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1、(10)授权公告号 CN 102061302 B (45)授权公告日 2012.07.04 CN 102061302 B *CN102061302B* (21)申请号 201010560367.0 (22)申请日 2010.11.26 C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 9/12(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 扬子江药业集团北京海燕药业有 限公司 地址 102206 北京市昌平区生命园路 16 号 (72)发明人 张同 姜松 杨子义 李光伟 岳妙殊 李晓雯 。
2、CN 101487015 A,2009.07.22, 全文 . CN 1539989 A,2004.10.27, 全文 . 查向东等 . 牛肠激酶次特异性识别序列分 析 .安徽农业科学 .2003, 第 31 卷 ( 第 5 期 ), 全文 . Lisheng Peng et al.High-level secretory production of recombinant bovine enterokinase light chain by Pichia pastoris.Journal of Biotechnology .2004, 第 108 卷全文 . (54) 发明名称 肠激酶轻链基。
3、因的合成及其表达产物的制备 方法 (57) 摘要 本发明是有关采用 DNA 重组技术生产的牛肠 激酶轻链蛋白。 该蛋白的编码基因， 具有如序列表 中序列 3 所示， 并进一步公开了牛肠激酶轻链蛋 白的发酵和纯化工艺。利用本发明优化后的发酵 与纯化方法， 以分泌表达的方式成功地表达出高 生物活性的牛肠激酶轻链蛋白蛋白。作为工具蛋 白酶用于融合蛋白的特异性切割， 尤其适用于生 物工程制药业及基因工程、 生物化学、 分子生物学 等研究。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 易方方 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
4、12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 根据毕赤酵母密码子偏好性优化的牛肠激酶轻链基因序列， 为序列表中序列 3。 2. 权利要求 1 所述的基因在构建表达菌株中的应用， 其特征在于 ： 构建表达载体时在 权利要求 1 所述基因 5 端加入 Xho I 位点， 在 Xho I 位点和权利要求 1 所述基因序列间加 入 KEX2 蛋白酶酶切位点 Lys-Arg， 对应的密码子为 AAAAGA， 在权利要求 1 所述基因 3 端加 入 TGA 终止密码子以及 Not I 位点， 连接至经 Xho I 与 Not I 双酶切的 pPIC。
5、ZA 载体中， 电转至宿主菌， 所述宿主菌为毕赤酵母 GS115stab 或 X-33。 3. 一种发酵制备牛肠激酶轻链蛋白的方法， 其特征在于 ： 按照权利要求 2 中构建的含 目的基因的表达载体 pPICZA 电转至毕赤酵母菌中获得阳性克隆 ； 发酵表达的方法为 ： 16L 发酵罐中盛装 10 升 pH5.0 基础培养基， 按照 6 -10的比例接种， 于 30的条件下培 养 16-18h 后， 按 2.0ml/min 流加 50甘油 600ml， 饥饿 0.5h， 菌体湿重为 180-200g/L 时开 始诱导， 诱导时 pH 为 4.0， 前 12h 诱导期内共流加入 10-20g 山。
6、梨醇， 稳定诱导期内按 2ml/ min 加入含有 1体积 PTM1 的甲醇诱导 60-72h， 每 12h 加入 5g 大豆蛋白胨或酸水解酪蛋 白 ； 所述基础培养基为 ： 甘油 40g/L， K2SO4 17.5g/L， MgSO4 14g/L， KOH 3.2g/L， CaSO4 0.8g/ L， PTM1 3ml/L。 权 利 要 求 书 CN 102061302 B 2 1/5 页 3 肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法 技术领域 ： 0001 本发明是有关采用 DNA 重组技术生产的牛肠激酶轻链蛋白， 其关键是肠激酶轻链 基因的克隆以及产物的发酵表达与分离纯化。重组表达的肠。
7、激酶， 作为工具蛋白酶用于融 合蛋白的特异性切割， 尤其适用于生物工程制药业及基因工程、 生物化学、 分子生物学等研 究。 背景技术 ： 0002 肠激酶 (Enterokinase) 是存在于哺乳动物十二指肠内的一种丝氨酸蛋白 酶， 最 早 由 Schepowalnickow 于 1899 年 在 Pavlov 的 实 验 室 发 现 (The Journal of BiologicalChemistry， Vo1.246， August 25， 1971， PP.5031-5039.)。1939 年， Kunitz 证实 了肠激酶是一种胰蛋白酶原激活剂 (J Gen Physiol， Ma。
8、rch 30， 1939)。 0003 迄今为止已从人、 鼠、 猪、 牛等身上纯化出天然的肠激酶， 其中以牛肠激酶的理化 性质研究的最为透彻。牛的肠激酶分子量为 150KD， 由一条 115KD 的重链 ( 结构亚基 ) 和一 条35KD的轻链(催化亚基)以一个二硫键连接而成， 在pH值4.5-9.5、 4-45范围内特异性 水解蛋白底物， 主要机理为 ： 重链把轻链附着在肠粘膜刷状缘上并朝向肠腔， 轻链基团能特 异性识别胰蛋白酶原中 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 序列并在其 C 端水解肽链， 释放出活性胰蛋 白酶。1984 年， Light A 和 Fonseca P 证实 ： 牛。
9、肠激酶轻链仍具有全酶所具有的特异性切割 活性(Light A， Fonseca P.The Journal of Biological Chemistry， 1984， 13195-13198.)。 0004 目前许多具有商业开发价值的药用蛋白质和多肽， 如抗骨质疏松药物重组人甲状 旁腺素 (rhPTH1-34)、 肿瘤坏死因子 -、 磷脂酶 A2、 白细胞介素 -11 等， 均采用融合蛋白 表达， 工艺要求用蛋白酶切割融合蛋白， 释放出目的蛋白， 这为肠激酶提供了广阔的市场空 间。 但天然肠激酶来源有限， 并且从动物组织提取的肠激酶污染有其他蛋白酶， 这给实际应 用带来了困难。这就要求用基因。
10、工程方法生产高纯度的肠激酶。基因工程方法生产的高纯 度肠激酶活性与天然酶相似， 但比天然肠激酶切割速率更快。 0005 牛肠激酶轻链 EKL有 4 对分子内二硫键， 为保证二硫键的正确折叠， 以 E.coli 作 为宿主菌表达 EKL通常采用融合 DsbA、 thioredoxin 等方法使得表达的肠激酶有活性。 0006 La Vallie等在E.coli中， 融合表达促二硫键形成伴侣蛋白DsbA与EKL。 将牛EKL 的 cDNA 序列以编码 EK 的特异性识别位点的序列与 DsbA 序列 3 端相连， 通过自切割加工 就可以得到有活性的 rEKL(The Journal of Biolo。
11、gical Chemistry， 1993， 268 ： 23311.)。 Gasparian等将EKcDNA序列融合在pET32 a Trx下游， 在BL21(DE3)中表达得到融合蛋白， 但无自切割活性， 需要通过蛋白复溶和蛋白复性从包涵体中获得了有活性的重组肠激酶催 化亚基 (Protein ExprPurif， 2003， 31 ： 13)。 0007 真核表达系统 ( 酵母、 CHO 细胞等 ) 能保证较高的二硫键配对正确， 对表达蛋白进 行翻译后修饰， 保证表达产物的生物活性。 同时， 避免了采用大肠杆菌表达系统引入内毒素 的潜在危险。 说 明 书 CN 102061302 B 3。
12、 2/5 页 4 发明内容 ： 0008 本发明的目的在于提供一种肠激酶专用编码基因， 它能够通过分泌表达的方式进 行大量生产， 且具有较高的生物学活性。 0009 包括以下几个步骤 ： 0010 (1) 肠激酶轻链基因的合成 ： 根据 Genebank 中公开的牛肠激酶轻链 EKL核酸序 列 (AY682203)( 序列表序列 1， 简称 SEQ-1) 和氨基酸序列 ( 序列表序列 2， 简称 SEQ-2)， 选 择毕赤酵母偏好的密码子， 人工合成牛肠激酶轻链 EKL的基因序列 3( 序列表序列 3， 简称 SEQ-3)。 0011 (2) 表达载体的构建 ： 在 EKL基因序列 SEQ-3。
13、 的 5 端加入 Xho I 位点， 在 Xho I 位点和 EKL基因序列间加入 KEX2 蛋白酶酶切位点 Lys-Arg 对应的密码子 AAAAGA， 确保 EKL 蛋白分泌到发酵液中时能够切除 - 信号肽， 在 3 端加入 TGA 终止密码子以及 Not I 位 点， 将 DNA 片段和 pPICZA 载体经 Xho I 与 Not I 双酶切、 电泳回收、 连接， 构建表达载体 pPICZA-EKL。 0012 (3)rEKL表达菌株 ： 用Sac I或BstX I线性化pPICZA-EKL， 电转至X-33或GS115 感受态中， 根据 Invitrogen 手册进行单克隆的鉴定和高。
14、表达菌株的筛选。 0013 (4)rEKL工程菌的发酵 ： 所述编码基因电转至毕赤酵母菌发酵表达的优选方法为 ： 16L 发酵罐体系中， 30， pH4.0-6.0， 更优的为 pH5.0， 在基础培养基中培养 16-18h 后， 按 2.5ml/min 流加 50甘油约 600ml， 饥饿 0.2 0.3h， 菌体湿重为 180-200g/L 时开始甲醇 诱导， 优化的诱导 pH 为 4.0-5.0， 最优诱导 pH 为 4.0， 前 12h 诱导期内共流加入 10-20g 甲 醇， 加用少量山梨醇。 稳定诱导期内按2ml/min加入含有1体积微量金属盐培养基(PTM1) 的甲醇诱导 60-。
15、72h， 每 12h 加入 5g 大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白 ； 所述基础培养基为 ： 甘油 40g/L， K2SO4 17.5g/L， MgSO414g/L， KOH 3.2g/L， CaSO4 0.8g/L， PTM1 3ml/L。 0014 (5)rEKL蛋白的表达纯化 ： 发酵上清经 PALL CentramateTM 超滤系统置换缓冲液， 置换溶液为 ： 20-50mM Tris-HCl 或者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 0-50mM， 膜包 选择为 5K 分子量， 面积为 0.1m2。超滤后的溶液经 A 液 ( 缓冲液 ) ： 20-50mM Tris-。
16、HCl 或 者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 0-50mM 平衡过的阴离子层析填料 ( 并不仅限于 Q FF 或 Capto Q)， B 液 ： 50-100mM Tris-HCl 或者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 100-500mM， 洗脱 5-10 个柱体积。洗脱溶液经 20-50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl 0-10mM CaCl2 pH7.5-8.5 平衡过的 Trypsin Inhibitor agarose(Sigma) 或者 trypsin-Sepharose 4B(GE) 层析柱料， B 液 ： 50。
17、-200mM HAc-NaAc 或甲酸 - 甲酸钠、 1-10mM CaCl2、 pH3.0-4.0 洗 脱 5-10 个柱体积。成品置换入 20mM Tris-HCl(pH7.4)、 50mM NaCl、 2mM CaCl2缓冲液中， 分装保存。 0015 本发明选择毕赤酵母偏好密码子， 人工合成了 EKL全长基因序列， 将该基因构建到 毕赤酵母表达载体 pPICZA 上进行分泌表达， 成功的表达出具有较高生物学活性的 rEKL。 通过优化发酵过程中的一系列条件， 如优化了诱导阶段的 pH， 前期诱导采用山梨醇与甲醇 混加， 同时每隔 12h 加入一定量的酸水解酪蛋白， 充当酶解底物， 减少。
18、 rEKL在发酵上清中的 降解。通过优化纯化参数与选择最适的介质材料， 纯化后 rEKL产量达到 2106U/L， 一个单 位 (U) 定义为 23和 20mM Tris-HCl(pH7.4)、 50mM NaCl、 2mM CaCl2缓冲液中， 16 小时切 割 50g 融合蛋白所需要的酶量， 表达量适合规模化生产。 说 明 书 CN 102061302 B 4 3/5 页 5 附图说明 0016 图 1 ： 牛肠激酶轻链 EKL基因重叠 PCR- 酶切合成示意图。 0017 图2 ： 牛肠激酶轻链EKL不同诱导时间段发酵上清酶切结果图。 泳道1为诱导36h， 泳道 2 为诱导 48h， 泳。
19、道 3 为诱导 60h， 泳道 4 为诱导 72h， M 为蛋白 Marker(Invitrogen)。 图 3 ： 牛肠激酶轻链 EKL纯化 SDS-PAGE 电泳图。M. 蛋白 Marker(Invitrogen) ； 1. 发酵上 清超滤浓缩后 ； 2.QFF 流穿 ； 3.QFF 洗脱 ； 4.Trypsin 亲和流穿 ； 5.Trypsin 亲和洗脱。图 4 ： 不同酶量的牛肠激酶轻链 rEKL酶切效果图。底物量相同， M. 蛋白 Marker(Invitrogen) ； 1. 加入 1/64U rEKL； 2. 加入 1/32U rEKL； 3. 加入 1/16U rEKL； 4.。
20、 加入 1/8U rEKL； 5. 加入 1/4UrEKL； 6. 加入 1/2U rEKL； 7. 加入 1U rEKL。 具体实施方式 ： 0018 一、 重组肠激酶表达载体 pPICZA-EKL的构建 0019 1. 重组肠激酶基因的人工合成 0020 根据 Genebank 中公开的牛肠激酶轻链 EKL核酸序列 (AY682203) 和氨基酸序列， 选择毕赤酵母偏好的密码子， 人工合成牛肠激酶轻链EKL的全长基因序列(序列表中SEQ-3 的核苷酸序列 )。 0021 基因序列的全合成采用重叠 PCR 的方法。利用 DNAMAN 分析序列 SEQ-3 的酶 切位点， 找到 2 个天然的酶。
21、切位点 NdeI(CA/TATG)、 PstI(CTGCA/G) 将其分割为 3 段， 即 BS1(183bp)、 BS2(240bp)、 BS3(282bp)。各大段再设计为数个 60-68bp 的寡核苷酸片段进行 合成， 每段寡核苷酸片段相互有 18-20bp 的重叠碱基。对 BS1、 BS2、 BS3 分别设计一对接头 引物 ( 引物两端分别带有上述的天然的酶切位点和保护碱基 )。BS1 与 BS2 用 NdeI 酶切后 连接， 再用 PstI 酶切与 BS3 连接得全长基因片段 ( 见图 1)。EKL基因序列的 5 端带有 Xho I 位点和 KEX2 蛋白酶酶切位点 Lys-Arg 。
22、对应的密码子 AAA AGA， 3 端引物加入 TGA 终止密 码子以及 Not I 位点。 0022 在 EKL基因序列 SEQ-3 的 5 端添加限制性内切酶 Xho I 位点， 在 Xho I 位点和 EKL 基因序列间加入 KEX2 蛋白酶酶切位点 Lys-Arg 对应的密码子 AAAAGA， 确保 EKL蛋白分泌到 发酵液中时能够切除-信号肽， 同时使工程菌表达的EKL具有同牛组织中提取的EKL蛋白 具有一样的 N- 端氨基酸序列。在 3 端加入 TGA 终止密码子以及 Not I 位点， 将 DNA 片段 和 pPICZA 载体经 Xho I 与 Not I 双酶切、 电泳回收、 。
23、连接， 构建表达载体 pPICZA-EKL。 0023 将表达载体 pPICZA-EKL转化至大肠杆菌 TOP10F ( 购自 Invitrogen 公司 ) 中， 在含有 25ng/l Zeocin 抗生素的低盐 LB(LLB) 平板上进行培养约 16h， 挑取单菌落， 在含 有 25ng/lZeocin 的 LLB 液体培养基中培养， 利用 5 AOX1 与 3 AOX1 引物进行 PCR 鉴定， 再提取质粒， 经Xho I与Not I双酶切出含有目的基因大小的片段， 鉴定单菌落中为阳性克 隆， 测序结果与目的基因序列一致。 0024 二、 毕赤酵母 GS115 Stab 或 X-33 生。
24、产 rEKL 0025 1.pPICZA-EKL高表达菌株的筛选 0026 将 pPICZA-EKL用 Sac I 或 BstX I 线性化， 按照 Invitrogen 公司 EasySelect Pichia ExpressionKit 中的方法制备酵母宿主菌感受态， 并电转至毕赤酵母宿主菌 GS115 说 明 书 CN 102061302 B 5 4/5 页 6 Stab或者X-33中， 涂布于含有100ng/l Zeocin抗生素的YPDS平板上， 30下放置3-4天 长出单菌落。 挑选大而饱满的单菌落， 用5 AOX1与3 AOX1引物进行PCR鉴定。 20lPCR反 应体系为 ： 。
25、5 AOX1(10M) 与 3 AOX1(10M) 引物各 0.5l， dNTP( 各 2.5Mm)2l， 10*Taq buffer 2l， TaqDNApolymerase(2.5U/l)0.5l， ddH2O 14.5l。PCR 反应程序为 ： 95， 8min ； 95、 1min， 55、 1min， 72、 1min， 30个循环 ； 7210min。 根据Invitrogen手 册中， pPICZA 等载体整合到酵母基因组的原理， 如果 pPICZA-EKL插入到野生型 GS115 Stab 或者 X-33 自身醇氧化酶基因 5 AOX1 或 3 AOX1 中， 会形成 Mut+。
26、， 即甲醇利用正常表 型 ； 如果pPICZA-EKL替代野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因， 会形成Muts， 即甲醇利用慢表型。2200bp 条带为野生型 GS115 Stab 或者 X-33 自身醇氧化酶基因的 PCR 产物， 1300bp左右条带为插入的载体的PCR产物， 即Mut+有2200bp和1300bp左右的条带， Muts 仅有 1300bp 左右的条带。 0027 对单克隆菌株进行蛋白表达酶活鉴定， 是筛选高表达菌株最直接有效地方式。将 PCR验证含有pPICZA-EKL的阳性克隆菌株分别在BMGY(1Yeast extract， 2peptone， 1。
27、00mMpotassium phosphate， pH 6.0， 1.34 YNB， 4x10-5 biotin， 4x10-5 biotin)30 过夜培养， 接种至含有 50ml BMMY 培养基的 500ml 锥形瓶中， OD600 约为 1-1.2， 30培养， 每隔 24 小时， 补加 1体积的甲醇诱导 72 小时。EKL发酵上清的测活， 诱导不同时间段的 发酵液离心过滤后取 40ul 上清添加 40ul Trx-T1(1mg/ml)， 23酶切 16 小时， 如图 2 所 示。 0028 2.EKL的发酵生产 0029 因 EKL一级结构中有多个碱性蛋白聚集区， 毕赤酵母分泌的 r。
28、EKL在发酵液上清 中易发生降解。我们优化了发酵条件， 前期酵母菌生长约 16-18h 后， 流加适量甘油后饥饿 0.2 0.3h， 改变诱导 pH 值， 以及在诱导过程中添加一些蛋白胨如大豆蛋白胨或酸水解酪 蛋白， 充当酶解底物， 减少上清中 rEKL的降解， 在诱导前期加入适量山梨醇， 有利于酵母分 泌 rEKL。同时， 在流加甲醇的过程中补加 1体积 PTM1 的甲醇诱导。 0030 具体方法为 ： 以筛选到的含有pPICZA-EKL酶活为5105U/L的阳性克隆为例， 上 16L 发酵罐进行发酵。种子液接种量为 6 -10， 转接至装有 10L 基础培养基 ( 甘油 40g/ L， K。
29、2SO417.5g/L， MgSO4 14g/L， KOH 3.2g/L， CaSO4 0.8g/L， PTM1 3ml/L) 的 16L 发酵罐中， 30， pH4.0-6.0， 更优的为 pH5.0， 发酵 16-18h， 待溶氧从接近 0上升到 70-80， 按 2ml/ min 加入 50甘油约 600ml， 饥饿 30mins， 菌体湿重为 180-200g/L 时开始诱导， 优化的诱导 pH为4.0-5.0， 最优诱导pH为4.0， 前12h诱导期内共流加入10-20g山梨醇， 稳定诱导期内 按 2ml/min 加入含有 1体积 PTM1 的甲醇诱导 60-72h， 每 12h 加。
30、入 5g 大豆蛋白胨或酸水 解酪蛋白充当酶解底物， 每隔 12h 取发酵液测湿重和发酵上清， 检测酶活。 0031 三、 rEKL的纯化与活性检测 0032 发酵上清经 PALL CentramateTM 超滤系统置换缓冲液， 置换溶液为 ： 20-50mM Tris-HCl 或者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 0-50mM， 膜包选择为 5K 分子量， 面积 为 0.1m2。超滤后 EKL 的溶液经 A 液 ( 缓冲液 ) ： 20-50mM Tris-HCl 或者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 0-50mM 平衡过的阴离子层析填料 (。
31、 并不仅限于 Q FF 或 Capto Q)， B 液 ： 50-100mMTris-HCl 或者 PBS 缓冲液 pH 7.5-8.5， NaCl 浓度为 100-500mM， 洗脱 5-10 个 柱体积。洗脱溶液经 20-50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl 0-10mM CaCl2pH7.5-8.5 平衡过 说 明 书 CN 102061302 B 6 5/5 页 7 的 Trypsin Inhibitor(Sigma) 或者 trypsin-Sepharose 4B(GE) 层析柱料， B 液 ： 50-200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸钠、 1-10mM CaC。
32、l2、 pH3.0-4.0洗脱5-10个柱体积。 成品置换入20mM Tris-HCl(pH7.4)、 50mM NaCl、 2mM CaCl2 缓冲液中。纯化结果如图 3 所示。 0033 取 50l 1mg/ml Trx-T1 融合蛋白， 分别加入 1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16、 1/32、 1/64 单位 (U) 的 rEKL， 23， 酶切 16h， 如图 4 所示。 说 明 书 CN 102061302 B 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102061302 B 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 102061302 B 9 1/2 页 10 图 1 牛肠激酶轻链 EKL 基因重叠 PCR- 酶切合成示意图 图 2 牛肠激酶轻链 EKL 不同诱导时间段发酵上清酶切结果图 说 明 书 附 图 CN 102061302 B 10 2/2 页 11 图 3 牛肠激酶轻链 EKL 纯化 SDS-PAGE 电泳图。 图 4 不同酶量的牛肠激酶轻链 rEKL 酶切效果图 说 明 书 附 图 CN 102061302 B 11 。