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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410254455.6 (22)申请日 2014.06.10 (83)生物保藏信息 CGMCC 1.10327 2009.12.31 (73)专利权人 河北工业大学 地址 300401 天津市北辰区西平道5340号 河北工业大学 (72)发明人 金红星成文玉李海超 (74)专利代理机构 天津翰林知识产权代理事务 所(普通合伙) 12210 代理人 胡安朋 (51)Int.Cl. C12P 7/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 黎舒婷 (54)。
2、发明名称 以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发酵产甘 露醇的方法 (57)摘要 本发明以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发 酵产甘露醇的方法， 涉及甘露醇的制备方法， 将 榨得的甘蔗汁经离心与过滤， 添加红糖获得甘蔗 汁-红糖滤液， 再经冷灭菌制备得到的无菌的甘 蔗汁-红糖滤液作为培养基待用； 将活化好的肠 膜明串珠菌菌种以1%接菌量加入到无菌的甘蔗 汁-红糖滤液培养基中， 再经培养制得发酵液和 分离纯化制得甘露醇。 本发明方法降低了培养基 的成本， 从而克服了微生物发酵法生产甘露醇的 瓶颈问题。 权利要求书1页 说明书4页 CN 104017831 B 2016.08.24 CN 104017831 B。
3、 1.以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其特征在于步骤如下： 第一步， 以甘蔗汁-红糖为原料制备培养基： (1.1)准备用具： 将夹有0.2 m滤膜的滤器A用牛皮纸包装好， 然后与封口的100mL三角瓶一起放入高压 灭菌锅内， 于121灭菌20分钟， 准备好灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤器A和灭菌的100mL三角 瓶； (1.2)榨甘蔗汁： 称取3350克甘蔗， 去皮后切成条状， 放入果汁机中榨取甘蔗汁； (1.3)甘蔗汁的离心与过滤： 取上一步(1.2)制得的1050mL甘蔗汁液用转速为13000转/分的离心机离心30分钟， 取 得甘蔗汁上清液A1010mL； 再把甘蔗汁上清液。
4、A用夹有0.2 m滤膜的滤器B过滤而获得甘蔗 汁滤液B1005mL； (1.4)添加红糖获得甘蔗汁-红糖滤液： 往上述甘蔗汁滤液B1005mL中加入红糖2.5克并搅拌使其完全溶解， 从而获得甘蔗汁- 红糖滤液C； (1.5)冷灭菌： 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤(1.4)制得的甘蔗汁-红糖滤液C用上述步骤 (1.1)准备好的灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤器A过滤， 制备得到无菌的甘蔗汁-红糖滤液D 1000mL， 在上述步骤(1.1)准备好的灭菌的100mL三角瓶中加入刚制备得到的无菌的甘蔗 汁-红糖滤液D40mL后封口， 作为下一步的培养基待用； 第二步， 用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇： 。
5、(2.1)活化肠膜明串珠菌菌种： 将肠膜明串珠菌以1接菌量加入到已经置于50mL的三角瓶内的10mLMRS培养基中， 振荡培养1216小时； (2.2)接肠膜明串珠菌： 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤(2.1)活化好的肠膜明串珠菌菌种以1接菌 量加入到上述步骤(1.5)经冷灭菌制得的置于100mL三角瓶内的甘蔗汁-红糖滤液D40mL 中； (2.3)培养制得发酵液： 将上述步骤(2.2)接肠膜明串珠菌后的三角瓶置于摇床中， 在30下以120转/分的速 度振荡培养24小时， 制得发酵液40mL； (2.4)分离纯化： 将上述步骤(2.3)培养制得的发酵液40mL用转速为10000转/分的离心。
6、机离心10分钟， 去除菌体沉淀得发酵上清液A37mL； 在发酵上清液A37mL中加入等量体积的乙醇， 用转速 为12000转/分的离心机离心15分钟， 去除葡聚糖沉淀得发酵上清液B74mL， 将发酵上清液B 74mL在4结晶即制得甘露醇1.16克； 上述所用的肠膜明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌， 拉丁文学名是Leuconostoc mesenteroides， 保藏编号： CGMCC1.10327。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104017831 B 2 以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的方法 技术领域 0001 本发明的技术方案涉及甘露醇的制备方法， 具体地说是以甘蔗汁为原料。
7、用肠膜明 串珠菌发酵产甘露醇的方法。 背景技术 0002 甘露醇被广泛的应用于医药、 食品、 化工和电子等行业。 全球甘露醇消费量约占多 元醇总量的11%， 每年约为15万吨。 美国是甘露醇的最大消费国。 其它如欧洲国家， 用于生产 口香糖、 口含片和嘴嚼片的用量均较大。 我国目前甘露醇消费主要是直接用于生产甘露醇 注射液、 药品辅助添加剂和无糖型食品添加剂等。 由于食品行业尤其是口香糖对甘露醇需 求量快速增加， 甘露醇市场容量迅速扩大。 甘露醇在医药行业用量较大， 目前我国仅甘露醇 注射液每年就要消耗甘露醇4500吨， 2003年医药行业消费甘露醇5600吨。 近年来我国肥胖 和糖尿病较为严。
8、重， 而且有越来越严重的趋势， 因此对无糖并具有营养的甜味剂甘露醇需 求潜力巨大， 2004年我国食品及其添加剂领域对甘露醇的需求量约3000吨。 0003 现有技术生产甘露醇的方法主要有四种： 0004 (1)海带提取法： 提取1吨甘露醇约需13-15吨干海带， 生产过程产生大量废水， 能 耗高， 污染严重， 收率低； 0005 (2)催化加氢法： 以蔗糖或葡萄糖为原料的镍(Ni)催化高温高压加氢具有原料来 源稳定， 生产期限不受限制， 成本低， 但是其产率较低， 且伴生的山梨醇不易分离； 0006 (3)酶转化法： 酶法氢化需要在体系中加入价格昂贵的辅酶(NADH)， 不经济； 0007 。
9、(4)微生物发酵法： 自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多， 细菌、 酵母和霉菌 中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。 其中， 用乳酸细菌发酵转化甘露醇， 以甘露醇为主要 产物， 同时产乳酸、 乙酸、 乙醇和二氧化碳， 而不产生其它多元醇等副产物， 因而所得甘露醇 产物易于分离纯化及精制， 并且工艺条件温和， 转化率较高。 同时乳酸细菌是美国FDA认可 的GRAS菌， 是一种相对安全的菌种， 因而用乳酸细菌来生产甘露醇的研发有着明显的优势。 乳酸细菌又分为同型乳酸发酵细菌和异型乳酸发酵细菌， 采用同型乳酸发酵细菌可以只能 将葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、 6-磷酸果糖、 1-磷酸甘露醇等中间化合物转化。
10、为甘露醇， 并且产 量低于异型乳酸发酵细菌； 采用异型乳酸发酵细菌中的明串珠菌则可以将果糖或蔗糖中的 果糖部分直接转化为甘露醇， 例如， CN201310537851.5公开的以红糖为碳源明串珠菌发酵 产甘露醇的方法和CN201410065372.2披露的一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用 方法， 这些方法不但产量高于同型乳酸发酵细菌， 而且因为明串珠菌的染色体基因组大小 只有2Mb左右， 故发酵周期短。 然而CN201310537851.5和CN201410065372.2仍然存在培养 基成本较高的缺陷， 这些缺陷成为微生物发酵法生产甘露醇的瓶颈问题。 发明内容 0008 本发明所要解决。
11、的技术问题是： 提供以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发酵产甘露 醇的方法， 是一种以甘蔗汁为原料的制备培养基和肠膜明串珠菌应用该培养基发酵产甘露 说明书 1/4 页 3 CN 104017831 B 3 醇的方法， 降低了培养基的成本， 从而克服了微生物发酵法生产甘露醇的瓶颈问题。 0009 本发明解决该技术问题所采用的技术方案是： 以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发 酵产甘露醇的方法， 步骤如下： 0010 第一步， 以甘蔗汁-红糖为原料制备培养基： 0011 （1.1） 准备用具： 0012 将夹有0.2 m滤膜的滤器A用牛皮纸包装好， 然后与封口的100mL三角瓶一起放入 高压灭菌锅内， 于12。
12、1灭菌20分钟， 准备好灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤器A和灭菌的100mL 三角瓶； 0013 （1.2） 榨甘蔗汁： 0014 称取3350克甘蔗， 去皮后切成条状， 放入果汁机中榨取甘蔗汁； 0015 （1.3） 甘蔗汁的离心与过滤： 0016 取上一步 （1.2） 制得的1050mL甘蔗汁液用转速为13000转/分的离心机离心30分 钟， 取得甘蔗汁上清液A1010mL； 再把甘蔗汁上清液A用夹有0.2 m滤膜的滤器B过滤而获得 甘蔗汁滤液B1005mL； 0017 （1.4） 添加红糖获得甘蔗汁-红糖滤液： 0018 往上述甘蔗汁滤液B1005mL中加入红糖2.5克并搅拌使其完全溶解，。
13、 从而获得甘 蔗汁-红糖滤液C； 0019 （1.5） 冷灭菌： 0020 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤 （1.4） 制得的甘蔗汁-红糖滤液C用上述步 骤 （1.1） 准备好的灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤器A过滤， 制备得到无菌的甘蔗汁-红糖滤液D 1000mL， 在上述步骤 （1.1） 准备好的灭菌的100mL三角瓶中加入刚制备得到的无菌的甘蔗 汁-红糖滤液D40mL后封口， 作为下一步的培养基待用； 0021 第二步， 用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇： 0022 （2.1） 活化肠膜明串珠菌菌种： 0023 将肠膜明串珠菌以1%接菌量加入到已经置于50mL的三角瓶内的10mLMRS培养基。
14、 中， 振荡培养1216小时； 0024 （2.2） 接肠膜明串珠菌： 0025 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤 （2.1） 活化好的肠膜明串珠菌菌种以1%接 菌量加入到上述步骤 （1.5） 经冷灭菌制得的置于100mL三角瓶内的甘蔗汁-红糖滤液D40mL 中； 0026 （2.3） 培养制得发酵液： 0027 将上述步骤 （2.2） 接肠膜明串珠菌后的三角瓶置于摇床中， 在30下以120转/分 的速度振荡培养24小时， 制得发酵液40mL； 0028 （2.4） 分离纯化： 0029 将上述步骤 （2.3） 培养制得的发酵液40mL用转速为10000转/分的离心机离心10分 钟， 去除菌。
15、体沉淀得发酵上清液A37mL； 在发酵上清液A37mL中加入等量体积的乙醇， 用转 速为12000转/分的离心机离心15分钟， 去除葡聚糖沉淀得发酵上清液B74mL， 将发酵上清 液B74mL在4结晶即制得甘露醇1.16克。 0030 上述以甘蔗汁为原料用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 所用的肠膜明串珠菌 说明书 2/4 页 4 CN 104017831 B 4 的分类命名为肠膜明串珠菌， 拉丁文学名是Leuconostocmesenteroides， 该微生物 （株） 已 于2009年11月由保藏中心收到， 并登记入册， 保藏日期为2009年12月31日， 保藏单位全称是 中国微生物菌种保。
16、藏管理委员会普通微生物中心； 保藏编号： CGMCC1.10327。 中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心于2013年09月12日发出存活性报告书。 0031 本发明的有益效果是： 与现有技术相比， 本发明方法的显著进步如下： 0032 （1） 本发明是属于用乳酸细菌来生产甘露醇的方法， 与现有的海藻提取法、 催化加 氢法和酶转化法相比， 不仅能耗低和收率高， 更主要的是生产过程中没有污染， 是环境友好 的， 符合产业发展方向。 0033 （2） 与现有技术CN201310537851.5、 CN201410065372.2和其它现有技术相比， 本 发明方法的培养基的成本大幅度降低。 。
17、下表列出了本发明方法与现有技术的培养基的成本 对比， 可见本发明方法的经济效益十分突出。 0034 发明本发明CN201310537851.5CN 01410065372.2其它现有技术 培养基甘蔗汁-红糖红糖为碳源的MRS蔗糖为碳源的MRS果糖-葡萄糖为碳源的MRS 成分 （元/升） 1.282.692.733.13 具体实施方式 实施例 0035 第一步， 以甘蔗汁-红糖为原料制备培养基： 0036 （1.1） 准备用具： 0037 将夹有0.2 m滤膜的滤器A用牛皮纸包装好， 然后与封口的100mL三角瓶一起放入 高压灭菌锅内， 于121灭菌20分钟， 准备好灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤。
18、器A和灭菌的100mL 三角瓶； 0038 （1.2） 榨甘蔗汁： 0039 称取3350克甘蔗， 去皮后切成条状， 放入果汁机中榨取甘蔗汁； 0040 （1.3） 甘蔗汁的离心与过滤： 0041 取上一步 （1.2） 制得的1050mL甘蔗汁液用转速为13000转/分的离心机离心30分 钟， 取得甘蔗汁上清液A1010mL； 再把甘蔗汁上清液A用夹有0.2 m滤膜的滤器B过滤而获得 甘蔗汁滤液B1005mL； 0042 （1.4） 添加红糖获得甘蔗汁-红糖滤液： 0043 往上述甘蔗汁滤液B1005mL中加入红糖2.5克并搅拌使其完全溶解， 从而获得甘 蔗汁-红糖滤液C； 0044 （1.5。
19、） 冷灭菌： 0045 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤 （1.4） 制得的甘蔗汁-红糖滤液C用上述步 骤 （1.1） 准备好的灭菌的夹有0.2 m滤膜的滤器A过滤， 制备得到无菌的甘蔗汁-红糖滤液D 1000mL， 在上述步骤 （1.1） 准备好的灭菌的100mL三角瓶中加入刚制备得到的无菌的甘蔗 汁-红糖滤液D40mL后封口， 作为下一步的培养基待用； 0046 第二步， 用肠膜明串珠菌发酵产甘露醇： 说明书 3/4 页 5 CN 104017831 B 5 0047 （2.1） 活化肠膜明串珠菌菌种： 0048 将肠膜明串珠菌以1%接菌量加入到已经置于50mL的三角瓶内的10mLMRS。
20、培养基 中， 振荡培养1216小时； 0049 （2.2） 接肠膜明串珠菌： 0050 在超净工作台的酒精灯附近将上述步骤 （2.1） 活化好的肠膜明串珠菌菌种以1%接 菌量加入到上述步骤 （1.5） 经冷灭菌制得的置于100mL三角瓶内的甘蔗汁-红糖滤液D40mL 中； 0051 （2.3） 培养制得发酵液： 0052 将上述步骤 （2.2） 接肠膜明串珠菌后的三角瓶置于摇床中， 在30下以120转/分 的速度振荡培养24小时， 制得发酵液40mL； 0053 （2.4） 分离纯化： 0054 将上述步骤 （2.3） 培养制得的发酵液40mL用转速为10000转/分的离心机离心10分 钟， 。
21、去除菌体沉淀得发酵上清液A37mL； 在发酵上清液A37mL中加入等量体积的乙醇， 用转 速为12000转/分的离心机离心15分钟， 去除葡聚糖沉淀得发酵上清液B74mL， 将发酵上清 液B74mL在4结晶即制得甘露醇1.16克。 0055 上述实施例中所用的肠膜明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌， 拉丁文学名是 Leuconostocmesenteroides， 该微生物 （株） 已于2009年11月由保藏中心收到， 并登记入 册， 保藏日期为2009年12月31日， 保藏单位全称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心； 保藏编号： CGMCC1.10327。 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于 2013年09月12日发出存活性报告书； 其它原料均通过商购获得。 说明书 4/4 页 6 CN 104017831 B 6 。