技术领域
本发明涉及乳酸菌诱变选育技术领域，尤其涉及一种选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法。
背景技术
当前，低温发酵酸奶由于口感细腻和风味较佳的特点越来越受广大消费者的青睐，归因于低温发酵酸奶(30℃发酵15-18h)避免了高温短时发酵(42℃发酵3-4h)导致的口感粗糙、乳清析出、乳酸菌活菌数偏低、风味不足等质量问题。
酸奶是含活菌的乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售和食用前这一过程中，菌体仍要生长繁殖，发生后酸化现象(postacidification)，即酸奶的pH值继续下降，以至出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降。酸奶后酸化现象导致的结果是酸奶无法长期贮存，酸奶贮存期短的缺陷困扰着酸奶的消费。
因此，亟需寻找一种选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，通过高压诱变方法获得遗传稳定优良的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，包括如下步骤：
步骤S1、乳酸菌菌株的初筛：
将乳酸菌菌株按体积比0.5％-1％接种到乳酸菌培养基中以获得菌液，将所述菌液移至恒温培养箱中恒温培养，从中筛选出活菌数最多的乳酸菌菌株；
步骤S2、突变菌株的获得：
通过高压诱变对步骤S1中所获得的活菌数最多的乳酸菌菌株进行诱变处理，从而获得所述突变菌株；
步骤S3、突变菌株的初筛：
将所述突变菌株涂布于溴甲酚紫碳酸钙平板并将所述溴甲酚紫碳酸钙平板置于恒温培养箱中恒温培养，从中选取生长较慢且产酸较弱的突变菌株；
步骤S4、突变菌株的复筛：
将步骤S3中所获得的生长较慢且产酸较弱的突变菌株接入到脱脂乳中恒温培养，并测定其参数以筛选出优良的突变菌株；
步骤S5、遗传稳定性的检测：
对步骤S4中所获得的优良的突变菌株进行传代培养，检测每代的发酵情况及倒置显微镜下突变菌株形态的稳定性，选取稳定性高的突变菌株，从而获得所述的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
可选地，在步骤S1中，所述恒温培养的温度为30℃。
可选地，在步骤S2中，所述高压诱变的具体处理如下：取对数生长期的菌液，用无菌生理盐水稀释、离心并洗净以获得菌悬液，将所述菌悬液稀释至107cfu/mL,取107cfu/mL菌悬液18mL装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在30℃下经100Mpa-200Mpa处理4-20min。
可选地，所述步骤S2中高压诱变的压力为150Mpa，时间为10min。
可选地，将所述菌悬液装袋的过程采用无菌操作。
可选地，在步骤S3中，所述恒温培养的温度为30℃。
可选地，在步骤S4中，所述恒温培养为在30℃下培养15-18h，所述参数包括质构(TPA)、酸度及PH值。
可选地，所述步骤S1中的乳酸菌菌株为嗜热链球菌。
可选地，所述步骤S1中，每1升乳酸菌培养基包括如下重量的组分：葡萄糖20-40g、蛋白胨11-15g、牛肉膏11-15g以及酵母粉5-8g，其余为蒸馏水，pH值为6.0。
可选地，所述步骤S3中所述溴甲酚紫碳酸钙平板包括如下重量的组分：葡萄糖20-40g、蛋白胨11-15g、牛肉膏11-15g、酵母粉5-8g、碳酸钙30g、 质量分数为1.6％的溴甲酚紫2mL、琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.0-6.8。
本发明的有益效果：
1.本发明通过高压诱变方法获得遗传稳定优良的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株，发酵时间适中；
2.本发明所采用的高压诱变方法具有高效、操作简便、无污染、无毒害、周期短、突变率和正变率较高等优点，更具应用和推广价值；
3.本发明最大产酸量降低了50％、活菌数增长30％，且稳定性可保持至少4代以上，其传代后的菌落还可达到1×108CFU/mL。
4.本发明采用的高压诱变方法可以造成微生物的多样性，同时克服了紫外诱变的光修复现象和化学试剂诱变的有毒有害。
附图说明
图1是本发明实施例的选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法的流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明通过高压诱变方法获得遗传稳定优良的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株，发酵时间适中；
本发明所采用的高压诱变方法具有高效、操作简便、无污染、无毒害、周期短、突变率和正变率较高等优点，更具应用和推广价值；
本发明最大产酸量降低了50％、活菌数增长30％，且稳定性可保持至少4代以上，其传代后的菌落还可达到1×108CFU/mL。
本发明采用的高压诱变方法可以造成微生物的多样性，同时克服了紫外诱变的光修复现象和化学试剂诱变的有毒有害。
本发明提供了一种选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，包括如下步骤：
步骤S1、乳酸菌菌株的初筛：
将乳酸菌菌株按体积比0.5％-1％接种到乳酸菌培养基中以获得菌液，将所述菌液移至恒温培养箱中恒温培养，从中筛选出活菌数最多的乳酸菌菌株。
所述恒温培养的温度为30℃。
其中，每1升乳酸菌培养基包括如下重量的组分：葡萄糖20-40g、蛋白胨11-15g、牛肉膏11-15g以及酵母粉5-8g，其余为蒸馏水，pH值为6.0。
优选地，所述乳酸菌菌株为嗜热链球菌。
步骤S2、突变菌株的获得：
通过高压诱变对步骤S1中所获得的活菌数最多的乳酸菌菌株进行诱变处理，从而获得所述突变菌株。
所述高压诱变的具体处理如下：取对数生长期的菌液，用无菌生理盐水稀释、离心并洗净以获得菌悬液，将所述菌悬液稀释至107cfu/mL,取107cfu/mL菌悬液18mL装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在30℃下经100Mpa-200Mpa处理4-20min。
将所述菌悬液装袋的过程采用无菌操作。
在一个优选实施例中，高压诱变的压力为150Mpa，时间为10min。
步骤S3、突变菌株的初筛：
将所述突变菌株涂布于溴甲酚紫碳酸钙平板并将所述溴甲酚紫碳酸钙平板置于恒温培养箱中恒温培养，从中选取生长较慢且产酸较弱的突变菌株。
所述恒温培养的温度为30℃。
其中，所述溴甲酚紫碳酸钙平板包括如下重量的组分：葡萄糖20-40g、蛋白胨11-15g、牛肉膏11-15g、酵母粉5-8g、碳酸钙30g、质量分数为1.6％的溴甲酚紫2mL、琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.0-6.8。
步骤S4、突变菌株的复筛：
将步骤S3中所获得的生长较慢且产酸较弱的突变菌株接入到脱脂乳中恒温培养，并测定其参数以筛选出优良的突变菌株。
所述恒温培养为在30℃下培养15-18h，所述参数包括质构(TPA)、酸度及PH值。突变菌株在经15-18h培养后，脱脂乳在乳酸菌突变菌株作用下，发酵形成发酵乳，测定发酵乳的质构(TPA)、酸度及PH值以验证突变菌株的发酵性能是否适宜低温下长时间发酵，若测量结果符合要求，那么从中筛选出优良的突变菌株。
步骤S5、遗传稳定性的检测：
对步骤S4中所获得的优良的突变菌株进行传代培养，检测每代的发酵 情况及倒置显微镜下突变菌株形态的稳定性，选取稳定性高的突变菌株，从而获得所述的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
下面将通过具体的实施例来对本发明进行说明。
实施例1
本实施例提供的选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，包括如下步骤：
1、乳酸菌菌株的初筛：
将乳酸菌菌株按体积比0.8％接种到乳酸菌培养基中以获得菌液，将所述菌液移至恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中筛选出活菌数最多的乳酸菌菌株。
其中，每1升乳酸菌培养基包括如下重量的组分：葡萄糖30g、蛋白胨13g、牛肉膏13g以及酵母粉7g，其余为蒸馏水，pH值为6.0。
其中，所述乳酸菌菌株为嗜热链球菌。
步骤S2、突变菌株的获得：
通过高压诱变对步骤S1中所获得的活菌数最多的乳酸菌菌株进行诱变处理，从而获得所述突变菌株。
所述高压诱变的具体处理如下：取对数生长期的菌液，用无菌生理盐水稀释、离心并洗净以获得菌悬液，将所述菌悬液稀释至107CFU/mL,取107CFU/mL菌悬液18mL在无菌操作下装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在30℃下经150Mpa处理10min。
步骤S3、突变菌株的初筛：
将所述突变菌株涂布于溴甲酚紫碳酸钙平板并将所述溴甲酚紫碳酸钙平板置于恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中选取生长较慢且产酸较弱的突变菌株。
其中，所述溴甲酚紫碳酸钙平板包括如下重量的组分：葡萄糖30g、蛋白胨13g、牛肉膏13g、酵母粉7g、碳酸钙30g、质量分数为1.6％的溴甲酚紫2mL、琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.4。
步骤S4、突变菌株的复筛：
将步骤S3中所获得的生长较慢且产酸较弱的突变菌株接入到脱脂乳中 恒温培养，并测定其参数以筛选出优良的突变菌株。
所述恒温培养为在30℃下培养17h，所述参数包括质构(TPA)、酸度及PH值。突变菌株在经17h培养后，脱脂乳在乳酸菌突变菌株作用下，发酵形成发酵乳，测定发酵乳的质构(TPA)、酸度及PH值以验证突变菌株的发酵性能是否适宜低温下长时间发酵，若测量结果符合要求，那么从中筛选出优良的突变菌株。
步骤S5、遗传稳定性的检测：
对步骤S4中所获得的优良的突变菌株进行传代培养，检测每代的发酵情况及倒置显微镜下突变菌株形态的稳定性，选取稳定性高的突变菌株，从而获得所述的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
本实施例中以嗜热链球菌为出发菌株，经本发明的高压诱变方法获得诱变菌株，表1是本发明的出发菌株和诱变菌株的后酸化测定结果。其中，STZ为出发菌株嗜热链球菌，将出发菌株按发酵时间不同作对比，其发酵时间分为5h和17h，发酵时间和后酸化程度与诱变菌株存在显著差异性。YB1为经本发明选育的诱变菌株，YB2为YB1以菌株继代的方式传至第五代的诱变菌株。YB1和YB2的发酵时间均为17小时。参见表1，可以看出，出发菌株在发酵时间延长后，其后酸化程度大大增加，同时乳酸菌数也大大降低。此外，出发菌株的后酸化程度远高于诱变菌株的后酸化程度，其中，YB1和YB2的凝固时间符合工业生产实际情况，后酸化程度有利于延长货架期。并且，YB2在经过传4代后，其后酸化程度与YB1基本无异。
表1 实施例1出发菌株与诱变菌株后酸化测定结果
实施例2
本实施例提供的选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，包括如下步骤：
1、乳酸菌菌株的初筛：
将乳酸菌菌株按体积比1％接种到乳酸菌培养基中以获得菌液，将所述菌液移至恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中筛选出活菌数最多的乳酸菌菌株。
其中，每1升乳酸菌培养基包括如下重量的组分：葡萄糖40g、蛋白胨15g、牛肉膏15g以及酵母粉8g，其余为蒸馏水，pH值为6.0。
其中，所述乳酸菌菌株为嗜热链球菌。
步骤S2、突变菌株的获得：
通过高压诱变对步骤S1中所获得的活菌数最多的乳酸菌菌株进行诱变处理，从而获得所述突变菌株。
所述高压诱变的具体处理如下：取对数生长期的菌液，用无菌生理盐水稀释、离心并洗净以获得菌悬液，将所述菌悬液稀释至107CFU/mL,取107CFU/mL菌悬液18mL在无菌操作下装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在30℃下经200Mpa处理4min。
步骤S3、突变菌株的初筛：
将所述突变菌株涂布于溴甲酚紫碳酸钙平板并将所述溴甲酚紫碳酸钙平板置于恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中选取生长较慢且产酸较弱的突变菌株。
其中，所述溴甲酚紫碳酸钙平板包括如下重量的组分：葡萄糖40g、蛋白胨15g、牛肉膏15g、酵母粉8g、碳酸钙30g、质量分数为1.6％的溴甲酚紫2mL、琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.0。
步骤S4、突变菌株的复筛：
将步骤S3中所获得的生长较慢且产酸较弱的突变菌株接入到脱脂乳中恒温培养，并测定其参数以筛选出优良的突变菌株。
所述恒温培养为在30℃下培养16h，所述参数包括质构(TPA)、酸度及PH值。突变菌株在经16h培养后，脱脂乳在乳酸菌突变菌株作用下，发 酵形成发酵乳，测定发酵乳的质构(TPA)、酸度及PH值以验证突变菌株的发酵性能是否适宜低温下长时间发酵，若测量结果符合要求，那么从中筛选出优良的突变菌株。
步骤S5、遗传稳定性的检测：
对步骤S4中所获得的优良的突变菌株进行传代培养，检测每代的发酵情况及倒置显微镜下突变菌株形态的稳定性，选取稳定性高的突变菌株，从而获得所述的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
本实施例中以嗜热链球菌为出发菌株，经本发明的高压诱变方法获得诱变菌株，表2是本发明的出发菌株和诱变菌株的后酸化测定结果。其中，STZ为出发菌株嗜热链球菌，将出发菌株按发酵时间不同作对比，其发酵时间分为5h和17h，发酵时间和后酸化程度与诱变菌株存在显著差异性。YB3为经本发明选育的诱变菌株，YB4为YB3以菌株继代的方式传至第五代的诱变菌株。YB3和YB4的发酵时间均为16小时。参见表2，可以看出，出发菌株在发酵时间延长后，其后酸化程度大大增加，同时乳酸菌数也大大降低。此外，出发菌株的后酸化程度远高于诱变菌株的后酸化程度，其中，YB1和YB2的凝固时间符合工业生产实际情况，后酸化程度有利于延长货架期。并且，YB2在经过传4代后，其后酸化程度与YB1基本无异。
表2 实施例2出发菌株与诱变菌株后酸化测定结果
实施例3
本实施例提供的选育弱后酸化低温乳酸菌突变菌株的方法，包括如下步 骤：
1、乳酸菌菌株的初筛：
将乳酸菌菌株按体积比0.5％接种到乳酸菌培养基中以获得菌液，将所述菌液移至恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中筛选出活菌数最多的乳酸菌菌株。
其中，每1升乳酸菌培养基包括如下重量的组分：葡萄糖20g、蛋白胨11g、牛肉膏11g以及酵母粉5g，其余为蒸馏水，pH值为6.0。
其中，所述乳酸菌菌株为嗜热链球菌。
步骤S2、突变菌株的获得：
通过高压诱变对步骤S1中所获得的活菌数最多的乳酸菌菌株进行诱变处理，从而获得所述突变菌株。
所述高压诱变的具体处理如下：取对数生长期的菌液，用无菌生理盐水稀释、离心并洗净以获得菌悬液，将所述菌悬液稀释至107CFU/mL,取107CFU/mL菌悬液18mL在无菌操作下装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在30℃下经100Mpa处理20min。
步骤S3、突变菌株的初筛：
将所述突变菌株涂布于溴甲酚紫碳酸钙平板并将所述溴甲酚紫碳酸钙平板置于恒温培养箱中以30℃恒温培养，从中选取生长较慢且产酸较弱的突变菌株。
其中，所述溴甲酚紫碳酸钙平板包括如下重量的组分：葡萄糖20g、蛋白胨11g、牛肉膏11g、酵母粉5g、碳酸钙30g、质量分数为1.6％的溴甲酚紫2mL、琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.8。
步骤S4、突变菌株的复筛：
将步骤S3中所获得的生长较慢且产酸较弱的突变菌株接入到脱脂乳中恒温培养，并测定其参数以筛选出优良的突变菌株。
所述恒温培养为在30℃下培养17h，所述参数包括质构(TPA)、酸度及PH值。突变菌株在经17h培养后，脱脂乳在乳酸菌突变菌株作用下，发酵形成发酵乳，测定发酵乳的质构(TPA)、酸度及PH值以验证突变菌株的发酵性能是否适宜低温下长时间发酵，若测量结果符合要求，那么从中筛选出优良的突变菌株。
步骤S5、遗传稳定性的检测：
对步骤S4中所获得的优良的突变菌株进行传代培养，检测每代的发酵情况及倒置显微镜下突变菌株形态的稳定性，选取稳定性高的突变菌株，从而获得所述的弱后酸化低温乳酸菌突变菌株。
本实施例中以嗜热链球菌为出发菌株，经本发明的高压诱变方法获得诱变菌株，表3是本发明的出发菌株和诱变菌株的后酸化测定结果。其中，STZ为出发菌株嗜热链球菌，将出发菌株按发酵时间不同作对比，其发酵时间分为5h和17h，发酵时间和后酸化程度与诱变菌株存在显著差异性。YB5为经本发明选育的诱变菌株，YB6为YB5以菌株继代的方式传至第五代的诱变菌株。YB5和YB6的发酵时间均为17小时。参见表3，可以看出，出发菌株在发酵时间延长后，其后酸化程度大大增加，同时乳酸菌数也大大降低。此外，出发菌株的后酸化程度远高于诱变菌株的后酸化程度，其中，YB5和YB6的凝固时间符合工业生产实际情况，后酸化程度有利于延长货架期。并且，YB6在经过传4代后，其后酸化程度与YB5基本无异。
表3 实施例3出发菌株与诱变菌株后酸化测定结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。