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1、(10)申请公布号 CN 102021247 A (43)申请公布日 2011.04.20 CN 102021247 A *CN102021247A* (21)申请号 201010578687.9 (22)申请日 2010.12.08 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 林瑞庆 李娟 赵光辉 陈芬 邹丰才 翁亚彪 宋慧群 袁子国 朱兴全 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种鉴别日本。
2、血吸虫的引物、 相应的试剂盒 及检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鉴别日本血吸虫的引物、 相应的试剂盒及检测方法。本发明用于鉴别日本 血吸虫的上游引物序列如 SEQIDNO:1 所示， 下游 引物序列如 SEQIDNO:2 所示。本发明还建立了用 于快速检测日本血吸虫的方法， 可准确区分不同 类型的血吸虫。 将本发明引物制备成试剂盒， 具有 操作程序简单化， 检测特异性强， 敏感度高， 结果 判定客观等优点， 适合推广应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 CN 102。
3、021261 A1/1 页 2 1. 一种用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型日本血吸虫的引物，其特征在于上游引物 序列如 SEQ ID NO:1 所示，下游引物序列如 SEQ ID NO:2 所示。 2.一种试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型 日本血吸虫的引物。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分 ： （1） DNA 裂解液 ：核裂解液、EDTA、蛋白酶 K 和 RNase A 溶液的混合溶液 ； （2） PCR 反应液 ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和 MgCl2的 混合溶液 ； （3） 日本血吸虫山区型 。
4、DNA 对照和湖沼型 DNA 对照。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分 ： （1） DNA 裂解液，27.5mL ：为 100 个反应的 200L 核裂解液、50l pH 8.0 的 0.5mol/L 的 EDTA、20l 蛋白酶 K 和 5L RNase A 溶液的混合溶液 ； （2） PCR 反应液，2.5mL ：为终浓度 200mol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP， 终浓度 0.25pmol/L 的上游引物和下游引物，2mmol/L 的 MgCl2的混合溶液 ； （3） 日本血吸虫山区型 DNA 对照 100L 和湖沼型 DNA 对照 100。
5、L ； （5） Taq DNA 聚合酶，5U/L，25L。 5. 权利要求 24 所述试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤 ： （1） 日本血吸虫 DNA 的提取 ； （2）PCR扩增 ：按照扩增样品数取PCR反应液、Taq酶混合，混匀，分装 ；将阳、 阴性对照液分别加入一个管中，取各样品的 DNA 加入对应反应管中 ；离心混匀，置于 PCR 扩增仪上反应 ； （3）PCR 产物观察 ：取扩增后的 PCR 产物加样于 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，90V 电压电泳 3h 后置于胶片观察灯上观察结果并拍照分析。 6. 根据权利要求 5 所述试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（2） 中所述 PCR。
6、 扩增 条件为 ：94预变性 5min ；94变性 30sec、56退火 30sec、72延伸 30sec，35 个循 环 ；72后延伸 10min。 7.利用权利要求1所述引物鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的方法，其特征在于所述 方法包括如下步骤 ： （1） 日本血吸虫 DNA 提取 ； （2） 用权利要求 1 所述特异性检测引物进行 PCR 扩增 ； （3） 扩增产物用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶检测，胶片观察灯上观察，条带与山区 型 DNA 对照相一致的即为山区型日本血吸虫，条带与湖沼型日本血吸虫相一致的即为湖 沼型日本血吸虫 ； （4） PCR 扩增条件为 94预变性 5 min ；94变。
7、性 30 sec、56退火 30 sec、72 延伸 30 sec，35 个循环 ；72后延伸 10 min。 8. （5） 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳为 90V 电压下电泳 3h。 权 利 要 求 书 CN 102021247 A CN 102021261 A1/5 页 3 一种鉴别日本血吸虫的引物、 相应的试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及检验检测领域，具体涉及一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂 盒及检测方法。 背景技术 0002 日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的人兽共患性寄生虫病，呈世界性分布，造 成了很大的经济损失，具有重要的公共卫生和社会经济意义。 在我国，该病主要。
8、流行于 长江流域及其以南的地区，除上海、浙江、福建、广西和广东省达到血吸虫病阻断标准 外，江苏、安徽、江西、湖北、湖南、云南和四川 7 个省份仍较为严重。 据统计，受此 病威胁人口达 6000 万，其中仅慢性病人就达 80 多万。 2004 年，我国将血吸虫病与结核 病、艾滋病一起列为最重要的三大人类传染病。 近年来，全球气候变暖、泥石流及洪水 频繁爆发以及实施南水北调工程所引起的水位、气候、植被及微生物等生态环境要素变 化对血吸虫唯一中间宿主钉螺的分布产生了重大影响，使得疫情有所扩散及回升趋势， 给血吸虫病防治工作带来新的严峻挑战。 0003 大量研究表明中国大陆日本血吸虫的种群遗传结构与时。
9、空分布有密切关系。 由 于自然环境长期阻隔，其种群关系大体分为山区（四川和云南） 和湖沼（安徽、江西、 湖北、浙江和湖南） 两个地域类型。 由于气候、环境及中间宿主分布的变化，山区型 和湖区型日本血吸虫的基因交流频率逐渐增加，使得不同地区分离株的变异呈现不规律 性。 因而，准确有效的鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫，建立相应的基因信息库并依此 建立我国日本血吸虫溯源检测方法，将为开展血吸虫病的分子流行病学研究和诊断，以 及新发、输入或变异病原体的发生发展规律研究提供重要的理论基础。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种可以鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物。 0005 本发明另一目的在于提。
10、供一种含有上述鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物 的检测试剂盒。 0006 本发明还有一个目的在于提供一种鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的检测方 法。 0007 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现 ： 本发明通过对来自于不同流行区的日本血吸虫分离株进行线粒体全基因组序列测定 及初步比对分析，发现了线粒体基因组序列中存在一个微卫星（SSR） 区域能够用于山 区型和湖沼型日本血吸虫的鉴别。 进一步通过对不同地区虫株的大量重测序证明了该特 异 SSR 位点的存在，其中山区型日本血吸虫比湖沼型日本血吸虫多一个（AG） 重复。 0008 一种用于鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物，其上游引物核苷酸序列。
11、如 SEQ ID NO:1 所示，下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 0009 一种包含上述用于鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物的试剂盒。 说 明 书 CN 102021247 A CN 102021261 A2/5 页 4 0010 上述试剂盒中，包含如下组分 ： （1） DNA 裂解液 ：核裂解液、EDTA、蛋白酶 K 和 RNase A 溶液的混合溶液 ； （2） PCR 反应液 ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和 MgCl2的 混合溶液 ； （3） 山区型日本血吸虫 DNA 对照和湖沼型日本血吸虫对照。 0011 作为一种优选方案，上述试。
12、剂盒中，还可以添加Taq DNA 聚合酶。 0012 作为一种优选方案，上述试剂盒中，各组分的量如下所示 ： （1） DNA 裂解液，27.5mL ：为 100 个反应的 200L 核裂解液、50l pH 8.0 的 0.5mol/L 的 EDTA、20l 蛋白酶 K 和 5L RNase A 溶液的混合溶液 ； （2） PCR 反应液，2.5mL ：为终浓度 200mol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP， 终浓度 0.25pmol/L 的上游引物和下游引物，2mmol/L 的 MgCl2的混合溶液 ； （3） 山区型日本血吸虫 DNA 对照 100L 和湖沼型日本血吸虫 DN。
13、A 对照 100L ； （5） Taq DNA 聚合酶，5U/L，25L。 0013 本发明试剂盒的使用方法包括如下步骤 ： （1） 日本血吸虫 DNA 的提取 ； （2）PCR扩增 ：按照扩增样品数取PCR反应液、Taq酶混合，混匀，分装 ；将山区 型、湖沼型对照液分别加入一个管中，取各样品的 DNA 加入对应反应管中 ；离心混匀， 置于 PCR 扩增仪上反应 ； （3） PCR 产物观察 ：将扩增后的 PCR 产物加样于加样于 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶 上，电泳后置于胶片观察灯上观察结果并拍照分析 ； 作为一种优选方案，步骤（2） 所述Taq酶按每个 PCR 反应含 1.25U 加入。 0。
14、014 作为一种优选方案，步骤（2）所述 PCR 扩增条件为 ：94预变性 5min ；94 变性 30sec、56退火 30sec、72延伸 30sec，35 个循环 ；72后延伸 10min。 0015 作为一种优选方案，步骤（3）所述 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为 90V 电 压电泳 3h。 0016 本发明试剂盒 PCR 反应条件的优化过程为 ： 通过对镁离子浓度和退火温度的调节来对 PCR 条件进行优化。 Mg2+浓度梯度在 1.0mM至3.0mM之间、退火温度在48至58之间进行调整，以取得用PCR扩增的最佳 Mg2+浓度和最佳退火温度。 经试验确定，最佳退火温度为56；Mg。
15、Cl2的浓度为2mM ； 循环数选择为 35 个循环。 0017 本发明鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的检测方法包括如下步骤 ： （1） 日本血吸虫 DNA 提取 ； （2） 用权利要求 1 所述特异性检测引物进行 PCR 扩增 ； （3）扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，条带位置与山区型DNA对 照相一致者为山区型日本血吸虫，条带位置与湖沼型 DNA 对照相一致者为湖沼型日本血 吸虫 ； （4）PCR 扩增条件为 94预变性 5min ；94变性 30sec、56退火 30 sec、72延 伸 30 sec，35 个循环 ；72后延伸 10 min。 0018 （5） 6% 变性聚。
16、丙烯酰胺凝胶电泳条件为 90V 电压电泳 3h。 说 明 书 CN 102021247 A CN 102021261 A3/5 页 5 0019 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 ： （1） 本发明通过对来自于不同流行区的日本血吸虫分离株进行线粒体全基因组序列 测定及比对分析，发现山区型日本血吸虫的线粒体基因序列比湖沼型日本血吸虫多一个 （AG）重复，可用于两种地域型的鉴定。 本申请人根据此差异设计鉴别山区型和湖沼型 日本血吸虫的特异引物及 PCR 和聚丙烯酰胺凝胶检测体系，建立了用于鉴别山区型和湖 沼型日本血吸虫的快速、特异、敏感的检测方法 ； （2） 本发明通过优化反应体系和反应条件。
17、，研制出一种鉴别山区型和湖沼型日本 血吸虫的 PCR 试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客 观，适用于日本血吸虫地理型鉴定与溯源检测等临床及科研用途。 附图说明 0020 图1为山区、湖沼型日本血吸虫鉴别PCR特异性电泳图谱，其中，M为DL2000 marker ；17 分别为 ：日本血吸虫，曼氏血吸虫，埃及血吸虫，肝片吸虫，大片吸虫， 华支睾吸虫和麝猫后睾吸虫 ；8 为阴性对照。 0021 图2为山区、湖沼型日本血吸虫鉴别PCR敏感性电泳图谱，其中，M为DL2000 marker ；110 为日本血吸虫成虫 DNA 模板质量分别为 ：8、6、4、2、0.8、0.6。
18、、0.4、 0.2、0.1、和 0.08 ng ；11 为阴性对照。 0022 图 3 人工感染家兔日本血吸虫病代表性样品鉴别 PCR 聚丙烯酰胺凝胶 电 泳 图 谱， 其 中， M 为 DL2000 marker ；119 分 别 为 山 区 型 DNA 对 照， 云 南 洱 源 II （SJYEIIF5）， 云 南 巍 山（SJYWM1）， 四 川 天 全（SJSTM1）， 四 川 西 昌 （SJSXF21），四川凉山（SJSLM1），湖沼型 DNA 对照，湖北武汉（SJHWM3）， 湖南长沙（SJHCM3），湖南岳阳楼（SJHLF5），湖南君山（SJHYF1），湖南汨罗 （SJHMF1）。
19、，湖南常德（SJHGF1），江苏无锡（SJJWF2），江西南昌（SJJNM1）， 江 西 樟 树（SJJZM1）， 江 西 永 修（SJJYM23）， 浙 江 嘉 善（SJZJF3）， 安 徽 贵 池 （SJAGM3）。 具体实施方式 0023 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 ： 实施例 1 试剂盒的组成 试剂盒内含 DNA 裂解液 27.5mL，其中含 Nuclei lysis solution、 pH8.0 的 0.5M 的 EDTA、蛋白酶 K （20mg/mL） 和 RNase A solution (4mg/mL) ；PCR 反应液 100 个反应 （25L/ 反应），为终浓。
20、度各 200M 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度 0.25pmol/ L 的上游引物和下游引物，2mM 的 MgCl2、Taq酶 25L （5U/L）；日本血吸虫山 区型 DNA 对照和湖沼型日本血吸虫 DNA 对照各 1 支。 0024 实施例 2 试剂盒特异性试验 用经过 DNA 有效性验证的曼氏血吸虫、埃及血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、华支睾 吸虫和社猫后睾吸虫 6 个对照样品 DNA 各 1l 为模板，按照试剂盒的反应条件进行特异 PCR 扩增，同时设空白对照。 0025 表 1 PCR 扩增体系 说 明 书 CN 102021247 A CN 102021261 A4。
21、/5 页 6 PCR 扩增条件为 ： 94预变性 5min 94变性 30sec 56退火 30sec 72延伸 30sec 72后延伸 10min， 其中，变性、退火和延伸做 35 个循环。 0026 PCR 产物在 1.0%TBE 琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像 系统摄像。 0027 结果试剂盒能够从日本血吸虫虫株 DNA 中扩增出约 300bp 的条带，而上述其他 6 种对照寄生虫和空白对照均无目的条带出现（图 1）。 0028 实施例 3 试剂盒的 PCR 敏感性试验 首 先 将 日 本 血 吸 虫 提 取 DNA 后 进 行 稀 释， 旋 涡 振 荡 混 匀， 按。
22、 Eppendorf Biophotometer 核酸蛋白测定仪的操作规程，检测其总 DNA 含量。 按 8、6、4、2、0.8、 0.6、0.4、0.2、0.1、和 0.08ng/L 稀释 DNA， PCR 扩增条件同上，同时设空白对照。 PCR 产物经 1.0wt% 琼脂糖凝胶电泳检测，以确定其敏感性。 试验结果表明该 PCR 检测 方法敏感性高，最低能检测到 0. 2ng DNA 的日本血吸虫（图 2）。 0029 实施例 4 试剂盒的保存期试验 将在 4和 -20保存 1 个月、3 个月、6 个月、9 个月的试剂盒对已知样品进行检 测，扩增条件同前述。 结果表明试剂盒可在 4 （Taq。
23、酶除外，须 -20保存）和 -20 保存长期保存，在试验周期的 9 个月内，在合适保存条件下检测样品均能分别扩增出与 山区型和湖沼型 DNA 对照相应的目的条带。 0030 实施例 5 试剂盒在人工感染家兔日本血吸虫病样品诊断中的应用 1 DNA 样品 日本血吸虫尾蚴样品来自云南洱源、云南巍山、四川凉山、四川矛山、四川天全、 四川西昌、安徽贵池、湖北武汉、湖南长沙、湖南岳阳楼区、湖南君山、湖南常德、湖 南汨罗、江苏无锡、江西永修、江西樟树、江西南昌、和浙江嘉善，然后人工感染家 兔，获取成虫共 299 个样品，70% 酒精保存备用。 0031 2 DNA 的提取 虫体材料置于1.5mL的离心管中。
24、，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移去离心管中的水， 加 DNA 裂解液消化蛋白质释放基因组 DNA，56过夜消化 16h ；消化好的虫体悬液按 说 明 书 CN 102021247 A CN 102021261 A5/5 页 7 Promega 试剂盒 Wizard SV Genomic DNA purifi cation system 使用说明提取虫体 DNA，直 接使用或于 -20冰箱保存备用。 0032 3 PCR 扩增 首先应用试剂盒对上述抽提的基因组 DNA 进行 PCR 扩增同时做阴性对照、山区型 DNA 对照和湖沼型 DNA 对照。 0033 4 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 扩。
25、增产物在 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，胶片观察灯上观察结果并拍照分析 5 部分扩增产物的 DNA 序列测定 取分别与试剂盒山区型和湖沼型对照带形一致的代表性 PCR 产物进行回收纯化，并 连接、转化、克隆。 送目的菌液到上海生工生物技术有限公司进行测序 ；测序结果用 DNAstar 5.0 软件进行分析。 0034 6 结果与分析 获得的日本血吸虫山区型所有样品和山区型 DNA 对照呈现相同的扩增条带而日本 血吸虫湖沼型样品和湖沼型 DNA 对照呈现相同的扩增条带，并且扩增的条带清晰（图 3）。 测序结果显示山区型日本血吸虫克隆片段长度为 301bp，湖沼型日本血吸虫克隆片 段长度为29。
26、9bp，比对分析证实山区型日本血吸虫特异SSR区域的存在，进而证明了所建 立的特异 PCR 和聚丙烯酰胺凝胶检测体系可用于山区型和湖沼型日本血吸虫的鉴别以及 日本血吸虫的溯源研究。 说 明 书 CN 102021247 A CN 102021261 A1/1 页 8 SEQUENCELISTING 华南农业大学 一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂盒及检测方法 2 PatentInversion3.2 1 23 DNA 人工序列 1 tgttcgaccattaaatctttatg 23 2 23 DNA 人工序列 2 tctcactactacaaccacctcaa 23 序 列 表 CN 102021247 A CN 102021261 A1/1 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102021247 A 。