技术领域
本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基因和应用。
背景技术
血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)是一种特异作用于血管内皮细胞的生长因子的受体，又称作KDR或FLK1。目前发现的VEGFR主要有5种：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、NP-1和NP-2，其中VEGFR-1和VEGFR2主要存在于血管内皮细胞，VEGFR3主要存在于淋巴管内皮细胞。NP-1和NP-2不仅在内皮细胞表达，还表达于某些肿瘤细胞内。但VEGF促血管内皮细胞增殖等生物活性的发挥主要是通过与VEGFR2结合实现。
新生血管的形成在人类的多种疾病中发挥重要作用，如视网膜病变、关节炎、子宫内膜异位症等。肿瘤的生长通常也会伴随着新生血管的形成，早在1971年，J.Folkman就提出可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长及转移，近年来，研究发现，越来越多的恶性肿瘤如前列腺癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌等，其发展、转移、预后与血管内皮细胞生长因子及其受体家族相关，因此，以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤治疗再次受到关注，在受体家族中，以对VEGFR-2为靶点的研究最为广泛。
单克隆抗体以其特异性强、安全性高和效果好等优点成为此类抗肿瘤药物开发的首选。美国礼来公司研发的Cyramza(Ramucirumab)即是一种阻断KDR功能的单克隆抗肿瘤药物。2014年4月美国FDA批准Cyramza治疗经一线化疗(包含铂类或氟尿嘧啶类药物)疾病进展的晚期或转移性胃或胃食管结合部腺癌患者。Cyramza成为美国FDA首个被批准治疗此类患者的药物。目前乳腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌也已处于III期临床试验阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基因和应用。
本发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体，其特征在于，包括重链和轻链，重链包括重链恒定区和重链可变区，轻链包括轻链恒定区和轻链可变区，所述的重链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区，所述的轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区；
所述的重链可变区为蛋白PCABH、H3、H6、H11、H14或H15中的任意一种，所述的轻链可变区为蛋白PCABL、L3、L5、L7、L8、L11或L14中的任意一种；
所述的蛋白PCABH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，
所述的蛋白L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，
所述的蛋白L5的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，
所述的蛋白L7的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，
所述的蛋白L8的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，
所述的蛋白L11的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，
所述的蛋白L14的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，
所述的蛋白H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，
所述的蛋白H6的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，
所述的蛋白H11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，
所述的蛋白H14的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，
所述的蛋白H15的VH氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，
所述的蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
优选，所述的重链可变区为蛋白PCABH，所述的轻链可变区为蛋白L3、L5、L7、L8、L11或L14中的任意一种；或所述的重链可变区为蛋白H3、H6、H11、H14或H15中的任意一种，所述的轻链可变区为蛋白PCABL。
进一步优选，所述的重链可变区为蛋白PCABH，所述的轻链可变区为蛋白L3、L5或L14中的任意一种；或所述的重链可变区为蛋白H14，所述的轻链可变区为蛋白PCABL。这些单克隆抗体在与抗血管内皮生长因子受体VEGFR2结合时体现出了大大好于上市抗体的解离速率。
进一步优选，所述的重链可变区为蛋白PCABH，所述的轻链可变区为蛋白L3、L5、L7、L8或L14中的任意一种；或所述的重链可变区为蛋白H3、H11或H15中的任意一种，所述的轻链可变区为蛋白PCABL。这些单克隆抗体抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的效果大大好于上市抗体。
本发明的第二个目的是提供编码上述抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体的基因。
优选，
所述的编码蛋白PCABH的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7所示，
所述的编码蛋白L3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:23所示，
所述的编码蛋白L5的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:25所示，
所述的编码蛋白L7的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:27所示，
所述的编码蛋白L8的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:29所示，
所述的编码蛋白L11的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:31所示，
所述的编码蛋白L14的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9所示，
所述的编码蛋白PCABL的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:21所示，
所述的编码蛋白H3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:11所示，
所述的编码蛋白H6的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:13所示，
所述的编码蛋白H11的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:15所示，
所述的编码蛋白H14的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:17所示，
所述的编码蛋白H15的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:19所示。
本发明的第三个目的是提供一种单克隆抗体偶联物，其特征在于，包括上述任意一种抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体以及与其偶联的偶联部分，所述的偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素和生物素中的一种或多种。
进一步优选，所述偶联部分为蓖麻毒素。更进一步优选，所述偶联部分为蓖麻毒素A链。
本发明的第四个目的是提供抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体或上述单克隆抗体偶联物在制备与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合，从而阻断VEGF与VEGFR2结合的药物中的应用。
所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。
所述的肿瘤选自直结肠癌、非小细胞肺癌、恶性胶质瘤和肾癌。
本发明的第五个目的是提供一种与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合，从而阻断VEGF与VEGFR2结合的药物，其特征在于，包括上述抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体或上述单克隆抗体偶联物作为活性成份和药学上可以接受的载体或辅料。
所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。
所述的肿瘤选自直结肠癌、非小细胞肺癌、恶性胶质瘤和肾癌。
本发明新发现了一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基因，这些单克隆抗体能够特异的与VEGFR2结合，并且十分有效的阻断VEGF与VEGFR2的结合；细胞生物学活性分析表明，本发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体对VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖具有显著的抑制作用。因此，可以将本发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体应用于制备阻断VEGFR2功能的药物，从而成为一种抗肿瘤的新药物。
附图说明
图1是VEGF-his的SDS-PAGE检测结果，从左至右的泳道样品及其上样量依次为：Reduced：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Non-reduced：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；BSA，1μg；Marker，10μl。
图2是VEGFR2ECD-TEV-mFc的SDS-PAGE检测结果，从左至右的泳道样品及其上样量依次为：Non-reduced：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Reduced：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Marker，10μl；BSA，1μg。
图3是VEGFR2候选抗体的PCABHL3的SDS-PAGE检测结果，从左至右的泳道样品及其上样量依次为：Non-reduced：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Reduced：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Marker，10μl；BSA，1μg。
图4是VEGFR2ECD-TEV-hFc的SDS-PAGE检测结果，从左至右的泳道样品及其上样量依次为：Non-reduced：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Reduced：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品，1μg；Marker，5μl；BSA，1μg。
图5是11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性。
图6是11个人源抗体阻断VEGF-His与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合。
图7是9个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的分子结合动力学分析，HL3、HL5、HL7、HL11、HL14、H3L、H6L、H11L、H14L和PCAB分别表示抗体PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL和PCABHPCABL。
图8是另外2个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-hFc的分子结合动力学分析，HL8、H15L和PCAB分别表示抗体PCABHL8、PCABH15L和PCABHPCABL。
图9是不同浓度VEGF诱导HUVEC细胞增殖的效果。
图10是11个人源抗体对VEGF诱导的细胞增殖的抑制效果，在处理阶段，空白组不加其他任何物质，20nM VEGF组加入终浓度为20nM的VEGF，PcAb、HL14、HL3、HL5、HL7、HL8、HL11、H3L、H6L、H11L、H14L、H15L组加入终浓度为20nM的VEGF，同时分别加入三个不同浓度(1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml)的对应的单克隆抗体PCABHPCABL、PCABHL14、PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL或H15PCABL。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：人源VEGF-his6融合蛋白的设计和制备
1.基因VEGF-his6的合成
对人源VEGF(NCBI Reference Sequence:NP_001020539.2)氨基酸序列与his6进行融合设计。将获得的融合蛋白VEGF-his6所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)进行DNA密码子使用频率优化，并委托金斯瑞生物科技有限公司(以下简称金斯瑞公司)合成优化后的相对应的融合蛋白基因VEGF-his6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.pcDNA3.1-VEGF-his6质粒的获得
2.1由金斯瑞公司将合成的VEGF-his6融合基因(SEQ ID NO:2)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-VEGF-his6质粒。
2.2将质粒pUC57simple-VEGF-his6进行酶切后(Xba I和BamH I)，电泳回收得到的融合基因片段VEGF-his6并与pcDNA3.1载体进行连接反应，重组构建获得pcDNA3.1-VEGF-his6(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司)，转化DH5a感受态大肠杆菌(购自TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3.1-VEGF-his6克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司，操作步骤参照试剂盒说明书)提取获得pcDNA3.1-VEGF-his6重组质粒。
3.融合蛋白VEGF-his6的表达、纯化
将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGF-his6分别转染293F细胞(购自Invitrogen公司)7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用HisTrap HP柱(购自GE公司)，使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测，还原型蛋白样品在20kD处，非还原型蛋白样品在40kD处，如图1所示。还原型电泳条带与理论大小符合，由此得到纯化的人源VEGF-his6融合蛋白。
实施例2：VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白的表达和纯化
1.基因VEGFR2ECD-TEV-mFc的合成
将人源VEGFR2(NCBI Reference Sequence:NM_002253.2)ECD(胞外区)部分的氨基酸序列与TEV-mFc进行融合设计。将获得的融合蛋白所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO:3所示)进行DNA密码子使用频率优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的相对应的融合蛋白基因VEGFR2ECD-TEV-mFc，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc质粒的获得
2.1由金斯瑞公司将合成的VEGFR2ECD-TEV-mFc融合基因(SEQ ID NO:4)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-mFc质粒。
2.2将质粒pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-mFc进行酶切(Xba I和BamH I)后，电泳回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-mFc并与pcDNA3.1载体进行连接反应，重组构建获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司)，转化DH5a感受态大肠杆菌(购自TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司，操作步骤参照试剂盒说明书)提取获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc重组质粒。
3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-mFc的表达、纯化
将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc分别转染293F细胞(购自Invitrogen公司)7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用HiTrap Protein A HP柱(购自GE公司)，使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测，还原型蛋白样品在125kD处，如图2所示。与理论大小符合，由此得到纯化的人源VEGFR2ECD-TEV-mFc融合蛋白。
实施例3：VEGFR2ECD-TEV-hFc蛋白的表达和纯化
1.基因VEGFR2ECD-TEV-hFc的合成
将人源VEGFR2(NCBI Reference Sequence:NM_002253.2)ECD(胞外区)部分的氨基酸序列与TEV-hFc进行融合设计。将获得的融合蛋白所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO:5所示)进行DNA密码子使用频率优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的相对应的融合蛋白基因VEGFR2ECD-TEV-hFc，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc质粒的获得
2.1由金斯瑞公司将合成的VEGFR2ECD-TEV-hFc融合基因(SEQ ID NO:6)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-hFc质粒。
2.2将质粒pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-hFc进行酶切(Xba I和BamH I)后，电泳回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-hFc并与pcDNA3.1载体进行连接反应，重组构建获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司)，转化DH5a感受态大肠杆菌(购自TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司，操作步骤参照试剂盒说明书)提取获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc重组质粒。
3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-hFc的表达、纯化
将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc分别转染293F细胞(购自Invitrogen公司)7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用HiTrap Protein A HP柱(购自GE公司)，使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测，非还原型蛋白样品在125kD处，还原型蛋白样品在125kD处，如图4所示。与理论大小符合，由此得到纯化的人源VEGFR2ECD-TEV-hFc融合蛋白。
实施例4：候选抗体重链和轻链序列的设计、表达和纯化
1.抗体的设计
本发明人根据已有的VEGFR2蛋白序列(SEQ ID NO:3)及其蛋白三维晶体结构等，创造性地人工设计了一系列的抗体序列。通过大量的筛选和检测，最终得到了多个与VEGFR2特异性结合的单克隆抗体：PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL。
上述单克隆抗体：PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL包括重链和轻链，重链包括重链恒定区和重链可变区，轻链包括轻链恒定区和轻链可变区，所述的重链恒定区为人抗体的重链恒定区，所述的轻链恒定区为人抗体的重链恒定区。各个单克隆抗体只是可变区不同。具体如下：
单克隆抗体PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14，其重链可变区都为蛋白PCABH，轻链可变区分别为蛋白L3、L5、L7、L8、L11和L14。
单克隆抗体H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL，其重链可变区分别为蛋白H3、H6、H11、H14、H15，轻链可变区都为蛋白PCABL。
所述的PCABH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
蛋白H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。
蛋白H6的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:13所示。
蛋白H11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:15所示。
蛋白H14的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:17所示。
蛋白H15的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:19所示。
蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:21所示。
蛋白L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:23所示。
蛋白L5的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:25所示。
蛋白L7的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:27所示。
蛋白L8的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:29所示。
蛋白L11的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:31所示。
蛋白L14的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
2.抗体的表达和纯化
将候选单克隆抗体的重链编码基因的DNA序列(包括恒定区和可变区，其中的可变区编码序列如SEQ ID NO：7、11、13、15、17、19所示)和轻链编码基因的的DNA序列(包括恒定区和可变区，其中的可变区编码序列如SEQ ID NO：21、23、25、27、29、31、9所示)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-PCABH，，pUC57simple-H3，pUC57simple-H6，pUC57simple-H11，pUC57simple-H14，pUC57simple-H15和pUC57simple-PCABL，pUC57simple-L3，pUC57simple-L5，pUC57simple-L7，pUC57si mple-L8，pUC57simple-L11，pUC57simple-L14质粒。
分别将以上质粒进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链、轻链分别亚克隆到表达载体pcDNA3.1中(购自Invitrogen公司)，提取重组质粒，按pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L3，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L5，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L7，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L8，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L11，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L14，pcDNA3.1-H3+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H6+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H11+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H14+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H15+pcDNA3.1-PCABL进行组合共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrap MabSelect SuRe柱，使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10，GE)进行纯化。
将纯化后的样品(此处以抗体PCABHL3为例)分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测，还原型蛋白样品目标蛋白在45kD和30KD处，非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在150kD处，如图3所示。与理论大小符合，由此得到纯化的单克隆抗体。
实施例5：11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性分析
1.采用ELISA夹心法分别测定人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc(实施例2制备)的结合活性
每孔加50μl 2μg/ml Goat Anti Mouse Fc(羊抗鼠Fc，Jackson，货号：115-005-071)包被酶标板4℃过夜，将包被的酶标板用磷酸缓冲盐溶液溶解的1％BSA 37℃封闭2小时，PBST洗涤1次后甩干，每孔加入50μl 1μg/ml的VEGFR2ECD-TEV-mFc于37℃预孵育30min，PBST洗涤3次后甩干，每孔分别加入100μl从0.333μg/ml(终浓度0.001μg/ml)起作1:3梯度稀释的11个人源抗体：PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCABHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL(实施例4制备)，共6个抗体梯度浓度组，第7和8组加稀释缓冲液做空白对照，37℃孵育30min，每孔加入50μl HRP标记羊抗人IgG二抗(1:5000)(Jackson，货号：109-035-088)，用TMB(Neogen，货号：308177)进行显色反应5min，并在酶标仪中检测450nm波长吸光度，吸光度检测结果见表1。
表1ELISA夹心法测定11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性结果
根据表1结果，以抗体浓度(nM)为横坐标，以450nm波长吸光强度值为纵坐标，作4-parameter曲线回归拟合图，结果图5所示。由图5可见，11个人源抗体均能有效地结合VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。
通过对结合的不同浓度的人源抗体进行吸光强度定量分析，曲线模拟得到结合效率EC50，如表2所示。
表2ELISA夹心法分析人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合效率EC50
抗体 EC50(nM) PCABHL3 0.034 PCABHL5 0.030 PCABHL7 0.034 PCABHL8 0.070 PCABHL11 0.038 PCABHL14 0.026 H3PCABL 0.044 H6PCABL 0.043 H11PCABL 0.037 H14PCABL 0.046 H15PCABL 0.048
表2结果表明，11个人源抗体均能有效地结合抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc。
2.采用竞争ELISA方法测定11个人源抗体阻断VEGF-His6与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合
用VEGF-His6(实施例1制得)包被酶标板4℃过夜，用磷酸缓冲盐溶液溶解的1％BSA37℃封闭2小时，PBST洗涤1次后甩干作为样品板。提前预备稀释板：将磷酸缓冲盐溶液溶解的1％BSA以每孔300μl加入到新的酶标板中，37℃孵育2小时，PBST洗涤3次后甩干作为稀释板。在稀释板中分别将11个人源抗体：PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCAbHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL(实施例4制备)，从1μg/ml(终浓度0.001μg/ml)起作1:3梯度稀释7个组，第8组加稀释缓冲液做空白对照，每孔准备60μl，分别同60μl的0.04μg/ml的生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc在稀释板中进行抗原抗体混合，混匀后室温静置15分钟后转移至样品板中，每孔转移100μl抗原抗体混合液。37℃孵育30分钟后用PBST洗涤3次后甩干，加入HRP标记的链霉亲和素(KPL，货号：14-30-00)37℃孵育30分钟。PBST洗涤4次后甩干，每孔加入50μl的TMB(Neogen，货号：308177)进行显色，室温遮光反应5分钟。每孔加入50μl的终止液终止反应并迅速在酶标仪上检测450nm的吸光值，检测结果见表3。
表3检测11个人源抗体阻断VEGF-His与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合结果
通过对结合的不同浓度的人源抗体进行吸光强度定量分析，曲线模拟得到结合效率EC50，如表4所示。由图6可见，11个人源抗体均能有效地阻断VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白与VEGF-His的结合，并且其阻断两者结合的效率呈剂量依赖关系。
通过对VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白与VEGF-His的结合进行吸光强度定量分析，曲线模拟得到11个人源抗体阻断两者结合效率EC50，结果见表4。
表4 11个人源抗体阻断VEGF-His与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合EC50
抗体 EC50(nM) PCABHL3 0.236 PCABHL5 0.162 PCABHL7 0.213 PCABHL8 0.568 PCABHL11 0.385 PCABHL14 0.245 H3PCABL 0.228 H6PCABL 0.285 H11PCABL 0.288 H14PCABL 0.222 H15PCABL 0.444
表4结果表明，11个人源抗体通过与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc结合，能有效地阻断其与VEGF-His的结合，并且阻断效率呈剂量依赖关系。
实施例6：分子结合动力学分析
使用Fortebio分子相互作用仪测定抗体9个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的分子结合动力学图谱参数。
抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的产生参见实施例3。
采用氨基偶联的方式固化抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc于AR2G传感器表面，经乙醇胺封闭，于PBST中平衡后，与人源抗体结合，人源抗体浓度从200nM往下三倍稀释，于PBST中解离。分两批共检测了11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc结合的动力学参数。
其中9个抗体的动力学参数见表5，2个抗体的动力学参数见表6，对应的动力学特征参数检测结果分别如图7和图8所示。
表5 9个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc结合的动力学参数
Ab Name KD(M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Rmax Range PCABHL3 2.25E-11 5.81E+05 1.38E+04 1.31E-05 1.08E-05 0.0997-0.2354 PCABHL5 2.88E-11 5.04E+05 1.71E+04 1.45E-05 1.43E-05 0.0912-0.1504 PCABHL7 2.33E-11 1.34E+06 4.39E+04 3.12E-05 1.42E-05 0.0331-0.1512 PCABHL11 6.20E-11 4.81E+05 1.28E+04 2.98E-05 1.13E-05 0.0994-0.1818 PCABHL14 4.37E-11 5.77E+05 1.37E+04 2.52E-05 9.86E-06 0.0882-0.1523 H3PCABL 6.93E-11 6.82E+05 3.02E+04 4.73E-05 1.94E-05 0.0917-0.179 H6PCABL 6.36E-11 7.97E+05 3.05E+04 5.06E-05 1.50E-05 0.0499-0.1309 H11PCABL 8.45E-11 4.78E+05 1.56E+04 4.04E-05 1.30E-05 0.0683-0.2197 H14PCABL 3.14E-11 6.39E+05 2.48E+04 2.00E-05 1.75E-05 0.0247-0.1268 PCABHPCABL 4.93E-11 1.02E+06 2.70E+04 5.03E-05 9.79E-06 0.0011-0.1457
(KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。)
表6另外2个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc结合的动力学参数
Ab Name KD(M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Rmax Range PCABHL8 4.43E-11 4.90E+05 1.19E+04 2.17E-05 1.16E-05 0.1287-0.2755 H15PCABL 9.71E-11 7.11E+05 1.64E+04 6.90E-05 1.07E-05 0.2201-0.3615 PCABHPCABL 2.88E-11 6.55E+05 1.91E+04 1.89E-05 1.34E-05 0.0428-0.1439
(KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。)
表5和表6的结果表明，4种抗体PCABHL3、PCABHL5、PCABHL14和H14PCABL在与抗血管内皮生长因子受体VEGFR2结合时体现出了大大好于上市抗体PCABHPCABL(其重链可变区为蛋白PCABH，轻链可变区为蛋白PCABL)的解离速率。
实施例7：细胞生物学活性分析
VEGF可以特异结合VEGFR2诱导HUVEC细胞的增殖，如果用抗体封闭VEGFR2，即可抑制VEGF诱导的细胞增殖。本实验检测单克隆抗体PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCABHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL对VEGF诱导的细胞增殖的抑制效果。
为了确定适宜的诱导HUVEC细胞的增殖的VEGF浓度，本实验将HUVEC细胞铺于96孔板中，3000cells/well，以含10％FBS HUVEC专用培养基在含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养24h后，将培养基换成1640+2％FBS饥饿培养基并加入不同浓度的VEGF，72h后，用MTT方法进行细胞增殖检测。检测结果见图9，结果表明当VEGF浓度为20nM时，诱导HUVEC细胞的增殖的效果最好，因此选用20nM VEGF进行后续抗体活性实验。
将HUVEC细胞铺于96孔板中，3000cells/well，以含10％FBS HUVEC专用培养基在含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养24h后，将培养基换成1640+2％FBS饥饿培养基并加入相应的药物处理，72h后，用MTT方法进行细胞增殖检测。其中，药物处理步骤中，空白组不加其他任何物质，20nM VEGF组加入终浓度为20nM的VEGF，PcAb、HL14、HL3、HL5、HL7、HL8、HL11、H3L、H6L、H11L、H14L、H15L组加入终浓度为20nM的VEGF，同时分别加入三个不同浓度(1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml)的对应的单克隆抗体PCABHPCABL、PCABHL14、PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL或H15PCABL。MTT检测结果如图10所示。结果表明，检测的11个单克隆抗体均能显著的抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖，1μg/ml浓度的单克隆抗体就表现出抑制HUVEC细胞的增殖的效果，并且随着单克隆抗体浓度升高至25μg/ml，这种抑制效果更加明显。其中，单克隆抗体PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL14、H3PCABL、H11PCABL、H15PCABL抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖的效果最为明显，大大好于上市抗体PCABHPCABL(其重链可变区为蛋白PCABH，轻链可变区为蛋白PCABL)的活性。