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一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基因和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610573836.X (22)申请日 2016.07.19 (71)申请人 中山康方生物医药有限公司 地址 528437 广东省中山市火炬开发区神 农路6号 (72)发明人 王忠民李百勇张鹏夏瑜 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 15/13(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 3

2、8/16(2006.01) (54)发明名称 一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单 克隆抗体及其编码基因和应用 (57)摘要 本发明公开了一类抗血管内皮生长因子受 体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基因和应用。 本 发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克 隆抗体, 包括重链和轻链, 重链包括重链恒定区 和重链可变区, 轻链包括轻链恒定区和轻链可变 区, 所述的重链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区 或人抗体的重链恒定区, 所述的轻链恒定区为小 鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区。 本 发明的单克隆抗体能够特异的与VEGFR2结合, 并 且阻断VEGF与VEGFR2的结合; 细胞生物

3、学活性分 析表明, 其对VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖具有 显著的抑制作用。 因此, 可以将本发明的抗血管 内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体应用于 制备阻断VEGFR2功能的药物, 从而成为一种抗肿 瘤的新药物。 权利要求书2页 说明书12页 序列表13页 附图6页 CN 106188296 A 2016.12.07 CN 106188296 A 1.抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体, 其特征在于, 包括重链和轻链, 重链 包括重链恒定区和重链可变区, 轻链包括轻链恒定区和轻链可变区, 所述的重链恒定区为 小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区, 所述的轻链恒定区为

4、小鼠抗体的轻链恒定 区或人抗体的轻链恒定区; 所述的重链可变区为蛋白PCABH、 H3、 H6、 H11、 H14或H15中的任意一种, 所述的轻链可变 区为蛋白PCABL、 L3、 L5、 L7、 L8、 L11或L14中的任意一种; 所述的蛋白PCABH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示, 所述的蛋白L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示, 所述的蛋白L5的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示, 所述的蛋白L7的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示, 所述的蛋白L8的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示, 所述的蛋白L11的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示

5、, 所述的蛋白L14的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示, 所述的蛋白H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示, 所述的蛋白H6的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示, 所述的蛋白H11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示, 所述的蛋白H14的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示, 所述的蛋白H15的VH氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示, 所述的蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。 2.根据权利要求1所述的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体, 其特征在于, 所述的重链可变区为蛋白PCABH, 所述的轻链可变区为蛋白L3、 L5

6、、 L7、 L8、 L11或L14中的任 意一种; 或所述的重链可变区为蛋白H3、 H6、 H11、 H14或H15中的任意一种, 所述的轻链可变 区为蛋白PCABL。 3.根据权利要求2所述的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体, 其特征在于, 所述的重链可变区为蛋白PCABH, 所述的轻链可变区为蛋白L3、 L5、 L7、 L8或L14中的任意一 种; 或所述的重链可变区为蛋白H3、 H11、 H14或H15中的任意一种, 所述的轻链可变区为蛋白 PCABL。 4.编码权利要求1所述的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体的基因。 5.根据权利要求4所述的基因, 其特征在

7、于, 所述的编码蛋白PCABH的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示, 所述的编码蛋白L3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示, 所述的编码蛋白L5的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示, 所述的编码蛋白L7的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示, 所述的编码蛋白L8的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示, 所述的编码蛋白L11的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示, 所述的编码蛋白L14的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示, 所述的编码蛋白PCABL的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示, 所述的编码蛋白H3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示, 所述的

8、编码蛋白H6的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示, 权利要求书 1/2 页 2 CN 106188296 A 2 所述的编码蛋白H11的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示, 所述的编码蛋白H14的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示, 所述的编码蛋白H15的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。 6.一种单克隆抗体偶联物, 其特征在于, 包括权利要求1的抗血管内皮生长因子受体 VEGFR2的单克隆抗体以及与其偶联的偶联部分, 所述的偶联部分选自放射性核素、 药物、 毒 素、 细胞因子、 酶、 荧光素和生物素中的一种或多种。 7.权利要求1所述的抗血管内皮生长因子受体VEGF

9、R2的单克隆抗体或权利要求6所述 的单克隆抗体偶联物在制备与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合, 从而阻断VEGF与 VEGFR2结合的药物中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用, 其特征在于, 所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助治 疗肿瘤的药物。 9.根据权利要求8所述的应用, 其特征在于, 所述的肿瘤选自直结肠癌、 非小细胞肺癌、 恶性胶质瘤和肾癌。 10.一种与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合, 从而阻断VEGF与VEGFR2结合的 药物, 其特征在于, 包括权利要求1所述的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体或 权利要求6所述的单克隆抗体偶联物作为活性成

10、份和药学上可以接受的载体或辅料。 11.根据权利要求10所述的药物, 其特征在于, 所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助 治疗肿瘤的药物。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106188296 A 3 一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码 基因和应用 技术领域 0001 本发明属于分子免疫学领域, 具体涉及一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单 克隆抗体及其编码基因和应用。 背景技术 0002 血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR2)是一种特异作用于血管内皮细胞的生长因子的受体, 又

11、称作KDR或FLK1。 目前发现 的VEGFR主要有5种: VEGFR-1、 VEGFR-2、 VEGFR-3、 NP-1和NP-2, 其中VEGFR-1和VEGFR2主要存 在于血管内皮细胞, VEGFR3主要存在于淋巴管内皮细胞。 NP-1和NP-2不仅在内皮细胞表达, 还表达于某些肿瘤细胞内。 但VEGF促血管内皮细胞增殖等生物活性的发挥主要是通过与 VEGFR2结合实现。 0003 新生血管的形成在人类的多种疾病中发挥重要作用, 如视网膜病变、 关节炎、 子宫 内膜异位症等。 肿瘤的生长通常也会伴随着新生血管的形成, 早在1971年, J.Folkman就提 出可通过阻断肿瘤血管的生成

12、来抑制肿瘤的生长及转移, 近年来, 研究发现, 越来越多的恶 性肿瘤如前列腺癌、 肝癌、 乳腺癌、 子宫内膜癌及卵巢癌等, 其发展、 转移、 预后与血管内皮 细胞生长因子及其受体家族相关, 因此, 以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤治疗再次受到关 注, 在受体家族中, 以对VEGFR-2为靶点的研究最为广泛。 0004 单克隆抗体以其特异性强、 安全性高和效果好等优点成为此类抗肿瘤药物开发的 首选。 美国礼来公司研发的Cyramza(Ramucirumab)即是一种阻断KDR功能的单克隆抗肿瘤 药物。 2014年4月美国FDA批准Cyramza治疗经一线化疗(包含铂类或氟尿嘧啶类药物)疾病 进展

13、的晚期或转移性胃或胃食管结合部腺癌患者。 Cyramza成为美国FDA首个被批准治疗此 类患者的药物。 目前乳腺癌、 大肠癌、 肝癌、 肺癌也已处于III期临床试验阶段。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编 码基因和应用。 0006 本发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体, 其特征在于, 包括重链 和轻链, 重链包括重链恒定区和重链可变区, 轻链包括轻链恒定区和轻链可变区, 所述的重 链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区, 所述的轻链恒定区为小鼠抗体 的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区; 0007 所述的重

14、链可变区为蛋白PCABH、 H3、 H6、 H11、 H14或H15中的任意一种, 所述的轻链 可变区为蛋白PCABL、 L3、 L5、 L7、 L8、 L11或L14中的任意一种; 0008 所述的蛋白PCABH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示, 0009 所述的蛋白L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示, 0010 所述的蛋白L5的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示, 说明书 1/12 页 4 CN 106188296 A 4 0011 所述的蛋白L7的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示, 0012 所述的蛋白L8的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示, 0

15、013 所述的蛋白L11的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示, 0014 所述的蛋白L14的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示, 0015 所述的蛋白H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示, 0016 所述的蛋白H6的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示, 0017 所述的蛋白H11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示, 0018 所述的蛋白H14的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示, 0019 所述的蛋白H15的VH氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示, 0020 所述的蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。 0021 优选, 所述

16、的重链可变区为蛋白PCABH, 所述的轻链可变区为蛋白L3、 L5、 L7、 L8、 L11或L14中的任意一种; 或所述的重链可变区为蛋白H3、 H6、 H11、 H14或H15中的任意一种, 所述的轻链可变区为蛋白PCABL。 0022 进一步优选, 所述的重链可变区为蛋白PCABH, 所述的轻链可变区为蛋白L3、 L5或 L14中的任意一种; 或所述的重链可变区为蛋白H14, 所述的轻链可变区为蛋白PCABL。 这些 单克隆抗体在与抗血管内皮生长因子受体VEGFR2结合时体现出了大大好于上市抗体的解 离速率。 0023 进一步优选, 所述的重链可变区为蛋白PCABH, 所述的轻链可变区为

17、蛋白L3、 L5、 L7、 L8或L14中的任意一种; 或所述的重链可变区为蛋白H3、 H11或H15中的任意一种, 所述的 轻链可变区为蛋白PCABL。 这些单克隆抗体抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的效果大大好于 上市抗体。 0024 本发明的第二个目的是提供编码上述抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆 抗体的基因。 0025 优选, 0026 所述的编码蛋白PCABH的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7所示, 0027 所述的编码蛋白L3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:23所示, 0028 所述的编码蛋白L5的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:25所示, 0029

18、所述的编码蛋白L7的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:27所示, 0030 所述的编码蛋白L8的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:29所示, 0031 所述的编码蛋白L11的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:31所示, 0032 所述的编码蛋白L14的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9所示, 0033 所述的编码蛋白PCABL的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:21所示, 0034 所述的编码蛋白H3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:11所示, 0035 所述的编码蛋白H6的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:13所示, 0036 所述的编码蛋白H11的核苷酸序列优选如SEQ

19、ID NO:15所示, 0037 所述的编码蛋白H14的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:17所示, 0038 所述的编码蛋白H15的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:19所示。 0039 本发明的第三个目的是提供一种单克隆抗体偶联物, 其特征在于, 包括上述任意 一种抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体以及与其偶联的偶联部分, 所述的偶联 说明书 2/12 页 5 CN 106188296 A 5 部分选自放射性核素、 药物、 毒素、 细胞因子、 酶、 荧光素和生物素中的一种或多种。 0040 进一步优选, 所述偶联部分为蓖麻毒素。 更进一步优选, 所述偶联部分为蓖麻毒素 A链

20、。 0041 本发明的第四个目的是提供抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体或上 述单克隆抗体偶联物在制备与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合, 从而阻断VEGF与 VEGFR2结合的药物中的应用。 0042 所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。 0043 所述的肿瘤选自直结肠癌、 非小细胞肺癌、 恶性胶质瘤和肾癌。 0044 本发明的第五个目的是提供一种与血管内皮生长因子受体VEGFR2特异性结合, 从 而阻断VEGF与VEGFR2结合的药物, 其特征在于, 包括上述抗血管内皮生长因子受体VEGFR2 的单克隆抗体或上述单克隆抗体偶联物作为活性成份和药学上可以

21、接受的载体或辅料。 0045 所述的药物为预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。 0046 所述的肿瘤选自直结肠癌、 非小细胞肺癌、 恶性胶质瘤和肾癌。 0047 本发明新发现了一类抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体及其编码基 因, 这些单克隆抗体能够特异的与VEGFR2结合, 并且十分有效的阻断VEGF与VEGFR2的结合; 细胞生物学活性分析表明, 本发明的抗血管内皮生长因子受体VEGFR2的单克隆抗体对VEGF 诱导的HUVEC细胞的增殖具有显著的抑制作用。 因此, 可以将本发明的抗血管内皮生长因子 受体VEGFR2的单克隆抗体应用于制备阻断VEGFR2功能的药物, 从而成

22、为一种抗肿瘤的新药 物。 附图说明 0048 图1是VEGF-his的SDS-PAGE检测结果, 从左至右的泳道样品及其上样量依次为: Reduced: 还原型蛋白电泳上样缓冲液样品, 1 g; Non-reduced: 非还原型蛋白电泳上样缓冲 液样品, 1 g; BSA, 1 g; Marker, 10 l。 0049 图2是VEGFR2ECD-TEV-mFc的SDS-PAGE检测结果, 从左至右的泳道样品及其上样量 依次为: Non-reduced: 非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品, 1 g; Reduced: 还原型蛋白电泳 上样缓冲液样品, 1 g; Marker, 10 l; BS

23、A, 1 g。 0050 图3是VEGFR2候选抗体的PCABHL3的SDS-PAGE检测结果, 从左至右的泳道样品及其 上样量依次为: Non-reduced: 非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品, 1 g; Reduced: 还原型蛋 白电泳上样缓冲液样品, 1 g; Marker, 10 l; BSA, 1 g。 0051 图4是VEGFR2ECD-TEV-hFc的SDS-PAGE检测结果, 从左至右的泳道样品及其上样量 依次为: Non-reduced: 非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品, 1 g; Reduced: 还原型蛋白电泳 上样缓冲液样品, 1 g; Marker, 5 l; BS

24、A, 1 g。 0052 图5是11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性。 0053 图6是11个人源抗体阻断VEGF-His与生物素标记的VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合。 0054 图7是9个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的分子结合动力学分析, HL3、 HL5、 HL7、 HL11、 HL14、 H3L、 H6L、 H11L、 H14L和PCAB分别表示抗体PCABHL3、 PCABHL5、 PCABHL7、 PCABHL11、 PCABHL14、 H3PCABL、 H6PCABL、 H11PCABL、 H14PCABL和PCABHPCA

25、BL。 0055 图8是另外2个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-hFc的分子结合动力学分析, HL8、 H15L 说明书 3/12 页 6 CN 106188296 A 6 和PCAB分别表示抗体PCABHL8、 PCABH15L和PCABHPCABL。 0056 图9是不同浓度VEGF诱导HUVEC细胞增殖的效果。 0057 图10是11个人源抗体对VEGF诱导的细胞增殖的抑制效果, 在处理阶段, 空白组不 加其他任何物质, 20nM VEGF组加入终浓度为20nM的VEGF, PcAb、 HL14、 HL3、 HL5、 HL7、 HL8、 HL11、 H3L、 H6L、 H11L、 H1

26、4L、 H15L组加入终浓度为20nM的VEGF, 同时分别加入三个不同浓度 (1g/ml、 5 g/ml和25 g/ml)的对应的单克隆抗体PCABHPCABL、 PCABHL14、 PCABHL3、 PCABHL5、 PCABHL7、 PCABHL8、 PCABHL11、 H3PCABL、 H6PCABL、 H11PCABL、 H14PCABL或H15PCABL。 具体实施方式 0058 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 本领域技术人员将会理 解, 下面的实施例仅用于说明本发明, 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 技术或条件者, 按照本领域内的文献所描述的技

27、术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著, 黄 培堂等译的 分子克隆实验指南 , 第三版, 科学出版社)或者按照产品说明书进行。 所用试 剂或仪器未注明生产厂商者, 均为可以通过市场购买获得的常规产品。 0059 实施例1: 人源VEGF-his6融合蛋白的设计和制备 0060 1.基因VEGF-his6的合成 0061 对人源VEGF(NCBI Reference Sequence:NP_001020539.2)氨基酸序列与his6进 行融合设计。 将获得的融合蛋白VEGF-his6所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)进行 DNA密码子使用频率优化, 并委托金斯瑞生物科技有限公司(

28、以下简称金斯瑞公司)合成优 化后的相对应的融合蛋白基因VEGF-his6, 其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 0062 2.pcDNA3.1-VEGF-his6质粒的获得 0063 2.1由金斯瑞公司将合成的VEGF-his6融合基因(SEQ ID NO:2)利用EcoRV平末端 插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中, 获得pUC57simple-VEGF-his6质粒。 0064 2.2将质粒pUC57simple-VEGF-his6进行酶切后(Xba I和BamH I), 电泳回收得到 的融合基因片段VEGF-his6并与pcDNA3.1载体进行连接反应, 重组构

29、建获得pcDNA3.1- VEGF-his6(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司), 转化DH5a感受态大肠杆菌(购自 TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3.1-VEGF-his6克隆菌落, 按照常规方法扩增大肠杆 菌, 然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司, 操作步骤参照试剂盒说明书)提取获得 pcDNA3.1-VEGF-his6重组质粒。 0065 3.融合蛋白VEGF-his6的表达、 纯化 0066 将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGF-his6分别转染293F细胞(购自Invitrogen 公司)7天后, 将培养液进行高速离心、 微孔

30、滤膜抽真空过滤, 根据厂家提供的操作方法采用 HisTrap HP柱(购自GE公司), 使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10, GE)进行纯 化, 纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液, 煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测, 还原型蛋白样品在20kD处, 非还原型蛋白样品在40kD处, 如 图1所示。 还原型电泳条带与理论大小符合, 由此得到纯化的人源VEGF-his6融合蛋白。 0067 实施例2: VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白的表达和纯化 0068 1.基因VEGFR2ECD-TEV-mFc的合成 0069 将人源VEGF

31、R2(NCBI Reference Sequence:NM_002253.2)ECD(胞外区)部分的氨 说明书 4/12 页 7 CN 106188296 A 7 基酸序列与TEV-mFc进行融合设计。 将获得的融合蛋白所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO: 3所示)进行DNA密码子使用频率优化, 并委托金斯瑞公司合成优化后的相对应的融合蛋白 基因VEGFR2ECD-TEV-mFc, 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。 0070 2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc质粒的获得 0071 2.1由金斯瑞公司将合成的VEGFR2ECD-TEV-mFc融合基因(SEQ

32、 ID NO:4)利用 EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中, 获得pUC57simple-VEGFR2ECD- TEV-mFc质粒。 0072 2.2将质粒pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-mFc进行酶切(Xba I和BamH I)后, 电泳 回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-mFc并与pcDNA3.1载体进行连接反应, 重组构建 获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司), 转化DH5a感 受态大肠杆菌(购自TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3

33、.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc克隆菌 落, 按照常规方法扩增大肠杆菌, 然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司, 操作步骤参 照试剂盒说明书)提取获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc重组质粒。 0073 3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-mFc的表达、 纯化 0074 将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc分别转染293F细胞(购自 Invitrogen公司)7天后, 将培养液进行高速离心、 微孔滤膜抽真空过滤, 根据厂家提供的操 作方法采用HiTrap Protein A HP柱(购自GE公司), 使用蛋白纯化液相

34、色谱系统(AKTA Purifier 10, GE)进行纯化, 纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原 型蛋白电泳上样缓冲液, 煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测, 还原型蛋白样品在125kD处, 如图2 所示。 与理论大小符合, 由此得到纯化的人源VEGFR2ECD-TEV-mFc融合蛋白。 0075 实施例3: VEGFR2ECD-TEV-hFc蛋白的表达和纯化 0076 1.基因VEGFR2ECD-TEV-hFc的合成 0077 将人源VEGFR2(NCBI Reference Sequence:NM_002253.2)ECD(胞外区)部分的氨 基酸序列与TEV-hFc进行

35、融合设计。 将获得的融合蛋白所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO: 5所示)进行DNA密码子使用频率优化, 并委托金斯瑞公司合成优化后的相对应的融合蛋白 基因VEGFR2ECD-TEV-hFc, 其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。 0078 2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc质粒的获得 0079 2.1由金斯瑞公司将合成的VEGFR2ECD-TEV-hFc融合基因(SEQ ID NO:6)利用 EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中, 获得pUC57simple-VEGFR2ECD- TEV-hFc质粒。 0080 2.2将质粒p

36、UC57simple-VEGFR2ECD-TEV-hFc进行酶切(Xba I和BamH I)后, 电泳 回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-hFc并与pcDNA3.1载体进行连接反应, 重组构建 获得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司), 转化DH5a感 受态大肠杆菌(购自TIANGEN公司)并筛选得到阳性的pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc克隆菌 落, 按照常规方法扩增大肠杆菌, 然后采用质粒提取试剂盒(购自TIANGEN公司, 操作步骤参 照试剂盒说明书)提取获得pcDNA3.1-VEG

37、FR2ECD-TEV-hFc重组质粒。 0081 3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-hFc的表达、 纯化 0082 将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc分别转染293F细胞(购自 Invitrogen公司)7天后, 将培养液进行高速离心、 微孔滤膜抽真空过滤, 根据厂家提供的操 说明书 5/12 页 8 CN 106188296 A 8 作方法采用HiTrap Protein A HP柱(购自GE公司), 使用蛋白纯化液相色谱系统(AKTA Purifier 10, GE)进行纯化, 纯化后的蛋白分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原 型蛋白电泳上样

38、缓冲液, 煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测, 非还原型蛋白样品在125kD处, 还 原型蛋白样品在125kD处, 如图4所示。 与理论大小符合, 由此得到纯化的人源VEGFR2ECD- TEV-hFc融合蛋白。 0083 实施例4: 候选抗体重链和轻链序列的设计、 表达和纯化 0084 1.抗体的设计 0085 本发明人根据已有的VEGFR2蛋白序列(SEQ ID NO:3)及其蛋白三维晶体结构等, 创造性地人工设计了一系列的抗体序列。 通过大量的筛选和检测, 最终得到了多个与 VEGFR2特异性结合的单克隆抗体: PCABHL3、 PCABHL5、 PCABHL7、 PCABHL8、 PC

39、ABHL11、 PCABHL14、 H3PCABL、 H6PCABL、 H11PCABL、 H14PCABL、 H15PCABL。 0086 上述单克隆抗体: PCABHL3、 PCABHL5、 PCABHL7、 PCABHL8、 PCABHL11、 PCABHL14、 H3PCABL、 H6PCABL、 H11PCABL、 H14PCABL、 H15PCABL包括重链和轻链, 重链包括重链恒定区和 重链可变区, 轻链包括轻链恒定区和轻链可变区, 所述的重链恒定区为人抗体的重链恒定 区, 所述的轻链恒定区为人抗体的重链恒定区。 各个单克隆抗体只是可变区不同。 具体如 下: 0087 单克隆抗体

40、PCABHL3、 PCABHL5、 PCABHL7、 PCABHL8、 PCABHL11、 PCABHL14, 其重链可 变区都为蛋白PCABH, 轻链可变区分别为蛋白L3、 L5、 L7、 L8、 L11和L14。 0088 单克隆抗体H3PCABL、 H6PCABL、 H11PCABL、 H14PCABL、 H15PCABL, 其重链可变区分别 为蛋白H3、 H6、 H11、 H14、 H15, 轻链可变区都为蛋白PCABL。 0089 所述的PCABH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。 0090 蛋白H3的氨基酸序列如SEQ

41、ID NO:12所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 11所示。 0091 蛋白H6的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 13所示。 0092 蛋白H11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 15所示。 0093 蛋白H14的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 17所示。 0094 蛋白H15的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 19所示。 0095 蛋白PCABL

42、的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:21所示。 0096 蛋白L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 23所示。 0097 蛋白L5的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 25所示。 0098 蛋白L7的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 说明书 6/12 页 9 CN 106188296 A 9 27所示。 0099 蛋白L8的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示, 其编码基

43、因的DNA序列如SEQ ID NO: 29所示。 0100 蛋白L11的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 31所示。 0101 蛋白L14的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示, 其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO: 9所示。 0102 2.抗体的表达和纯化 0103 将候选单克隆抗体的重链编码基因的DNA序列(包括恒定区和可变区, 其中的可变 区编码序列如SEQ ID NO: 7、 11、 13、 15、 17、 19所示)和轻链编码基因的的DNA序列(包括恒定 区和可变区, 其中的可变区编码序列如SEQ ID NO: 21

44、、 23、 25、 27、 29、 31、 9所示)分别克隆到 pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中, 分别获得pUC57simple-PCABH, , pUC57simple-H3, pUC57simple-H6, pUC57simple-H11, pUC57simple-H14, pUC57simple-H15和pUC57simple- PCABL, pUC57simple-L3, pUC57simple-L5, pUC57simple-L7, pUC57si mple-L8, pUC57simple-L11, pUC57simple-L14质粒。 0104 分别将以上质粒进行酶

45、切(HindIII&EcoRI), 电泳回收得到的重链、 轻链分别亚克 隆到表达载体pcDNA3.1中(购自Invitrogen公司), 提取重组质粒, 按pcDNA3.1-PCABH+ pcDNA3.1-PCABL, pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L3, pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L5, pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L7, pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L8, pcDNA3.1-PCABH+ pcDNA3.1-L11, pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L14, pcDNA3.1-H3+pcDNA3.

46、1-PCABL, pcDNA3.1- H6+pcDNA3.1-PCABL, pcDNA3.1-H11+pcDNA3.1-PCABL, pcDNA3.1-H14+pcDNA3.1-PCABL, pcDNA3.1-H15+pcDNA3.1-PCABL进行组合共转染293F细胞。 细胞培养7天后, 将培养液通过 高速离心、 上清浓缩后上样至HiTrap MabSelect SuRe柱, 使用蛋白纯化液相色谱系统 (AKTA Purifier 10, GE)进行纯化。 0105 将纯化后的样品(此处以抗体PCABHL3为例)分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液 和非还原型蛋白电泳上样缓冲液, 煮沸后进行S

47、DS-PAGE电泳检测, 还原型蛋白样品目标蛋 白在45kD和30KD处, 非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在150kD处, 如图3所示。 与理论 大小符合, 由此得到纯化的单克隆抗体。 0106 实施例5: 11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性分析 0107 1.采用ELISA夹心法分别测定人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc(实施例2制备) 的结合活性 0108 每孔加50 l 2 g/ml Goat Anti Mouse Fc(羊抗鼠Fc, Jackson, 货号: 115-005- 071)包被酶标板4过夜, 将包被的酶标板用磷酸缓冲盐溶液溶

48、解的1BSA 37封闭2小 时, PBST洗涤1次后甩干, 每孔加入50 l 1 g/ml的VEGFR2ECD-TEV-mFc于37预孵育30min, PBST洗涤3次后甩干, 每孔分别加入100 l从0.333 g/ml(终浓度0.001 g/ml)起作1:3梯度 稀释的11个人源抗体: PCABHL3, PCABHL5, PCABHL7, PCABHL8, PCABHL11, PCABHL14, H3PCABL, H6PCABL, H11PCABL, H14PCABL, H15PCABL(实施例4制备), 共6个抗体梯度浓度组, 第7和8组 加稀释缓冲液做空白对照, 37孵育30min,

49、每孔加入50 l HRP标记羊抗人IgG二抗(1: 5000)(Jackson, 货号: 109-035-088), 用TMB(Neogen, 货号: 308177)进行显色反应5min, 并 说明书 7/12 页 10 CN 106188296 A 10 在酶标仪中检测450nm波长吸光度, 吸光度检测结果见表1。 0109 表1ELISA夹心法测定11个人源抗体与抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的结合活性结果 0110 0111 0112 根据表1结果, 以抗体浓度(nM)为横坐标, 以450nm波长吸光强度值为纵坐标, 作4- parameter曲线回归拟合图, 结果图5所示。 由图5可见, 11个人源抗体均能有效地结合 说明书 8/12 页 11 CN 106188

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