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1、(10)申请公布号 CN 102558265 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102558265 A *CN102558265A* (21)申请号 201210000824.X (22)申请日 2012.01.04 C07H 19/167(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 正源堂 （天津） 生物科技有限公司 地址 300457 天津市滨海新区经济开发区洞 庭路 220 号天津国际生物医药联合研 究院 5 楼 N511 (72)发明人 卢丽丽 陈剑清 舒特俊 张耀洲 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人。
2、 张艳赞 (54) 发明名称 蛹虫草腺苷的提取方法 (57) 摘要 本发明涉及一种蛹虫草腺苷的提取方法， 属 于生物制品加工技术领域。本发明主要是将蛹虫 草子实体经低温超微粉碎后先进行反复冻融 37 次， 以破坏细胞内部成分， 并进一步损坏蛹虫草细 胞壁 ； 再模拟人体胃肠道酸碱环境， 应用半仿生 提取工艺对蛹虫草中的腺苷进行 3 次连续微波加 热提取， 最后用高效液相色谱仪测定提取液中腺 苷的含量。本发明模拟人体胃肠道酸碱环境进行 蛹虫草腺苷的提取， 酸碱环境不仅有利于腺苷形 成盐， 促进其溶出， 而且， 所获得的腺苷提取率高， 易于后续的分离纯化工艺的进行， 也易于加工成 各种类型的药剂 。
3、； 在生产加工成口服液或其他类 型的剂型之后， 可确保蛹虫草有效成分的直接吸 收， 减轻肠胃负担。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种蛹虫草腺苷的提取方法 , 其特征在于， 所述方法为超微粉碎、 反复冻融、 微波 提取和半仿生提取多种工艺的组合， 具体包括以下步骤 ： (1) 蛹虫草的培养 ： 以蚕蛹为主要原料， 大米为辅料对蛹虫草进行培养 ； (2) 低温超微粉碎 ： 通过低温超微粉碎技术破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁 。
4、； (3) 反复冻融提取 ： 反复冻融超微粉碎粉末 37 次， 以使蛹虫草细胞壁破除更充分， 同 时损坏胞质内的细胞器结构， 以利于蛹虫草中腺苷的溶出 ； (4) 半仿生微波加热提取 ： 分别在 pH 值为 4.55.5 的酸性水， pH 值为 6.57.5 的中性 磷酸钠缓冲液和 pH 值为 8.08.5 的碱性水中对蛹虫草中的腺苷进行 3 次连续提取。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (1) 包括 ： a. 蛹虫草培养基的配制 ： 培养基配方为干蚕蛹粉130140 g/L ； 大米粉6065 g/L ； 磷 酸二氢钾 1.2 1.5g/L ； 磷酸二氢钠 0.。
5、81.2 g/L ； 加水先溶解 KH2PO4、 NaH2PO4、 充分混匀 后再加入上述干蚕蛹粉、 大米粉混合均匀， 匀浆， 分装， 每瓶装 50 ml， 盖好盖子， 于 121， 1.1Mpa 的条件下湿热灭菌 3045 min， 冷却后备用 ； b. 接种 ： 于步骤 a 所得蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种， 其密度为 3 5 个菌球 /mL， 所述蛹虫草培养基与所述蛹虫草菌种的体积比为 50:1， 接种后于 22、 湿度 75 85% 的条 件下避光培养 3 5 天， 使虫草菌丝迅速长满培养基表面， 然后进行以下光照培养 ； 第一阶段生长培养 ： 在生长期第 5 20 天内光照培养， 白。
6、天 12 小时自然光光照， 温度 2022、 湿度 80 85%， 光照强度控制在 100 150Lx ； 晚上 12 小时闭光， 温度 1820、 湿度 75 85%， 每天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风 20 30 分钟 ； 第二阶段生长培养 ： 在生长期第2035天内， 白天12小时自然光加日光灯光照， 温度 2022、 湿度75%85%， 光照强度控制在10001200 Lx ； 晚上12小时闭光， 温度1820、 湿度 75 85%， 每天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风时间为 20 30 分钟 ； c. 收获及再培养 ： 旋开培养瓶盖， 镊子用 75% 酒精消毒后， 。
7、将步骤 b 所得培养基上面的 子实体取出， 将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中， 挑选色泽均匀、 粗壮、 完整的子实体， 去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用 ； 培养瓶中剩余部分按第 2035 天的培 养条件及方法继续培养后用于再次收获 ； d. 烘干 ： 将步骤 c 所得蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中， 均匀铺开， 3037 热风循环烘干待用， 水分含量最终控制在 10% 以下。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 b 中的蛹虫草为 Cordyceps militaris(L.) Link.， 蛹虫草菌种为蛹虫草液体菌种。 4. 根据权利要求 1 所。
8、述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (2) 包括 ： 每次称取100200 g烘干的蛹虫草子实体， 放入超微粉碎机中粉碎310 min， 粉碎时用 210的水作为冷却液， 以降低粉碎温度， 保护蛹虫草中腺苷的活性。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (3) 包括 ： 称取100g150g的蛹虫草超微粉碎粉末， 向该蛹虫草超微粉碎粉末中加入530倍体积 的超纯水后于 -80的冰箱中冷冻 26 小时， 以使细胞内迅速形成大的冰晶， 冷冻结束后于 2060的水浴锅中迅速解冻， 如此反复冻融37次 ； 反复冻融结束后以8000g12000g的离 心力在离心机中离心 530 。
9、分钟， 收集上清， 沉淀自然风干后继续提取。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (4) 包括 ： 权 利 要 求 书 CN 102558265 A 2 2/2 页 3 a. pH 值为 4.55.5 的酸性水的配制 ： 用 36%-38% 的盐酸溶液调节超纯水的 pH 值为 4.55.5 即为酸性水 ； b. pH 值为 6.57.5， 浓度为 0.1mol/L 的的中性磷酸钠缓冲液的配制 ： 准确称取 Na2HPO4.12H2O 35.814g， 溶于 30ml80ml 的超纯水中， 定容至 100ml， 配制成 1mol/L 的磷酸 氢二钠溶液 ； 准确称取Na。
10、H2PO4.2H2O 15.601g溶于30ml80ml的超纯水中， 定容至100ml， 配 制成1mol/L的磷酸二氢钠溶液 ； 将磷酸氢二钠溶液磷酸二氢钠溶液按51:149169:31的比 例混匀至 100ml 后， 稀释至 1000ml， 配制成 pH 值为 6.57.5， 浓度为 0.1moL/L 的磷酸钠缓 冲液 ； c. pH值为8.08.5的碱性水的配制 ： 用氢氧化钠溶液调节超纯水的pH至8.08.5， 配 制成碱性水。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (4) 还包括 ： 按照料液比为 530(m/v) 的比例向反复冻融提取结束后风干的沉淀中加入酸。
11、性水， 于 微波炉中以60%80%的功率加热15钟之后， 以8000g12000g的离心力于室温下离心530 分钟， 收集上清液， 沉淀自然风干 ； 再按照料液比为 530(m/v) 的比例向酸性水提取结束后 自然风干的沉淀中加入 pH 为 6.57.5 的中性磷酸钠缓冲液， 于微波炉中以 60%80% 的功率 加热 15 钟之后， 以 8000g12000g 的离心力于室温下离心 530 分钟， 收集上清液， 沉淀自 然风干 ； 最后向自然风干的沉淀中加入 530 倍体积的碱性水， 于微波炉中以 60%80% 的功 率加热提取 15 分钟， 提取结束后以 8000g12000g 的离心力于室。
12、温下离心 530 分钟， 收 集上清液， 弃去沉淀 ； 合并三次上清液， 过 0.45m 的水系膜后取 100l 加超纯水稀释至 1000l， 过 0.22m 的水系膜后于高效液相色谱仪中测定腺苷的含量。 权 利 要 求 书 CN 102558265 A 3 1/7 页 4 蛹虫草腺苷的提取方法 技术领域 0001 本发明涉及一种蛹虫草腺苷的提取方法， 属于生物制品加工技术领域。 背景技术 0002 蛹虫草， 又名北冬虫夏草， 蛹草， 北虫草， 蛹草菌等， 分类学上属于真菌门， 子囊菌 亚门， 核菌纲， 球壳目， 麦角菌科， 虫草属。 它是中国的一味传统中药， 具有巨大的药用价 值。 0003。
13、 蛹虫草中含有多种化学成分， 具有多种药用功效， 与冬虫夏草的药理功能和临床 效果相似， 但价格却远远低于冬虫夏草， 因此蛹虫草逐渐成为冬虫夏草的替代品， 具有极大 的潜在市场。 0004 常规提取方法如水提法， 水提醇沉法， 醇提法等， 提取过程单一， 无法彻底提取蛹 虫草中的有效成分。 同时这些提取方法在保留有效成分， 弃除无效成分方面， 仍存在提取不 够充分， 有效成分损失大， 工序多， 周期长， 成本高等缺点。 且常规提取方法难以破除蛹虫草 坚硬的细胞壁， 给提取过程带来很大的困难， 造成很大的浪费与损失。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的是提供一种蛹虫草腺苷的提取方法。 。
14、0006 为达到上述目的， 本发明提供一种蛹虫草腺苷的提取方法， 所述方法为超微粉碎、 反复冻融、 微波提取和半仿生提取的组合， 具体包括以下步骤 ： (1) 蛹虫草的培养 ： 以蚕蛹为主要原料， 大米为辅料对蛹虫草进行培养， 包括如下步 骤 ： a. 蛹虫草培养基的配制 ： 培养基配方为干蚕蛹粉130140g/L ； 大米粉6065g/L ； 磷酸 二氢钾 1.2 1.5g/L ； 磷酸二氢钠 0.81.2 g/L ； 加水先溶解 KH2PO4、 NaH2PO4、 充分混匀后再 加入上述干蚕蛹粉、 大米粉混合均匀， 匀浆， 分装， 每瓶装50 ml， 盖好盖子， 于121， 1.1Mpa 的。
15、条件下湿热灭菌 3045 min， 冷却后备用 ； b. 接种 ： 于步骤 a 所得蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种 ( 蛹虫草为 Cordyceps militaris(L.) Link)， 其密度为35个菌球/mL， 所述蛹虫草培养基与所述蛹虫草菌种的 体积比为 50:1， 接种后于 22、 湿度 75 85% 的条件下避光培养 3 5 天， 使虫草菌丝迅 速长满培养基表面， 然后进行以下光照培养 ； 第一阶段生长培养 ： 在生长期第 5 20 天内光照培养， 白天 12 小时自然光光照， 温度 2022 ( 优选为 22 )、 湿度 80 85%， 光照强度控制在 100 150Lx ； 晚。
16、上 12 小时闭光， 温度 1820 ( 优选为 18 )、 湿度 75 85%， 每天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风 20 30 分钟 ； 第二阶段生长培养 ： 在生长期第2035天内， 白天12小时自然光加日光灯光照， 温度 2022 ( 优选为 22 )、 湿度 75% 85%， 光照强度控制在 10001200 Lx ； 晚上 12 小时闭 光， 温度 1820 ( 优选为 18 )、 湿度 75 85%， 每天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风时 说 明 书 CN 102558265 A 4 2/7 页 5 间为 20 30 分钟 ； c. 旋开培养瓶盖， 镊子用75%酒。
17、精消毒后， 将步骤b所得培养基上面的子实体取出， 将 取出的子实体置于干净的不锈钢盘中， 挑选色泽均匀、 粗壮、 完整的子实体， 去除残存的培 养基后置于新的不锈钢盘中称重备用 ； 培养瓶中剩余部分按第 2035 天的培养条件及方法 继续培养后用于再次收获 ； d. 烘干 ： 将步骤 c 所得蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中， 均匀铺开， 3037 热风循环烘干待用， 水分含量最终控制在 10% 以下 ； (2) 低温超微粉碎 ： 每次称取 100g200g 烘干的蛹虫草子实体， 放入超微粉碎机中粉碎 310 分钟， 粉碎时 用 2 10的水作为冷却液， 降低粉碎温度， 保护蛹虫草中的腺苷。
18、 ； (3) 反复冻融提取 ： 称取 100g150g 的蛹虫草超微粉碎粉末， 向蛹虫草超微粉碎粉末 中加入 530 倍体积 （按照 1g 的物料加提取剂 1ml 计算） 的超纯水后于 -80的冰箱中冷 冻 26 小时， 以使细胞内迅速形成大的冰晶， 充分破坏细胞结构 ； 冷冻结束后于 2060 的水浴锅中迅速解冻， 加强细胞的损坏程度 ； 如此反复冻融 37 次， 反复冻融结束后以 8000g12000g 的离心力在离心机中离心 530 分钟， 收集上清， 沉淀自然风干后继续提取 ； (4) 蛹虫草腺苷的半仿生微波加热提取包括 ： a. pH 值为 4.55.5 的酸性水的配制 ： 用 36。
19、%38% 的盐酸溶液调节超纯水的 pH 值为 4.55.5 即为酸性水 ； b. pH值为6.57.5， 浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液的配制 ： 准确称取Na2HPO4.12H2O 35.814g， 溶于 30ml80ml 的超纯水中， 定容至 100ml， 配制成 1mol/L 的磷酸氢二钠溶液 ； 准 确称取 NaH2PO4.2H2O 15.601g 溶于 30ml80ml 的超纯水中， 定容至 100ml， 配制成 1mol/L 的磷酸二氢钠溶液 ； 将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按 51:149169:31 的比例混匀至 100ml 后， 稀释至 1000ml， 配制成 pH。
20、 值为 6.57.5， 浓度为 0.1moL/L 的磷酸钠缓冲液 ； c. pH值为8.08.5的碱性水的配制 ： 用氢氧化钠溶液调节超纯水的pH至8.08.5， 配 制成碱性水 ； d. 提取工艺 ： 按照料液比 （每 g 物料加入 1ml 的提取剂） 为 530(m/v) 的比例向反复 冻融提取结束后风干的沉淀中加入酸性水， 于微波炉中以60%80%的功率加热15钟之后， 以 8000g12000g 的离心力于室温下离心 530 分钟， 收集上清液， 沉淀自然风干 ； 再按照料 液比 （每 g 物料加入 1ml 的提取剂） 为 530(m/v) 的比例向上述酸性水提取结束后自然风干 的沉淀。
21、中加入 pH 为 6.57.5， 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲溶液， 于微波炉中 60%80% 的 功率加热 15 钟之后， 以 8000g12000g 的离心力于室温下离心 530 分钟， 收集上清液， 沉 淀自然风干 ； 最后向自然风干的沉淀中加入 530 倍体积 （每 g 物料加入 1ml 的提取剂） 的 碱性水， 于微波炉中以 60%80% 的功率加热提取 15 分钟， 提取结束后以 8000g12000g 的 离心力于室温下离心 530 分钟， 收集上清液， 弃去沉淀 ； 合并三次上清液， 过 0.45m 的水 系膜后取 100l 加超纯水稀释至 1000l， 过 0.22。
22、m 的水系膜后于高效液相色谱仪中测 定腺苷的含量。 0007 酸碱不断变化的环境有利于腺苷形成盐， 盐更易溶于水， 故而腺苷的提取率也会 有所提高。提取过程采用微波提取技术， 在充分破碎蛹虫草细胞的同时， 强化传质过程， 使 腺苷更大量的溶出， 从而提高腺苷提取率。提取结束后应用高效液相色谱仪测定提取液中 说 明 书 CN 102558265 A 5 3/7 页 6 腺苷的含量。 0008 上述步骤 (4) 中除用微波提法提取外， 还可应用超声波法提取， 震荡提取， 回流加 热等提取方法强化传质过程， 以提高腺苷的溶出率。 0009 本方法采用低温超温粉碎技术破除蛹虫草坚硬的细胞壁， 采用反复。
23、冻融法进一步 破坏细胞结构， 再联合以半仿生提取方法和微波提取技术增加腺苷溶出， 强化传质过程。 不 仅操作简单， 提取周期短， 成本低， 而且腺苷提取率高。 0010 本发明具有以下有益效果 ： 1. 该方法模拟人体胃肠道酸碱环境进行蛹虫草腺苷的提取， 所获得的腺苷易于加工成 各种类型的药剂 ； 在生产加工成口服液或其他类型的剂型之后， 可确保蛹虫草有效成分的 直接吸收， 减轻肠胃负担 ； 2.该方法提取蛹虫草腺苷含量高， 腺苷的含量可达到每g原药材提取得到2.2699mg的 量， 最终活性成分的提取率可高达 0.227%。比其他的常规提取方法提取以固体培养基培养 得到的蛹虫草子实体所得到的。
24、活性组分的提取率都高， 且质量可控， 料损少， 成本低， 生产 周期短， 适合大规模生产， 市场潜力巨大 ； 3. 低温超微粉碎技术破除了蛹虫草坚硬的细胞壁， 有利于细胞内容物的溶出， 有利于 提取过程的顺利进行， 在保证腺苷的生物活性的同时， 提高腺苷的提取率， 减少浪费 ； 反复 冻融则可进一步破坏细胞尤其是细胞壁的结构 ； 以水作为溶剂对蛹虫草子实体中的腺苷进 行三次连续提取不仅有利于更加充分的提取腺苷， 还避开了有害溶剂的污染， 使最终所获 得的提取物安全无毒 ； 4. 应用该方法提取得到的腺苷， 不仅提取率高， 易于后续的分离纯化， 而且易于吸收， 能够充分发挥腺苷在体内的功效。 附。
25、图说明 0011 图 1 为采用普通破碎方法破碎蛹虫草后的扫描电镜图 ； 图 2 为超微低温粉碎后的扫描电镜图 ； 图 3 为腺苷的标准曲线图。 具体实施方式 0012 应该指出， 以下具体说明都是例示性的， 旨在对本发明提供进一步的发明。 除非另 有说明， 本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同 含义。 0013 本发明所述的方法先将蛹虫草子实体用超微粉碎机于低温下超微粉碎， 以破除其 坚硬的细胞壁， 使蛹虫草子实体细胞内溶物充分溶出， 以利于提取过程的顺利进行 ； 采用反 复冻融法进一步破坏细胞结构， 使细胞内溶物更容易溶出细胞 ； 最后运用半仿生方法联合 。
26、微波提取技术进行三次连续提取， 通过酸碱不断变化的环境模拟人体胃肠道环境， 应用微 波所释放出来的能量强化传质过程， 以此来模拟人体胃肠蠕动。腺苷最终的提取率可高达 0.227%。 0014 下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。 0015 实施例 1 ： 蛹虫草的培养 说 明 书 CN 102558265 A 6 4/7 页 7 以蚕蛹为主要原料， 大米为辅料， 加入磷酸盐及水配制成培养基对蛹虫草进行培养。 0016 a. 培养基的配置 ： 本发明的蛹虫草培养基为水溶液， 由如下浓度的成分构成 ： 干蚕蛹粉 140 g/L ； 大米粉 60 g/L ； 磷酸二氢钾 1.2 g/L ； 磷酸。
27、二氢钠 1.2 g/L ； 优选的具体制备方法如下 ： 准确称取干蚕蛹粉 2.1kg， 大米粉 900g， 磷酸二氢钾 18g， 磷酸二氢钠 18g 后， 加纯净水 12 L， 先溶解KH2PO4、 NaH2PO4、 充分混匀后得到体积为15L的培养基溶液， 再加入上述干蚕蛹 粉、 大米粉混合均匀， 匀浆， 分装， 每瓶装 50 ml， 盖好盖子， 于 121， 1.1Mpa 的条件下湿热 灭菌 30 min， 冷却后备用。 0017 b. 接种 ： 于超净台中接种蛹虫草 (Cordyceps militaris(L) Link) 菌种 ( 菌种来 自于苏州蚕桑专科学校， 贡成良教授赠送)， 。
28、液体菌种密度控制在3-5个菌球/mL， 每瓶接种 1 mL， 接种后于22、 湿度7585%的条件下避光培养35天， 使虫草菌丝迅速长满培养 基表面， 然后进行以下光照培养 ； 第一阶段生长培养 ： 在第 5 20 天光照培养， 白天 12 小时光照 ( 用自然光即可 )， 温 度 22、 湿度 80 85%， 光照强度控制在 100 150Lx ； 晚上 12 小时闭光， 温度 18、 湿度 75 85%。每天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风 20 30 分钟 ； 第二阶段生长培养 ： 在第 20 35 天白天 12 小时光照 ( 自然光加日光灯 )， 温度 22、 湿度 75% 85。
29、%， 光照强度控制在 1000 Lx ； 晚上 12 小时闭光， 温度 18、 湿度 75 85%， 每 天通风 2 次， 早晚各一次， 每次通风时间为 20 30 分钟。 0018 注意事项 ： 光照时要用散射光， 而不能用直射光， 虫草的生长有向光性， 处于光照均匀的地方的 瓶子要注意转瓶， 以促进子实体向上生长 ； 在培养过程中要严格控制温度和湿度。若车间没有温控装置， 可通过地面洒水的方 式来控制培养室的温度。培养室的温度不能超过 25 ； 注意通风换气的次数和时间 ； 污染的瓶子要及时拿出处理， 以避免污染的扩大。 0019 c. 收获及再培养 ： 旋开培养瓶盖， 镊子用 75% 酒。
30、精消毒后， 将子实体取出 ( 只取 出培养基上面的部分 )， 将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中， 挑选色泽均匀、 粗壮、 完 整的子实体， 去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用 ； 培养瓶中剩余部分按第 2035 天的培养条件及方法继续培养后可再次收获。 0020 d. 烘干 ： 将蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中， 均匀铺开， 37热风循环 烘干待用， 水分含量最终控制在 10% 以下。 0021 实施例 2 ： 蛹虫草的低温超微粉碎 每次称取 150 g 烘干的蛹虫草子实体， 放入超微粉碎机中， 超微粉碎 6 min， 破碎全过 程用 410的水作为冷却液， 以确保有效成分的。
31、生物活性， 粉碎后取样用扫描电镜检测破 碎效果。普通破碎和超微破碎后的效果分别见图 1 和图 2。通过比较图 1 和图 2 可以明显 看出， 普通破碎后蛹虫草子实体的细胞壁完整， 细胞仍旧成团块聚集。 超微粉碎后的细胞壁 说 明 书 CN 102558265 A 7 5/7 页 8 不完整， 内容物隐约可见， 故超微粉碎后的蛹虫草孢子彻底破碎， 营养成分得到了有效的释 放。 0022 实施例 3 ： 反复冻融提取 称取 100g0.1g 的蛹虫草超微粉碎粉末， 向蛹虫草超微粉碎粉末中加入 10 倍体积的 超纯水 1000ml， 混匀后于 -80的冰箱中冷冻 4 小时， 以使细胞内迅速形成大的冰。
32、晶， 充分 破坏细胞结构 ； 冷冻结束后于 37的水浴锅中迅速解冻， 加强细胞的损坏程度。如此反复 冻融 5 次。反复冻融结束后以 10000g 的离心力在离心机中离心 20 分钟， 收集上清。沉淀 自然风干后继续提取。 0023 实施例 4 ： 腺苷的半仿生提取 半仿生提取是从生物药剂学的角度将整体药物研究法与分子药物研究法相结合， 模 仿口服药物在胃肠道中的转运过程， 采用选定 pH 值的酸性水、 中性磷酸钠盐缓冲液和碱性 水， 依次连续提取得到含高指标成分的活性混合物的中药药效物质提取新技术。 0024 本发明通过设计不同的酸碱环境， 对蛹虫草进行 3 次连续水提， 腺苷含量用高效 液相。
33、色谱仪进行测定。 0025 (1) 提取用溶液的配制 ： pH 值为 5.0 的酸性水的配制 ： 用 38% 的盐酸溶液调节超纯水的 pH 值为 5.0 即为酸性 水。 0026 pH 值为 7.0， 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲液的配制 ： 准确称取 Na2HPO4.12H2O 35.814g， 溶于 70ml 的超纯水中， 定容至 100ml， 配制成 1mol/L 的磷酸氢二钠溶液 ； 准确称 取 NaH2PO4.2H2O 15.601g 溶于 70ml 的超纯水中， 定容至 100ml， 配制成 1mol/L 的磷酸二氢 钠溶液 ； 取磷酸氢二钠溶液 57.7ml 和磷酸二氢。
34、钠溶液 42.3ml 混匀后， 稀释至 1000ml， 配制 成 pH 值为 7.0， 浓度为 0.1moL/L 的磷酸钠缓冲液。 0027 pH 值为 8.0 的碱性水的配制 ： 用氢氧化钠溶液调节超纯水的 pH 至 8.0， 配制成碱 性水。 0028 按照料液比 （每g物料加入1ml的提取剂） 为1 ： 10(m/v)的比例向反复冻融提取结 束后风干的沉淀中加入 1000ml， pH 值为 5.0 的酸性水， 于微波炉中以 60% 的功率加热提取 2 分钟后， 以 10000g 的离心力于室温下离心 20 分钟， 收集上清液， 沉淀自然风干 ； 再按照料 液比 （每 g 物料加入 1ml。
35、 的提取剂） 为 1 ： 10(m/v) 的比例向酸性水提取结束后自然风干的 沉淀中加入1000ml的pH为7.0， 浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液， 以60%的功率微波加 热提取2分钟后， 以10000g的离心力于室温下离心20分钟， 收集上清液， 沉淀自然风干 ； 最 后向自然风干的沉淀中加入 1 ： 10 倍的碱性水 1000ml， 以 60% 的功率微波加热提取 2 分钟， 提取结束后以 10000g 的离心力于室温下离心 20 分钟， 收集上清液， 弃去沉淀 ； 三次连续提 取结束后， 合并三次上清液， 过 0.45m 的水系膜后于 4冰箱中贮存备用。 0029 (2) 色谱。
36、条件 ： Appolo C18柱 (250 mm4.6 mm, 5 m)， 柱温30， 检测波长260nm， 流动相甲醇(色 谱级 100%)0.01mol/L 磷酸钠缓冲液 (pH6.6)15 ： 85， 流速 0.700ml/min， 进样量 10l。 0030 (3) 样品溶液的制备 ： 取 100l 过 0.45m 水系膜后的提取液加超纯水稀释至 1000l， 过 0.22m 的水系 膜后即为样品溶液。 说 明 书 CN 102558265 A 8 6/7 页 9 0031 (4) 腺苷标准品溶液的制备 ： 腺苷标准品购自于天津西恩思公司， 纯度为 99.9%， 将 10mg 的腺苷标。
37、准品溶于 10ml 的 无菌超纯水中， 制备成 1mg/ml 的储备液。 0032 取 12l 的标准贮备液， 用超纯水稀释成 30g/ml 的标准品溶液， 然后再依次稀 释成 10g/ml， 5g/ml， 1g/ml 的标准品溶液。每个浓度的标准品溶液测试 3 次。按照 (2) 色谱条件进样， 以峰面积 Y 对浓度 X(g/ml) 做标准曲线， 得线性回归方程。 0033 3、 提取结果 (1) 腺苷标准品的测定结果见下表 1。 0034 表 1 ： 由表 1 可知， 所有标准品其 RSD 值均小于 15%， 证明仪器精密度良好， 数据可靠程度高。 0035 以峰面积 Y 对浓度 X(g/m。
38、l) 做标准曲线 ( 标准曲线见图 3)， 得线性回归方程 Y=27876X+16842， R2=0.9981， 说明标准曲线线性关系良好。 0036 (3) 样品的测定结果见下表 2。 0037 表 2 ： 峰面积 腺苷浓度 /g/ml每 g 生药中腺苷含量 /g/g 175035 56.7492269.953 说 明 书 CN 102558265 A 9 7/7 页 10 由表 2 可知 ： 采用此方法提取每 g 原药材中可获得 2269.953mg 的腺苷， 提取率为 0.2269%。 0038 以上所述， 仅为本发明的优选实施例， 应当指出， 对于本技术中的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明的核心技术特征的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些润饰和改 进也应属于本发明的专利保护范围。 说 明 书 CN 102558265 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102558265 A 11 。