技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用。
背景技术
1975年，Dr.Kohler和Dr.Milstein证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术称为杂交瘤技术。该技术的主要原理是将能在体外无限繁殖但不能合成分泌抗体的骨髓瘤细胞与在体外不能无限繁殖但能合成分泌抗体的免疫脾细胞融合在一起，成为一株既能无限增殖又能不断分泌抗体的杂交瘤细胞。该技术发明并成功运用在科学研究，临床诊断，药物开发等多个领域，成为科研人员运用抗体产生的最主要的方法。
1995年，Dr.Katherine Knight在Loyola University of Chicago成功地在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。在21世纪初，Dr.Robert Pytela和Mr.Weimin Zhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。Epitomics公司(Abcam公司)独家拥有兔单克隆抗体技术的专利，并且开发了兔单克隆抗体用于科研、诊断和治疗的许可平台。
小鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体，都被广泛的应用于科研、诊断、试剂盒制备、快诊、药物研发等多个领域。尤其在科研和诊断领域，兔单克隆抗体由于其高特异性，高亲和力，多位点识别，而且能识别差异很小的不同蛋白结构，越来越被人们使用。
随着分子生物学的不断发展，现在产生兔单克隆抗体的方法也越来越多。传统的杂交瘤技术目前还在Abcam的专利保护期内，因此市场上需要一种改进的生产兔源抗体的方法以满足市场的需要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种兔外周血B细胞的培养体系，该培养体系以能够表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞，能够高效的在体外培养B细胞。
本发明的第二目的在于提供一种兔外周血B细胞的培养方法，该方法使用上述兔外周血B细胞的培养体系培养兔外周血B细胞。
本发明的第三目的在于提供一种抗体的制备方法，该方法使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。
本发明的第四目的在于提供上述兔外周血B细胞的培养体系、上述兔外周血B细胞的培养方法或上述抗体的制备方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基础培养基；其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的细胞。
优选地，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的RK-13细胞；
优选地，所述饲养细胞包括保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株。
优选地，所述IL-4的终浓度为10-25ng/mL；所述IL-10的终浓度为5-20ng/mL；所述IL-21的终浓度为5-20ng/mL；
更优选地，所述IL-4的终浓度为15-25ng/mL；所述IL-10的终浓度为8-15ng/mL；所述IL-21的终浓度为8-15ng/mL；
进一步优选地，所述IL-4的终浓度为20ng/mL；所述IL-10的终浓度为10ng/mL；所述IL-21的终浓度为10ng/mL。
优选地，IL-4、IL-10和IL-21为兔源的白细胞介素。
优选地，所述丝裂原包括脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白A中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原；
优选地，所述美洲商陆丝裂原的终浓度为5-10μg/mL；优选为5.5-9μg/mL；更优选为6-8μg/mL。
本发明还提供了一种兔外周血B细胞的培养方法，包括使用上述培养体系培养兔外周血B细胞。
本发明还提供了一种兔抗体的制备方法，包括：使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。
优选地，使用抗原体外免疫兔外周血B细胞，得到表达抗体的兔外周血B细胞，再使用所述培养体系培养。
优选地，包括如下步骤：将分离出的兔外周血淋巴细胞在包被有特异性抗原的培养容器中孵育；孵育完毕后消化贴壁细胞，得到抗原特异性的B细胞；
重悬后置于含有所述饲养细胞的培养容器内，然后加入IL-4、IL-10、IL-21和丝裂原进行体外培养。
本发明还提供了上述培养体系、上述培养方法或上述抗体的制备方法的应用，包含如下(x1)-(x5)中的一种或多种：
(x1)制备兔源单克隆和/或多克隆抗体；
(x2)制备抗体药物；
(x3)构建兔源免疫模型；
(x4)构建噬菌体库；
(x5)高通量测序。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的兔外周血B细胞的培养体系，包括稳定表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞，CD40L和CD40结合后，可以促进B细胞的生产增殖，是B细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆B细胞的发育。IL-4能够刺激活化B细胞，是B细胞分化成浆细胞的主要因子；IL-10可以诱导B细胞增殖分化。在B细胞存活、增殖中都有重要作用，还能促进抗体的产生；IL-21对B细胞的增殖，抗体的产生也发挥着重要作用。三种白细胞介素协同作用，促进B细胞的增殖和抗体的产生。同时本发明提供的培养体系还包含丝裂原，以促进B细胞的有丝分裂，从而促进B细胞的分化和增殖。
本发明还提供了一种兔外周血B细胞的培养方法，包括使用上述培养体系培养兔外周血B细胞。该培养方法与上述兔外周血B细胞的培养体系基于相同的发明构思，因此具有上述兔外周血B细胞的培养体系的所有有益效果，再此不再赘述。
本发明还提供了一种兔抗体的制备方法，该制备方法包括使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。一方面，使用兔外周血B细胞制备兔源抗体，可以持续得到同一免疫兔子的外周血，进行不同次的重复，而且可以不处死兔子即可完成。另一方面，使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞可以持续的促进B细胞的增殖和分泌抗体，达到在体外持续产生抗体的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞表达的CD40L分子的SDS-PAGE结果；
图2为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞中CD40L分子的PCR结果；
图3为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中CD40L分子的SDS-PAGE结果；
图4为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中CD40L分子的PCR结果；
图5-A为本发明效果例2中待检测细胞的状态图；
图5-B为本发明效果例2中对照孔中FACS检测结果的直方图；
图5-C为本发明效果例2中ELISA阳性，FACS检测为阴性的细胞的直方图；
图5-D为本发明效果例2中ELISA检测和FACS检测均为阳性结果的直方图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基础培养基；其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的细胞。
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。CD40L和CD40结合后，可以促进B细胞的生产增殖，是B细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆B细胞的发育。在体外培养中，大部分都是使用EL-B4小鼠细胞作为饲养细胞，人/鼠细胞因子作为添加剂。本发明以表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞与兔外周血B细胞共培养，可以持续的为B细胞提供共刺激分子CD40L，并且该CD40L为兔源分子，可以更好的与图外周血B细胞表面的CD40分子结合，以促进B细胞的增殖和分化。
在一些优选的实施方式中，所述饲养细胞包括表达兔源CD40L的RK-13细胞。RK-13细胞，是兔源的肾脏细胞，属于表皮细胞，贴壁生长，可以作为转染宿主进行外源基因的表达。该细胞本身高表达角蛋白，且无其他特异性表面蛋白表达，因此该细胞可以用于转染外源兔CD40L基因，并进行稳定表达筛选，最后获得稳定表达兔源CD40L的细胞株。
所述饲养细胞优选为保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株。该细胞株为兔肾细胞RK-13/CD40L，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C2018180，保藏单位地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学，保藏日期：2018年8月22日。
本发明提供的外周血B细胞的培养体系还包含白细胞介素，白细胞介素interleukin缩写为IL，白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，功能关系免疫反应的表达和调节，由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，因此被称为白细胞介素。本发明提供的培养体系主要包含IL-4、IL-10和IL-21，其协同作用，可以进一步促进B细胞的增殖和抗体的分泌。
白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)主要由抗原或丝裂原刺激的CD4+产生，属于红细胞生成素受体超家族成员。IL-4是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。IL-4的生物作用，包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞，B细胞分化成浆细胞的主要因子，同时它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。可选地，所述IL-4的终浓度为10-25ng/mL，例如可以为但不限于为10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、20ng/mL、22ng/mL或25ng/mL；优选为15-25ng/mL；更优选为20ng/mL。
白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)是一种同源二聚体细胞因子，是受体Ⅱ型(IFN)受体家族中的一员，IL-10由人和鼠的Th0和Th1的CD4+T细胞以及B细胞合成。IL-10可抑制Th1细胞和细胞毒性T细胞分泌IL-2和IFN-γ，抑制中性粒细胞的吞噬活性。IL-10可以诱导B细胞增殖分化。在B细胞存活、增殖中都有重要作用，还能促进抗体的产生。可选地，所述IL-10的终浓度为5-20ng/mL，例如可以为但不限于为5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL或20ng/mL；优选为8-15ng/mL；更优选为10ng/mL。
白细胞介素21(interleukin-21，IL-21)是Ⅰ型细胞因子γ链家族中的新型细胞因子，主要由活化的CD4+T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞合成和分泌。IL-21能够刺激T细胞和自然杀伤(NK)细胞增殖、调节B细胞和树突状细胞(DC)存活和分化功能而实现，从而参与机体的固有免疫和适应性免疫。IL-21对B细胞的增殖，抗体的产生也发挥着重要作用。可选地，所述IL-21的终浓度为5-20ng/mL；例如可以为但不限于为5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL或20ng/mL；优选为8-15ng/mL；更优选为10ng/mL。
在一些优选的实施方式中，IL-4、IL-10和IL-21为兔源的白细胞介素。使用全兔来源的饲养细胞和细胞因子，可以增加B细胞在体外生长、增殖和分泌抗体的能力。
丝裂原(mitogen)亦称有丝分裂原，可与淋巴细胞表面相应受体结合，刺激静止淋巴细胞转变为淋巴母细胞并进行有丝分裂，属于非特异性多克隆激活剂。T和B细胞表面表达多种丝裂原受体，在一些可选的实施方式中，所述丝裂原例如可以为但不限于为脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白A中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原。美洲商陆丝裂原为从美洲商陆中提取的蛋白质，对T细胞和B细胞均可发挥致有丝分裂作用，可以促进B细胞的分化和增殖。可选地，所述美洲商陆的终浓度为5-10μg/mL，例如可以为但不限于为5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL；优选为5.5-9μg/mL；更优选为6-8μg/mL。
本发明提供的培养体系中使用的基础培养基，可以为细胞培养技术中可接受的培养基，只要能满足饲养细胞和B细胞的生长即可，例如可以为但不限于为RPMI-1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基等市售培养基。
本发明还提供了一种兔外周血B细胞的培养方法，包括使用上述培养体系培养兔外周血B细胞。该培养方法与上述兔外周血B细胞的培养体系基于相同的发明构思，因此具有上述兔外周血B细胞的培养体系的所有有益效果，再此不再赘述。
本发明还提供了一种兔抗体的制备方法，该制备方法包括使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。一方面，使用兔外周血B细胞制备兔源抗体，可以持续得到同一免疫兔子的外周血，进行不同次的重复，而且可以不处死兔子即可完成。另一方面，使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞可以持续的促进B细胞的增殖和分泌抗体，达到在体外持续产生抗体的目的。
在一些优选的实施方式中，使用抗原体外免疫兔外周血B细胞，得到表达抗体的兔外周血B细胞，再使用所述培养体系培养，使用具有单一免疫原性的抗原体外免疫兔外周血B细胞，可得到单克隆抗体。
在一些优选的实施方式中，参考如下步骤制备兔抗体，制备效果更佳：
(ⅰ)使用淋巴细胞分离液分离兔外周血细胞，将提取得到的兔外周血细胞重复用PBS离心洗2次，再用培养基离心洗1次，用12ml培养基重悬，均匀加入新的6孔板中，37℃培养箱中孵育1.5h；然后将上清中的细胞收集到50ml离心管内，重新加入新鲜培养基，1500rpm离心5min，细胞用培养基重悬，吹散，加培养基到10ml。
(ⅱ)使用特异性抗原蛋白用PBS稀释至2μg/ml，6孔板2ml/孔，37℃包被2h，然后用2ml PBS洗3遍，再用培养基洗2遍；加入步骤(ⅰ)的细胞，2ml/孔，孵育1.5小时后弃去上清，用300μl胰酶消化贴壁细胞，消化后的细胞用培养基重悬，离心1500rpm，5分钟。用5ml培养基重悬，并进行细胞计数。
(ⅲ)将分离的抗原特异性B细胞加到已有饲养细胞的细胞板内，向培养基中加入IL-4，IL-10，IL-21，以及有丝分裂原PWM进行共同培养，8-10天后可进行ELISA和/或FACS检测。
在上述步骤(ⅰ)中，由于单核细胞为贴壁细胞，T细胞和B细胞是悬浮细胞，所以先将分离出的淋巴细胞在培养基中孵育可以去除单核细胞，得到悬浮的T细胞和B细胞。
在步骤(ⅱ)中，孔板是抗原处理过的，而B细胞表面有针对特异性抗原的抗体，因此可以与板子上的抗原相结合。所以，悬浮的细胞有T细胞和不能与特异性抗原相结合的B细胞，而孔板上留下的则是能与抗原结合的B细胞，即特异性B细胞。进而用胰酶消化贴壁细胞再进行重悬，可以去掉T细胞，只留下B细胞，以在培养的过程中进一步的分离出抗原特异性B细胞。
本发明还提供了上述兔外周血B细胞的培养体系、上述兔外周血B细胞的培养方法或上述抗体的制备方法的应用，包括如下的一种或几种：(x1)制备兔源单克隆和/或多克隆抗体，可参考上述本发明提供的兔抗体的制备方法，再此不再赘述；(x2)制备抗体药物，使用上述兔抗体的制备方法制备得到的抗体可以进一步用于制备抗体药物，例如可以为但不限于为制备嵌合抗体、人源化抗体或抗体偶联药物等；(x3)构建兔源免疫模型，上述兔外周血B细胞的培养体系可以作为CD40L信号的提供者，参与CD40-CD40L信号通路的研究；(x4)构建噬菌体库：利用诱导刺激的兔B细胞作为建库细胞，直接产生特异性更专一的抗体序列，从而提高库的质量；(x5)高通量测序：通过饲养细胞和培养体系对兔的B细胞进行刺激，从而使高通量测序和数据分析的目的性更强。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1构建稳定表达兔CD40L蛋白的RK-13细胞
本实施例主要提供构建稳定表达兔CD40L蛋白的RK-13细胞。包括以下步骤：
(Ⅰ)制备包含兔CD40L基因的表达质粒，具体如下:
(a)在NBCI数据中查找兔CD40L基因信息，NM_001256781.1，序列如SEQ ID NO.1所示。
(b)根据序列及表达载体的酶切位点，设计上下游引物：XhoI/MluI
表1引物序列信息
引物 序列(5’-3’) 酶切位点 编号 上游引物 ccgctcgagatgatcgaaacgtacagccaaccta XhoI SEQ ID NO.2 下游引物 ccgaatgagtttgagacttgcgcagc MluI SEQ ID NO.3
(c)以合成的基因为模板，用引物进行PCR，获取目的片段。
(d)将目的片段进行双酶切，鉴定正确后，连接到PCI-neo表达载体上，并将载体转化到E.coli内。
(e)将质粒涂板，挑取单克隆，进行摇菌培养，并进行双酶切鉴定，鉴定正确后进行菌液扩大培养，质粒抽提，获得纯化后的质粒，用于转染。
(Ⅱ)测定RK-13对G418的敏感浓度。具体步骤如下：
(a)用HEPES配置100mg/ml G418用于稳定筛选使用，-20℃贮存。
(b)收集RK-13细胞，并计数。
(c)将RK-13细胞铺到96孔细胞培养板内，每孔1000个细胞。
(d)加入不同浓度的G418(1000μg，800μg，600μg，500μg，400μg，300μg，200μg)到细胞培养板内，放入CO2培养箱进行培养。
(e)5-10天后观察细胞的活率。实验发现，在500μg/ml的G418浓度下，RK-13细胞正好处于存活状态，而600μg/ml的浓度下，细胞则死亡。
(Ⅲ)将兔CD40L表达质粒转染到RK-13细胞内，并进行检测
(a)分别使用转染试剂fectin和Lipofectamine 3000将CD40L质粒转染到RK-13细胞。
(b)培养3天后进行SDS-PAGE检测和PCR检测。
(c)SDS-PAGE电泳结果如图1所示，转染后的RK-13-CD40L细胞在40kDa附近有明显的蛋白条带，Lipofectamine 3000转染后，兔CD40L表达明显高于fectin组。PCR检测结果如图2所示，转染后，800bp附件有目的条带；
其中，图1中，泳道1为Marker；泳道2为RK-13细胞；泳道3-5为使用转染试剂fectin转染CD40L表达质粒后的细胞，三组重复试验；泳道6-8为使用转染试剂Lipofectamine 3000转染CD40L表达质粒的细胞，三组重复试验；
图2中，泳道M为Marker；泳道1-2为RK-13细胞；泳道3为使用转染试剂fectin转染CD40L表达质粒的细胞；泳道4-5为使用转染试剂Lipofectamine 3000转染CD40L表达质粒的细胞。
(Ⅳ)对RK-13-CD40L细胞进行稳定性筛选
(a)将转染后的RK-13-CD40L细胞进行G418稳定加压筛选。隔天进行细胞计数和活率测定。
(b)54天后细胞达到稳定状态，并进行SDS-PAGE和PCR检测，结果如图3和图4所示；
其中，图3中泳道1为Marker；泳道2-3为稳定表达CD40L的RK-13细胞；图4中泳道1为Marker；泳道2为稳定表达CD40L的RK-13细胞；泳道13为RK-13细胞。
(c)检测实验显示，兔CD40L基因已经稳定表达在RK-13细胞上。
实施例2
本实施例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基础培养基；
其中，所述饲养细胞为保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株；
IL-4的终浓度为20ng/mL；IL-10的终浓度为10ng/mL；IL-21的终浓度为10ng/mL，IL-4、IL-10和IL-21均为兔源的白细胞介素；
丝裂原为美洲商陆丝裂原，终浓度为7.5μg/mL；
基础培养基为含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。
实施例3
本实施例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基础培养基；
其中，所述饲养细胞为保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株；
IL-4的终浓度为25ng/mL；IL-10的终浓度为10ng/mL；IL-21的终浓度为10ng/mL；IL-4、IL-10和IL-21均为兔源的白细胞介素；
丝裂原为美洲商陆丝裂原，终浓度为10μg/mL；
基础培养基为含10％胎牛血清的1640培养基。
对比例1
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有饲养细胞，含有终浓度为2μg/mL的兔源CD40L分子。
对比例2
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有饲养细胞，含有终浓度为2μg/mL的人源CD40L分子。
对比例3
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有IL-4。
对比例4
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有IL-10。
对比例5
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有IL-21。
对比例6
本对比例提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，与实施例2的区别在于，本实施例提供的培养体系中不含有丝裂原。
实施例5制备兔源单克隆抗体
(Ⅰ)制备饲养细胞，包括如下步骤：
(a)弃饲养细胞上清，用10ml PBS冲洗干净后加胰酶2ml，37℃消化3min。
(b)加培养基6ml终止反应，用移液管吹起细胞，移取至离心管，1400rpm，5min。
(c)弃上清，用900μl全培养基重悬，加100μl MCC，37℃孵育2h。
(d)用15ml PBS 1500rpm离心5min，再重复洗2遍，之后用10ml完全培养基重悬，计数，铺板10000个/孔，100μl/孔。
(Ⅱ)获取外周血抗原特异性B细胞，包括如下步骤：
(a)特异性抗原蛋白用PBS稀释至2μg/ml，6孔板2ml/孔，37℃包被2h。
(b)兔血:PBS＝1:1比例混合于50ml离心管内，轻柔吹匀。
(c)兔血稀释液:兔外周血分离液＝1:1比例。把分离液先加入50ml离心管，用移液管缓慢加入兔血稀释液，保持分层状态。
(d)将分层的分离液和兔血混合液离心管，小心的放入离心机，1800rpm，室温离心30min。
(e)离心后的兔血，上至下细胞分四层。第一层：为血浆层。第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。第三层：为透明分离液层。第四层：为红细胞层。小心吸取第二层乳白色细胞转移至50ml离心管，加PBS 15ml，1500rpm离心5min。
(f)重复用PBS离心洗2次，再用培养基离心洗1次，用12ml培养基重悬，均匀加入新的6孔板中，37℃培养箱中孵育1.5h。
(g)将(f)步骤的上清收集到50ml离心管内，重新加入新鲜培养基，1500rpm离心5min，细胞用培养基重悬，吹散，加培养基到10ml。
(h)将包被抗原的6孔板吸弃上清，加含血清的培养基2ml/孔封闭，37℃孵育1h。
(i)将封闭后的含抗原的6孔板用2mlPBS洗3遍，再用培养基洗2遍后，加入步骤(g)的细胞，2ml/孔，孵育1.5小时。
(j)弃去步骤(i)的上清，用300μl胰酶消化贴壁细胞，消化后的细胞用培养基重悬，离心1500rpm，5分钟。用5ml培养基重悬，并进行细胞计数。
(Ⅲ)使用实施例2提供的外周血B细胞的体外培养体系继续培养B细胞，包括如下步骤：
(a)将分离的抗原特异性B细胞加到已有饲养细胞的细胞板内，进行培养。
(b)向培养基中加入IL-4，IL-10，IL-21，以及有丝分裂原PWM至目标终浓度，进行共同培养。
8天后进行ELISA和/或FACS检测。
实施例6
本实施例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用实施例3提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例7
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例1提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例8
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例2提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例9
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例3提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例10
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例4提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例11
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例5提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
对比例12
本对比例提供了一种制备兔源单克隆抗体的方法，与实施例5的区别在于，使用对比例6提供的兔外周血B细胞的培养体系培养抗原特异性B细胞。
效果例1对外周血B细胞体外培养的上清进行ELISA检测。
(a)将特异性抗原以1μg/ml浓度包被，4℃过夜，次日用1％BSA封闭酶标板。
(b)弃去封闭液，拍干后加入50μl培养上清，37℃孵育1小时。
(c)用TBST清洗酶标板，3次，拍干后加入抗兔IgG-HRP二抗，50μl每孔，37℃孵育半小时。
(d)用TBST清洗酶标板，3次，拍干后加入现配TMB显色液，50μl每孔，室温显色，待阳性孔显出蓝色后，用硫酸终止液进行终止显色反应。
(e)用酶标仪OD450nm进行读数，并记录阳性孔位置，用于流式筛选或其他检测。
表2抗体滴度如下表所示：
由效果例1可以看出，实施例5提供的兔源单克隆抗体的方法最优，由实施例5与实施例6对比可以看出，优化白细胞介素和丝裂原的用量，可以进一步优化培养体系对兔外周血B细胞的培养效果；由实施例与对比例7-8对比可以看出，兔源的CD40L分子优于其他种属来源的CD40L分子对兔外周血B细胞的共刺激作用；并且使用饲养细胞持续的为培养体系提供CD40L分子，优于单独在培养体系中添加CD40L分子；由实施例5与对比例9-11可以看出，IL-4、IL-10和IL-21可协同作用促进B细胞的增殖和抗体的产生；由实施例5和对比例12对比可以看出，丝裂原具有促进B细胞分裂增殖的作用。
由本效果例可以看出，实施例5提供的单克隆抗体的制备方法，优于其他实施例和对比例，进一步的，对实施例5中高表达特异性抗原的细胞进行FACS检测。
效果例2ELISA阳性孔进行上清的FACS检测。
(a)收集高表达特异性抗原的细胞，并用PBS进行清洗2次。
(b)细胞用1％BSA的PBS进行4℃封闭半小时。用PBS洗2次，1500rpm/5分钟。
(c)加入50μl ELISA阳性的上清到细胞内，4℃孵育1小时。
(d)用PBS洗3次，1500rpm/5分钟。加入抗兔IgG-Alexa-488荧光二抗，4℃孵育半小时。
(e)用PBS洗3次，1500rpm/5分钟。加入0.5ml PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图5-A、图5-B、图5-C和图5-D所示：
其中，图5-A是细胞的状态图，横坐标是FCS，纵坐标是SSC，2个指标表示细胞的大小和分散情况，图中圈起的区域内的细胞为主要检测对象；
图5-B是对照孔细胞的直方图，图5-C是ELISA阳性，FACS检测为阴性的细胞的直方图，图5-D为ELISA检测和FACS检测均为阳性结果的直方图；其中图5-B、图5-C和图5-D中横坐标是FL1，是荧光通道，纵坐标是荧光强度；直方图，越靠近纵轴，说明值越低，阴性越高；越远离纵轴，说明值越大，阳性越高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州华安单抗生物技术有限公司
<120> 兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> 兔（Leporidae）
<400> 1
atgatcgaaa cgtacagcca acctactcct cgttctgtgg ccactggacc atctgttagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatta cccagatgat agggtcagcg 120
ctttttgctg tatatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaggattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca aaggagaagg gtccttatcc 240
ctactgaact gtaaggaaat tagaagccag tttgaaggct tcgtcaagga tataatgcta 300
aacaaagagg agccgaagaa agaaataaat tttgaaatgc aaaaaggtga tcaggatcct 360
caaattgcag cacatctcat aagtgaggcc agtagtaaat catcatctgt tctacagtgg 420
gctaaaaaag gatattacac catgagcaac actttggtaa ctcttgaaaa tggaaaacag 480
ctgaaagtga aaagacaagg attctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540
caggaacctt caagtcaagc tccatttata gccagcttat gcctgaagtc ttctggtgga 600
tcagaacgaa tcctactcag agcagcaaat gcccgcagtt cctccaaaac ttgtgagcag 660
caatccatcc acttgggagg agtatttgaa ttgcaagcgg atgcttcggt gtttgtgaat 720
gtgactgatg caagccaagt gaaccacggg accggtttca catcatttgg cttactcaaa 780
ctctga 786
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgctcgaga tgatcgaaac gtacagccaa ccta 34
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgaatgagt ttgagacttg cgcagc 26