溶菌酶亲和层析凝胶介质的制备方法 本发明是属于化工产品制造领域，特别涉及溶菌酶亲和层析介质的制备技术。
溶菌酶具有广泛的用途：目前溶菌酶的分离纯化大多采用交换层析法，该方法存在操作繁琐设备复杂等问题，如树脂使用后必须再生，层析时需梯度洗脱等过程；另外尚存在纯化倍数及回收率低，浓缩效果不佳等缺点。采用亲和层析法制备溶菌酶，具有高效简便等优点，但往往造价昂贵。现有的亲和层析介质种类很多，但均存在某方面的不足。如：细菌细胞壁酶解产物等与琼脂糖的偶联体：其制备复杂，造价昂贵，在高于70℃的温度下，凝胶颗粒便会融化而受到破坏；几丁质粉和脱氨几丁质粉：均具有很强的非专一性物理吸附，特别是酚类等植物色素，且吸附表面积小。羧甲基—几丁质：在偏碱性条件下溶解，严重影响层析操作，另外由于存在羧甲基造成了严重的非专一性的阳离子交换吸附；几丁质包埋纤维素(CC—纤维素)：制备繁琐，且颗粒细小流速差，不适合层析操作，再者包埋在颗粒表面的几丁质很易脱落；金属离子络合亲和层析介质：介质制备复杂、造价昂贵、具很强的非专一性吸附；免疫亲和层析介质：制备复杂、造价昂贵，对层析操作的要求严格；N—酰化壳聚糖：由于存在一定量未被乙酰化的氨基，从而造成非专一性的阴离子交换吸附。
本发明的目的：寻求一种适合于大规模生产应用，效率高、机械强度好，流速理想，且非专一性吸附小的提取溶菌酶的亲和层析介质，并且这种介质制备简便，成本较低。本发明所述的制备方法将完成本发明所寻求的目的。
本溶菌酶亲和层析凝胶介质是这样制备的：将一定量的壳聚糖(Chitosan又称乙酰几丁质)粉末充分溶解于pH值小于2的醋酸或盐酸溶液中，壳聚糖质量：溶剂体积=1∶15～30，而后加入3—6倍体积地甲醇作为反应介质，搅匀后过滤，除去未溶解的杂质，于滤液中加入低级脂肪酸酐进行凝胶化，脂肪酸酐加入比例为：壳聚糖质量／脂肪酸酐体积=1／15～25，其中合适的脂肪酸酐有：乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐和戊酸酐等。接着将所得的凝胶破碎为凝胶颗粒，将破碎后凝胶颗粒悬浮于5—10％的NaOH或KOH溶液中，40℃以上保温，搅拌除去凝胶颗粒中非N一位的酰化，用水将凝胶颗粒洗至中性并抽干，而后用醋酸或盐酸水溶液悬浮凝胶颗粒，徐徐加入NaNO2或KNO2溶液并不断搅拌，氧化脱去凝胶颗粒内的未酰化的游离氨基，接着用碱调悬浮液pH至中性，用水洗涤凝胶颗粒除去其中残留的酸和盐类等物质，抽干即得溶菌酶亲和层析介质。
为了完全脱去凝胶颗粒的非N—位酰化，凝胶颗粒应在碱性溶液中60℃保温1～3小时。本介质的理化特性：
化学组成：脱氨的N—脂肪酰化壳聚糖。
形状：半透明的凝胶颗粒状。
颜色：浅褐色。
膨胀性：1g干胶的床体积可达30～35ml，其吸水值为12～18g水/g干胶，
因而具较大的表面积。对鸡蛋清溶菌酶的吸附特性：吸附容量可达16．1mg鸡蛋清溶菌酶／g介
质；开放吸附3分钟其吸附量即可达总吸附量的80％左右。稳定性：耐热(100℃水浴中稳定存在)、耐稀酸稀碱；且在不同的pH值、
压力和离子强度下床体积几乎不发生变化。流速：较为理想，如在3．0×30cm床体积的层析条件下，最大流速可达
20ml／min，非常利于快速洗涤残留于凝胶颗粒表面的杂蛋白，使得
层析操作更为方便。实施例：
取5克的壳聚糖(Chitosan)粉末溶于100ml 10％的冰醋酸溶液中，充分溶解后，加入425ml的甲醇，搅匀，两层纱布过滤，除去未溶解的杂质，随后加入18ml的乙酸酐，迅速搅匀，放置3hr后，成凝胶状，取出将凝胶在捣碎机中捣碎至适当大小的颗粒，用清水洗去甲醇冰醋酸等杂质至中性后抽干。
将抽干的凝胶颗粒完全浸泡在600ml 5％的NaOH溶液中，60℃水浴中保温2hr，用清水洗至中性并抽干，而后用800ml的6％醋酸溶液悬浮凝胶颗粒，徐徐加入15ml 2％的NaNO2溶液并不断搅拌，30min后，用NaOH调悬浮液pH至中性；蒸馏水洗涤凝胶颗粒并抽干；于含有NaN3的水溶液或冻干保存备用。
若想大量制备层析介质只要将上述各组分的用量相应放大即可。提取鸡蛋清溶菌酶的应用实例：
将20mL新鲜的鸡蛋清用5mmol／L NaHCO3溶液稀释至400mL，搅拌均匀，两层纱布过滤，滤液中加入适量抽干的凝胶吸附剂(先经5mmol／L NaHCO3溶液平衡)，开放搅拌100 min(室温)，倒在尼龙布上用5mmol／L NaHCO3(内含0．2mol／L NaCl)溶液洗涤4～5次，装柱(2cm×22cm)，用0．1mol／L HAc洗脱，收集活性部分，即为纯化的鸡蛋清溶菌酶。
本发明系壳聚糖经N—酰化和脱氨两步骤制成，同几丁质粉和脱氨几丁质相比其消除天然几丁质粉中存在的蜂窝状多孔结构，从而克服了对杂蛋白和色素的物理吸附作用；另外脱氨处理可除去凝胶颗粒中少许未酰化的带电的—NH+3基团，从而消除了非特异性的离子交换吸附；上述两方面大大地提高了层析介质对溶菌酶的吸附专一性。其对溶菌酶的纯化效率高，浓缩效果极佳；所得的纯化酶活力大于75000U／mg蛋白，活力回收大于70％(以乙酰化的凝胶为亲和层析介质，从新鲜鸡蛋清中纯化溶菌酶，其中活力测定按Sigma公司的标准)。
使用本介质纯化操作简便：使用后的介质用蒸馏水冲洗数次后即可再用，十分方便；直接从鸡蛋清开始经一次的亲和层析步骤，便可获得高纯度的酶。
本介质的制备简单，成本低廉。