间步长为 2 fs， 模拟时间为 10 ns ； 体系每隔 1 ps 收集一次数据。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 4）所述的分子生物学构建枯草 芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变 ： 首先， 设计分别含 有 Gly52Pro 和 Gly158Pro 的引物， 用 primSTAR 对全质粒进行扩增， 突变质粒分别转入 DH5， 涂布含有氨苄青霉。
8、素的 LB 平板， 再转接到含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中 过夜培养 ； 提取质粒， 并转入 BL21（DE3） ， 涂布平板， 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变菌 BL21-pET22b-LipA。 权 利 要 求 书 CN 103966186 A 2 1/5 页 3 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性的方法 技术领域 0001 本发明属于酶工程技术领域， 涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 热稳定性的方 法。 背景技术 0002 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶， 是一种特殊的酯键水解酶， 它可以在油水界面 上催化油脂的水解反应， 生成脂肪酸和甘油、 甘油单酯或二酯。 枯草芽孢杆。
9、菌分泌的脂肪酶 A 是一类在食品、 医药、 化工等领域具有良好应用前景的生物催化剂。枯草芽孢杆菌脂肪酶 是最小的/折叠脂肪酶， 且缺乏多数脂肪酶都具有的螺旋形成的 “盖子结构” ， 从而 没有其它脂肪酶具有的界面激活效应。但是枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 对温度极其敏感， 在温 度超过 40时， 其酶活会急剧下降。 0003 酶的热稳定性是酶的重要属性之一， 热稳定性酶具有提高化学反应速率、 简化工 艺、 降低成本、 提高产品质量、 活性稳定、 耐贮藏等优点。因而寻找耐温性酶， 提高酶的热稳 定性一直是生产和科研关注的热点。 虽然目前已经有大量的关于酶热稳定性改造研究的报 道， 但是传统的理性设计方。
10、法受到蛋白质结构及功能关系复杂性的限制， 而非理性设计方 法则需要面临筛选容量大、 过程复杂等难题， 这两种方法各自的缺点在一定程度上限制了 蛋白质改造领域的工作进展。 发明内容 0004 本发明的技术目的是针对现有技术的不足， 结合脯氨酸效应提出一种高效的计算 机辅助筛选提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 热稳定性的方法。 0005 本发明的技术目的可通过如下技术方案实现 ： 基于脯氨酸效应提高枯草芽孢杆菌 脂肪酶 A（Bacillus subtilis lipase A， PBD: 1I6W） 热稳定性的方法， 包括如下步骤 ： 1） 获取枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 晶体结构， 通过分子动力学分析其蛋。
11、白结构中柔性较高 的 Loop 区域 ； 2） 结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高 Loop 区域的甘氨酸 （Gly） 残基 ； 3） 基于对酶结构与功能关系的认知， 采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点 置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 蛋白结构稳定性的影响 ； 4） 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变体并验证其热稳定性， 获得热稳定性得到提高的枯 草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株。 0006 优选的， 步骤 1） 所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 晶体结构并通过分子动力学 分析其蛋白结构中柔性较高的 Loop 区域的方法为 ： 通过检索蛋白数据库 (Protein data ba。
12、nk)RCSB 数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶 A （PBD: 1I6W） 的晶体结构， 使用软件 Pymol0.9 分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的三维结构,利用分子动力学方法， 得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A 的 Rmsf（Root mean square fluctuation） 值， 从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 柔性较大 的区域。 说 明 书 CN 103966186 A 3 2/5 页 4 0007 优选的， 步骤 2） 所述的结合脯氨酸效应分析确定柔性较高区域的甘氨酸 （Gly） 残 基的方法为 ： 根据步骤 1） 得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的 RMSF 图， 利用 Pymol 可视化软。
13、 件， 确定位于柔性较高 Loop 区域的 Gly 残基作为突变位点突变为 Pro， 分别为 Gly153Pro、 Gly155Pro、 Gly158Pro、 Gly111Pro、 Gly116Pro、 Gly46Pro、 Gly52Pro。 0008 优选的， 步骤 3） 所述的采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯 氨酸后对稳定枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 蛋白结构的影响的方法为 ： 通过分析均方根偏差 RMSD （Root Mean Square Deviation） 与均方根涨落 RMSF（Root Mean Square Fluctuation） 参 数， 来分析引入的Pro突。
14、变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的贡献， 确定得到提高枯 草芽孢杆菌脂肪酶 A 热稳定性的重要氨基酸位点是 Gly52Pro 和 Gly158Pro。 0009 优选的， 分子动力学模拟技术具体为 ： 所有动力学模拟均采用 GROMACS4.5.4 进 行， 体系在中性条件下， 溶剂模型 SPC， 力场为 GROMOS9653a6， 温度为 400K， 相应地抗衡离子 中和体系电荷 ； 体系首先采用最速下降法能量最小化 （Steepest Descent） 进行优化 ； 然后 固定蛋白， 采用压力 （Parrinello-Rahman） 与温度 （V-rescale） 进行 500 ps 。
15、约束优化 ； 最 后进行分子动力学模拟， 放松蛋白， 时间步长为 2 fs， 模拟时间为 10 ns。体系每隔 1 ps 收 集一次数据。 0010 优选的， 步骤 4） 所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株的方法是 采用全质粒扩增的方式进行突变 ： 首先， 设计分别含有 Gly52Pro 和 Gly158Pro 的引物， 用 primSTAR对全质粒进行扩增， 突变质粒分别转入DH5， 涂布含有氨苄青霉素的LB平板， 再 转接到含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中过夜培养 ； 提取质粒， 并转入 BL21（DE3） ， 涂布 平板， 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变菌 BL21。
16、-pET22b-LipA。 0011 本发明的有益效果在于 ： 本发明以枯草芽孢杆菌脂肪酶 A（PDB ： 1I6W） 为研究对象， 在计算机辅助设计的基础 上将脯氨酸理论应用于枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性改造上， 通过分子动力学模拟技 术直接分析其三维结构找出相关的脯氨酸位点， 并预测定点突变枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 后 对其稳定性的影响。既避免了现有技术中非理性设计方法需要面临的筛选容量大、 过程 复杂等难题， 同时简化了理性设计方法使得蛋白质的定点突变更具有针对性， 并最终成功 实现了枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性的显著提高， 通过本发明的方法得到的突变菌 LipAG52P、 L。
17、ipAG158P在 50下保温 1 小时后的相对残余酶活是原始菌 （LipA） 的倍数分别为 2.99 倍和 2.32 倍。 附图说明 0012 图 1 本发明枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 筛选热稳定点示意图。 0013 图 2 枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的 RMSD 随时间变化的演示图。 0014 图 3 在 300K 平衡时间段， 枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的 RMSF。 0015 图 4 LipGly52Pro与 LipGly158Pro的 RMSD 随时间变化的演示图。 具体实施方式 0016 下面的实施例对本发明作详细说明， 但对本发明没有限制。 0017 本发明中， 脯氨酸效应是指脯氨酸 （。
18、Pro） 受其吡咯烷环的束缚而具有更小的构象 说 明 书 CN 103966186 A 4 3/5 页 5 自由度， 同时限制其前面氨基酸的构象空间， 因此它比其他氨基酸更能增加蛋白质的刚性 ； 相对地， 甘氨酸 （Gly） 没有侧链且具有灵活的构象， 可增加蛋白质的柔性。因此适当的引入 Pro， 可降低蛋白质去折叠时的骨架熵从而达到提高蛋白质的热稳定性的作用。 0018 实施实例 1 本实施例说明本发明的步骤 1） 的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 晶体结构并通过分子 动力学手段分析其中柔性较高 Loop 区域的方法。以枯草芽孢杆菌脂肪酶 A（Bacillus subtilis LipA， PD。
19、B ： 1I6W） 为研究目标， 通过 RCSB 数据库检索得到枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的晶体结构 ； 将获得的枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 进行 20 ns 分子动力学模拟 （图 2） ， 提取平衡 时间段分析枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的均方根涨落 RMSF（图 3） 。 0019 实施实例 2 本实施例说明本发明的步骤 2） 的结合脯氨酸效应分析确定柔性较高 Loop 区域的甘氨 酸 （Gly） 残基为突变位点的方法。根据步骤 1） 得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的 RMSF 图， 通过 Pymol 可视化软件结合 “脯氨酸效应” 理论分析， 最终， 本轮的筛选得到的突变位点结 果是 ： Gly1。
20、53、 Gly155、 Gly158、 Gly111、 Gly116、 Gly46、 Gly52。 0020 实施实例 3 本实施例说明步骤 3） 的通过分子动力学模拟分析， 将筛选得到的 Gly 残疾突变为为 Pro 对枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性影响的方法。 0021 利 用 在 线 服 务 器 SWISS-Model 构 建 Gly153Pro、 Gly155Pro、 Gly158Pro、 Gly111Pro、 Gly116Pro、 Gly46Pro、 Gly52Pro 突变体， 并利用 Verify_3D 对构建的突变体模 型进行评估与优化。枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 及其突变体的动。
21、力学模拟采用 GROMACS4.5.4 软件包进行。模拟的步骤主要包括以下几个步骤 ： 第一步采用 pdb2gmx 命令添加蛋白中缺失的氢原子。并采用立方体盒子填充 SPC 溶剂 水模型与 GROMOS9653a6 力场。该命令为 ： pdb2gmx -f LipA.pdb -o.gro -p LipA.top -i .itp -water spc -ignh editconf -bt cubic -f LipA.gro -o LipA.gro -d 0.9 第二步采用genbox命令为立方体盒子填充水分子。 并修改top文件中水分子数目。 该 命令格式为 ： genbox -cp LipA.。
22、gro -cs spc216.gro -o LipA_b4em.pdb -p LipA.top 第三步利用 genion 命令加入相应地抗衡离子来中和体系电荷， 同时修改 top 与 gro 文 件水分子与离子数目， 使数目相匹配。该命令格式为 ： grompp -f em.mdp -c LIPA_b4em.pdb -p LIPA.top -o LIPA_em.tpr genion -s LipA_em.tpr -o LipA_ion.pdb -pname CL -np 5 -g LipA_ion.log 第四步将优化信息写入二进制文件 tpr 中， 利用 grompp 与 mdrun 进行模。
23、拟体系的能量 最小化 ； 模拟体系采用最小下降能量最优化 (Steepest Descent) 发进行 1000 步优化。然 后， 在温度 (V-rescale)400K 与压力 (Parrinello-Rahman)1.0Bar 条件下进行 500 ps 溶剂 最小化。最后， 在没有约束条件下进行 10 ns 动力学模拟。所有模拟体系每隔 1.0 ps 收集 一次数据。该命令格式为 ： grompp -f em.mdp -c LipA_ion.pdb -p LipA.top -o LipA_em.tpr mdrun -v -s LipA_em.tpr -o LipA_em.trr -c Li。
24、pA_b4pr.pdb -e em.edr -g em.log 说 明 书 CN 103966186 A 5 4/5 页 6 grompp -f pr.mdp -c LipA_b4pr.pdb -p LipA.top -o pr.tpr mdrun -s pr.tpr -o pr.trr -c LipA_b4md.pdb -e pr.edr -g pr.log grompp -f md.mdp -c LipA_b4md.pdb -p LipA.top -o md.tpr mdrun -s md.tpr -o md.trr -c LipA_md.pdb -e md.edr -g md.log 经。
25、过分子动力学模拟发现， 在 400K 温度下， 分析 LipA 与突变体的 RMSD（图 4） ， 证实 Gly52Pro 与 Gly158Pro 可能提高枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的热稳定性。 0022 实施实例 4 本实施例说明构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变株 （Gly52Pro、 Gly158Pro） ， 并验证突变 株的热稳定性， 得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 的方法。 0023 本发明人是通过枯草芽孢杆菌 168 菌株 （Bacillus subtilis 168） 的基因序列， GenBank 登录号为 AL009126.3。设计引物， 通过 PCR 扩增得到脂肪酶 。
26、A 基因。所采用的实 验方法包括聚合酶链式反应 （PCR） 技术 ； DNA 的抽提、 双酶切、 链接等分子操作技术， 以枯草 芽孢杆菌168菌株基因为模版， 扩增出脂肪酶A的基因序列， 把这一段目的基因连接到表达 质粒 pET-22b 上， 然后导入大肠杆菌进行高效表达， 从而获得该基因表达的目的蛋白， 确定 其基因的功能和酶学特性。具体步骤包括 ： 1. 枯草芽孢杆菌 168 菌株的培养 枯草芽孢杆菌 168 菌株 （Bacillus subtilis 168） ， 从中国工业微生物菌种保藏管理 中心购买， 接种于 LB 培养基 （g/L） ： 蛋白胨 10、 酵母粉 5、 NaCl10，。
27、 然后在 37恒温摇床上振 荡培养 10h， 离心收集菌体用于 DNA 的提取。 0024 2. 枯草芽孢杆菌 168 菌株脂肪酶 A 的克隆 通过 NCBI 已报道序列， 设计以下 PCR 引物 ： 引物 1 ： 5 -CCGCATATGGCTGAACACAATC-3 引物 2 ： 5 -CCCAAGCTTATTCGTATTCTGGC-3 。 0025 上下游引物的 5 端分别设计了 Nde 和 Hind 酶切位点用于连接到表达载 体 pET22b， 以枯草芽孢杆菌 168 菌株 DNA 为模版进行 PCR 扩增， PCR 条件为 ; 94 预变性 2 min ； 94 30 秒， 56 3。
28、0 秒， 72 度 2 min ； 35 个循环后 72延伸 10 min。将 PCR 扩增 产物进行电泳检测， 结果表明获得片段约为 629bp， 与预期结果相符， 然后将 PCR 产物纯化 后连接到 Takara 的 pMD20-T 载体上进行测序分析。然后利用 Nde 和 Hind 进行双 酶切操作， 再与同样利用 Nde 和 Hind 进行双酶切的表达载体 pET22b 进行连接， 连 接产物经转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞， 筛选验证得到表达重组质粒 pET22b-LipA。 0026 把表达重组质粒 pET22b-LipA 转化到大肠杆菌 BL21（DE3） 菌株的感受态细胞。
29、中， 挑取转化子于含 50 L/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 在 37 摇床上培养约 2 h， 当 OD600达到 0.6-0.8 时， 加入 IPTG 使其终浓度达到 0.5 mmol/L， 置于 30 摇床上继续培养 6-8 h 进行诱导表达。 0027 发酵液离心收集菌体， 用发酵液同等体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体， 然后使用超 声波破碎细胞， 至菌液澄清后于 12000 rpm/min 条件下离心 15 min 收集上清， 所收集的上 清液即为枯草芽孢杆菌脂肪酶的粗酶液。 0028 分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A大肠杆菌工程菌BL21-pET22b-LipA。 采用 全质。
30、粒扩增的方式进行突变 ： 说 明 书 CN 103966186 A 6 5/5 页 7 引物 1 ： S 链 ： 5 -CGCCATTTATAACAATCCACCGGT-3 A 链 ： 5 -ACCGGTGGATTGTTATAACTTGGG-3 引物 2 ： S 链 ： 5 -CGCCATGTTGGACACATCCCCCT-3 A 链 ： 5 -GCTGTACAGAAGGGGGATGTCTTGGG-3 引物上分别含有 Gly52Pro 和 Gly158Pro， 用 primSTAR 对全质粒进行扩增， PCR 反应液 ： 5*Prime STAR Buffer（Mg+ plus） 10mL， 。
31、dNTP Mixture（各 2.5mM） 4l， Prime2（10M） 1L， 模版 DNA200ng， Prime STAR HS， DNA Polymerase（2.5U/L） 0.5l， 灭菌蒸馏水补 充至 50L。 0029 突变质粒分别转入 DH5， 涂布含有氨苄青霉素的 LB 平板， 转接 LB 液体培养基中 过夜培养， 提取质粒并转入 BL21（DE3） ， 涂布平板， 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶 A 突变菌。 0030 验证突变株的热稳定性， 将原始菌突变菌转接到含有氨苄青霉素的 LB 液体培养 基中， IPTG 诱导产酶， 离心收集细胞， 破碎， 上清液用 Ni 柱分离纯化。。
32、将原始菌与突变菌的 发酵液在 55 下分别保存 5、 60、 120 min 后， 测定残余酶活力。 0031 测定蛋白含量 ： 采用 Bradford 法， 以牛血清蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线， 分 别测定原始菌与突变菌发酵液中蛋白含量。 0032 测定酶活 ： 采用 p-NPP 法测脂肪酶活力， 分别设置空白对照， 240 L 底物溶液， 10 L 酶液 40 下反应 10 min， 波长 405 nm 下测定酶活。突变菌与原始菌酶液分别经过 5、 60、 120 min 保温处理后， 突变菌 （LipAG52P、 LipAG158P） 相对残余酶活是原始菌 （LipA） 的倍数 数据如表 1。 表 1 突变菌相对残余酶活是原始菌 （LipA） 的倍数 Time/min560120 Fold（LipAG52P/LipA）2.71 2.72 2.99 Fold（LipAG158P/LipA）1.76 1.78 2.32 说 明 书 CN 103966186 A 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103966186 A 8 2/3 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103966186 A 9 3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 103966186 A 10 。