用超滤、反渗透和纳滤纯化糖类 相关申请的交叉文献
本申请是美国临时申请No.60/028,226(1996年10月10日提交)的部分续展申请，该申请内容纳入本文作参考。
发明领域
本发明涉及寡糖的合成。具体地，本发明涉及用超滤、纳滤(nanofiltration)和/或反渗透来纯化寡糖的改进方法。
发明背景
随着对糖类作为细胞表面识别元件的作用的了解不断提高，生产具有确定结构的糖类分子的兴趣也日益提高。例如，包含寡糖部分唾液酸基乳糖(sialyl lactose)的化合物已经成为针对细菌(如霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门氏菌)肠毒素的感兴趣的中和剂(例如参见美国专利No.5,330,975)。已经研究了唾液酸基乳糖对关节炎和有关自身免疫疾病的治疗。特别认为唾液酸基乳糖抑制或破坏了IgG上Fc糖类结合位点的占据程度，从而防止了免疫复合物的形成(见美国专利5,164,374)。最近已经建议用唾液酸基-α(2，3)半乳糖苷、唾液酸基乳糖和唾液酸基乳糖胺(lactosamine)来治疗溃疡，并且已经对前一化合物在该性能上的用途开始了I期临床试验。见，Balkonen等.，FEMS Immunology and Medical Microbiology 7：29(1993)和BioWorld Today，p.5，1995年4月4日。另一个例子是，在能结合诸如ELAM-1和GMP 140受体的白细胞和非白细胞细胞系中存在着包含唾液酸基路易斯配体(唾液酸基路易斯x和唾液酸基路易斯a)的化合物。Polley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：6224(1991)和Phillips等，Science，250：1130(1990)，另见USSN08/063,181。
由于对制备所需的糖类结构的兴趣，目前已经对糖基转移酶及其在糖类酶催促化合成中地作用作了深入的研究。用糖基转移酶来酶促合成糖类比化学方法更具优越性，因为酶提供了实际上完全的立体选择性和连接特异性(Ito等，Pure Appl.Chem.，65：753(1993)，美国专利5,352,670和5,374,541)。因此，糖基转移酶越来越多地在合成中用于治疗和其它目的的许多糖类中用作酶促催化剂。
酶促合成或其它方法制得的糖类化合物通常是以复杂的混合物形式获得的，它不仅包括所需的化合物，还包括其它污染物如未反应的糖、盐、丙酮酸盐、磷酸盐、PEP、核苷、核苷酸、和蛋白质。这些污染物的存在是使用糖类化合物的许多应用中所不希望的。以前用来纯化寡糖的方法，如层析(即离子交换层析和大小排阻层析)，有几个缺点。例如，层析纯化方法不适用于大规模纯化，从而妨碍了其在糖商品化生产中的应用。而且，层析纯化方法费用昂贵。因此，需要有一种以前所用方法更快、更有效、成本更低的纯化方法。本发明满足了这一需求以及其它需求。
背景技术
USPN 5,454,952描述了一种用膜组合来除去含糖溶液中不需要的杂质(尤其是抑制糖结晶的糖蜜形成离子)的方法。该方法涉及超滤和其后进行的纳滤，据描述可用来改善甘蔗或甜菜溶液中的结晶糖的回收。
USPN 5,403,604描述了用纳滤从果汁中去除果汁糖，获得糖含量高的保留液和糖含量较低的渗滤液。
USPN 5,254,174描述了采用层析和/纳滤，通过从含菊糖(inulide)化合物的果汁或糖浆中除去盐和葡萄糖、果糖和蔗糖，来纯化化学式为GFn的菊糖化合物(其中G是葡萄糖，F是果糖)。
USPN 4,956,458描述了用反渗透来从聚葡萄糖(它是随机的交联的葡聚糖聚合物，通过葡萄糖的酸催化缩合而成)中除去、大多数不良的组成如脱水葡萄糖和呋喃甲醛衍生物聚葡萄糖。
USPN 4,806,244描述了用组合的膜和吸附系统，通过纳滤从水中除去硫酸盐，然后通过吸附到离子交换树脂来除去渗滤液中通过膜的硝酸盐。
发明概述
本发明提供了一种从含污染物的原料液中纯化糖类化合物的方法。该方法涉及使原料液在一定条件下与纳滤膜或反渗透膜接触，在该条件下膜保留了所需的糖类化合物，而大多数污染物则通过膜。本发明提供纯化糖类化合物的方法，这些糖类例如是唾液酸基乳糖；唾液酸；乳糖-N-新四糖(LNnT)和GlcNAcβ1；3Galβ1、4Glc(LNT-2)、NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)Glc(R1)β1-OR2，其中R1是OH或NAc；R2是氢、烷氧基、糖、寡糖或至少有一个碳原子的糖苷配基；以及Galα(1→3)Galβ(1→4)Glc(R1)β-O-R3，其中R1是OH或NAc；R3是-(CH2)n-COX，X＝OH，OR4，-NHNH2，R4是氢、糖、寡糖或至少有一个碳原子的糖苷配基，n＝2至18的整数。
另外还提供了纯化有以下化学式的糖类化合物的方法：NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R1)β-OR2、NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R1)β(1→3)Galβ-OR2、NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R1)βOR2或NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R1)β(1→3)Galβ-OR2，其中R1是1-18个碳原子的烷基或酰基、5，6，7，8-四氢-2-萘酰氨基；苯甲酰氨基、2-萘酰氨基；4-氨基苯甲酰氨基；或4-硝基苯甲酰氨基，R2是氢、糖、寡糖或至少有一个碳原子的糖苷配基。
在另一个实例中，本发明提供了从原料液(含用来合成糖类化合物的反应混合物)中纯化糖类化合物的方法。合成可以是酶促或化学方法或其组合。方法涉及，通过原料液与超滤膜接触，蛋白被膜保留而糖类化合物作为渗滤液通过膜，从而除去原料液中存在的任何蛋白。然后使超滤步骤的渗滤液在一定条件下与纳滤膜或反渗透膜接触，在该条件下纳滤膜或反渗透膜能滞留糖类化合物，而大多数不需要的污染物则通过膜。
本发明的另一个实例提供了纯化核苷酸、核苷和核苷酸糖的方法，该方法是使含有核苷酸或相关化合物的原料液在一定条件下与纳滤膜或反渗透膜接触，在该条件下膜能保留核苷酸或相关化合物而大多数污染物则通过膜。
本发明还提供了一种从含有感兴趣糖类的溶液中除去一种或多种污染物的方法。该方法涉及使此溶液与半透膜的一个膜侧面接触，该半透膜的排斥系数能够保留糖类而使污染物通过膜。根据感兴趣的糖类相对于污染物的大小和电荷，所用的膜选自超滤膜、纳滤膜和反渗透膜。该膜将含糖原料液分离成保留部分和渗滤部分。如果膜对糖的排斥系数高于对污染物的，则保留部分的污染物浓度将相对低于原料液中的污染物浓度，而且糖类与不需要的污染物的比值通常较高。相反，膜对糖类的排斥系数低于对污染物的时，则实现的分离将是渗滤液中污染物的浓度低于原料液，渗滤液中糖与污染物的比值将高于原料液。如果需要，可通过膜系统再循环含糖级分以便进一步纯化。
可用本发明方法从含所需化合物的溶液中除去的污染物例子包括，但不局限于，未反应的糖、无机离子、丙酮酸盐、磷酸盐、磷酸烯醇丙酮酸和蛋白。
发明详述
定义
这里采用了下列缩写：
Ara＝阿拉伯糖基；
Fru＝果糖基；
Fuc＝岩藻糖基；
Gal＝半乳糖基；
GalNAc＝N-乙酰半乳糖基；
Glc＝葡糖基；
GlcNAc＝N-乙酰葡糖基；
Man＝甘露糖基；
NeuAc＝唾液酸基(N-乙酰神经胺基)。
术语“糖类”包括具有通式(CH2O)n的化学化合物，其包括单糖、二糖、寡糖和多糖。本文所用的术语“寡”指由2至约10个残基组成的聚合分子，例如氨基酸(寡肽)、单糖(寡糖)和核酸(寡核苷酸)。术语“聚(多)”指包含约10个以上残基的聚合分子。
认为寡糖有一个还原性末端和一个非还原性末端，无论该糖的还原性末端是否是还原糖。根据人们接受的命名，这里认为寡糖的左侧为非还原性末端，右侧为还原性末端。
本文所述的所有寡糖是这样书写的：非还原糖的名称或缩写(如Gal)，其后是糖苷键(α或β)、环键、参与键合的还原糖的环位置，然后是还原糖的名称或缩写(如GlcNAc)。两个糖之间的键可表达成，例如，2，3、2-3或(2，3)。
如果不需要的组分的浓度在纯化后不超过纯化前该组分浓度的大约40％，则称化合物是从溶液中不需要的组分中“基本上提纯”了。较佳的，不需要的组分在纯化后的浓度应少于约纯化前浓度的20％(重量)，更佳的少于约10％。
本文所用的术语“药学上纯的”指从不需要的污染物中足够纯化的化合物，该化合物适于作为药物制剂来给药。较佳的，该化合物被纯化至不希望污染物在纯化后的量约为纯化前原料液中污染物浓度的5％(重量)或更少。更佳的，纯化后的污染物浓度约为纯化前污染物浓度的1％或更低，更佳的约为0.5％或更低。
“原料液”指含有待纯化化合物的任何溶液。例如，用来合成寡糖的反应混合物可用作原料液，用本发明的方法可从其中纯化出所需的反应产物。
发明实例
本发明提供了用半透膜(如反渗透膜和/或纳滤膜)将特异性糖和寡糖结构纯化至高纯度的迅速有效的纯化方法。该方法特别适用于在寡糖合成或降解后，从存留在反应混合物中的反应物和其它污染物中分离出所需的寡糖化合物。例如，本发明提供用来从酶促合成或酶促降解寡糖、核苷酸糖、葡糖脂类、糖脂、核苷酸、核苷和其它含糖化合物的反应混合物中将寡糖与酶和/或其它组分分开的方法。另外还提供了用超滤、纳滤或反渗透来从原料液中除去盐、糖和其它组分的方法。通过采用这些技术，可生产出基本上达到100％纯度的糖(如唾液酸基乳糖、SLex和许多其它糖类)。而且，与以前已知的糖类纯化方法相比，本发明的纯化方法更有效更迅速，更适合进行大规模纯化。
所需的纯化通常可在一步中实现；通常不需要诸如结晶等其它额外纯化步骤。因此，本发明提供了纯化含糖化合物的单步方法。
根据本发明，为了纯化糖，选出一种膜，该膜适于从(待从中纯化出糖的)溶液的不需要的组分中分离出所需的糖。选择膜的目的是，使膜的分子量截留(MWCO)、膜组成、渗透性和排斥特性对于特定的应用最优，即，使膜保留特定分子而让盐和其它(通常是较小的或带相反电荷)分子通过的性能最优。组分i(Ri)的保留百分数由算式Ri＝(1-Cip/Cir)×100％给出，其中Cip是渗滤液中组分i的浓度，Cir是保留物中组分i的浓度，两者均用重量百分数表示。某组分的保留百分数也称为保留性能或膜排斥系数。
为了有效的分离，所选择的膜应对感兴趣糖类的排斥比高于对需分离化合物的排斥比。如果膜对于第一种化合物的排斥比高于第二种化合物，则通过膜的渗滤溶液中第一种化合物的浓度比第二种化合物少。反之，则渗滤液中第一种化合物的浓度高于第二种化合物的浓度。如果膜不排斥某化合物，则渗滤液和保留部分中的该化合物浓度基本保持与原料液中的相同。如果渗滤液中某化合物浓度高于原料液中该化合物浓度，也可能是膜对此化合物有负的排斥比。关于膜技术的总的描述可见Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry(VCH，1990)中的“Membranes and Membrane Sepraration Processes”部分；另见，Noble和Stern，Membrane Separations Technology：Principles and Applications(Elsevier，1995)。
首先，通常是选择分子量截留(MWCO，通常与膜孔径有关)预计能保留所需化合物而让原料液中不需要的化合物通过的膜。所需的MWCO通常小于待纯化化合物的分子量，且通常大于要从含待纯化化合物的溶液中除去的不需要的污染物的分子量。例如，为了纯化分子量200Da的化合物，应当选择MWCO低于约200Da的膜。例如，MWCO为100Da的膜也是合适的候选物。可用于本发明的膜可根据其MWCO部分分类为超滤(UF)膜、纳滤(NF)膜，或反渗透(RO)膜，这取决于所需的分离。为便于本发明描述，如Pure Water Handbook，Osmonics，Inc.(Minnetonka MN)中所确定的分类为UF、NF和RO膜。RO膜通常有小于约200Da的标称MWCO并排斥大多数离子，NF膜通常有约150Da至5kDa间的标称MWCO，UF膜通常有约1kDa至300kDa间的标称MWCO(这些MWCO范围就糖类分子而言)。
在选择适用于特定分离的膜时，第二个考虑的参数是膜的聚合物形式。每一区域中所用的膜用常规膜材料制成，无论是无机的、有机的、还是无机和有机的混合材料。典型的无机材料包括玻璃、陶瓷、金属陶瓷、金属等。适用于UF区域的陶瓷膜可根据(例如)美国专利No.4,692,354(Asaeda等)、4,562,021(Alary等)及其它文献中所述的那样制得。适用于NF和RO区域的有机材料通常是聚合物，无论是各向同性还是各向异性的，纤维的孔侧(bore side)或是壳侧有薄层或“皮层”。较佳的纤维材料是聚酰胺、聚苯甲酰胺、聚砜(其中包括磺化的聚砜和磺化的聚醚砜)、聚苯乙烯(包括含苯乙烯的共聚物，如丙烯腈-苯乙烯、丁二烯-苯乙烯和苯乙烯-乙烯基苄基卤共聚物)、聚碳酸酯、纤维素聚合物(包括纤维素乙酸酯)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇、碳氟化合物等，如美国专利No.4,230,463，4,806,244和4,259,183中所述。除了聚合的辨别层外，NF和RO膜通常还有多孔性支持基材。
在选择合适的膜组成时，特别重要的是膜表面电荷。在所需的MWCO范围内，所选择的膜其表面电荷适合糖类和污染物的离子电荷。尽管特定膜的MWCO通常是不变的，但是改变原料液的pH却能通过改变膜表面电荷来影响膜的分离性能。例如，简单地通过降低溶液的pH，即可将在中性pH下具有净表面负电荷的膜调节成具有净中性电荷。调节溶液pH的另一个效果是调节了污染物和感兴趣糖类上的离子电荷。因此，通过选择合适的膜聚合物类形和pH，可以获得污染物和膜为中性的体系，从而使污染物容易通过。例如，如果污染物在中性pH下带负电，则通常需要降低原料液的pH以使污染物质子化。例如，如果将溶液的pH降低至约为3，使磷酸盐阴离子质子化，使其通过膜，就可以除去磷酸盐。如实施例5中所述，pH从7.5降低至3.0可使通过聚酰胺膜的GlcNAc百分数降低(例如Osmonics MX07在30分钟内从70％降低至28％)，同时使通过的磷酸盐百分数从10％提高至46％(见实施例6，表5关于改变pH对其它化合物通过各种纳滤膜时的通过比的影响的其它实施例)。为了纯化阴离子糖类，pH通常在约pH1至7之间。反之，如果污染物有表面正电荷，则可将原料液的pH调节至约pH7-14之间。例如提高含氨基(-NH3+)污染物溶液的pH可使氨基成中性，从而使其容易通过膜。因此，本发明的一个方面涉及通过调节与膜接触的溶液的pH来调节分离效率；这样可以改变污染物的离子电荷，还可以影响膜的表面电荷，从而使所需糖类的纯化容易进行。当然，必须按照生产商的说明书在特定膜可接受的pH范围内进行，以避免对膜的损坏。
对于一些应用，首先在一个pH下对混合物进行纳滤或反渗透，然后将含有感兴趣糖的保留液调节至不同的pH，再对其进行另一轮的膜纯化。例如，使用来合成唾液酸基乳糖的反应混合物在pH3.0下过滤通过Osmonics MX07膜(一种MWCO约为500Da的纳滤膜)将保留唾液酸基乳糖，并除去溶液中大多数磷酸盐、丙酮酸盐、盐和锰，并且还除去了一些GlcNAc、乳糖和唾液酸。在将pH调节至7.4后，使其再循环通过MX07膜可除去大多数残留的磷酸盐、所有的丙酮酸盐、所有的乳糖、一些唾液酸以及大量的残余锰。
如果要从含蛋白(例如用来合成所需寡糖或核苷酸糖的酶)的混合物中纯化糖，通常希望以除区蛋白作为纯化步骤的第一步。对于小于蛋白的糖类，通过选择MWCO小于待从溶液中除去的蛋白或其它大分子的分子量、但大于待纯化寡糖分子量(即，在这种情况下蛋白的排斥比高于所需的糖类)的膜，可以实现这一分离。这样，膜可以排斥分子量大于MWCO的蛋白和其它大分子，而使糖通过膜。反之，如果要从小于寡糖或核苷酸糖的蛋白中纯化寡糖或核苷酸糖，则所用的膜的MWCO应大于蛋白分子量而小于寡糖或核苷酸糖的分子量。通常，分离蛋白和糖所用的膜通常称为超滤(UF)膜。适用于本发明方法的超滤膜购自几个商业生产商，它们包括Millipore Corp.(Bedford，MA)，Osmonics，Inc.(Minnetonka，MN)，Filmtec(Minneapolis，MN)，UOP，Desalination Systems，Advanced MembraneTechnologies和Nitto。
本发明还提供了用纳滤(NF)膜或反渗透(RO)膜从含感兴趣糖的混合物中除去盐和其它低分子量组分的方法。纳滤膜是一类根据分子量和离子电荷来分离的膜。就通过膜的物质大小而言，纳滤膜通常在反渗透膜和超滤膜之间。在纳滤膜的溶胀的聚合物网络诸链之间通常有微孔或开孔。对非电离分子的截留分子量通常在100-20000道尔顿之间。对于有相同分子量的离子，膜排斥(保留)作用将随具体膜的离子电荷为0，1，2，3而逐渐增加，因为电荷密度增加(例如见Eriksson，P.，″Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration，″Enviromental Progress，7：58-59(1988))。在Chemical Engineering Progress，pp.68-74(1994年3月)，Rautenbach等，Desalintion 77：73(1990)和USPN 4,806,244中也描述了纳滤。在一典型的应用中，感兴趣的糖被纳滤膜保留，而污染的盐和其它不需要的组分则会通过。用于本发明方法的纳滤膜对于感兴趣糖的保留性能通常约为40％至100％，较佳的约为70％至100％。用于本发明的纳滤膜可以是任何一种常规的纳滤膜，其中聚酰胺膜是特别合适的。几个商业上的生产商销售适用于本发明方法的纳滤膜，其中包括Millipore Corp.(Bedford，MA)，Osmonics，Inc.(Minnetonka，MN)，Filmtec(Minneapolis，MN)，UOP，Advanced Membrane Technologies，DesalinationSystems和Nitto。例如，合适的膜包括Osmonics MX07，YK，GH(G-10)，GE(G-5)和HL膜。
反渗透(RO)膜也能使各种水性溶质通过并同时保留所选的分子。通常，渗透指纯液体(通常是水)通过半透膜进入溶液(通常是糖或盐和水)而稀释溶液并使两种液体达到渗透平衡的方法。相反，反渗透是由压力驱动的膜过程，其中向膜系统施加外部压力，使得水分子从盐溶液或糖溶液区室反向流入膜系统的纯水区室中。RO膜是半渗透的、无孔的，它需要用压力泵将水性原料以高于水中溶解物质的渗透压压到膜上。RO膜可有效地从水中除去低分子量的分子(＜200道尔顿)和离子。较佳的，反渗透膜对于感兴趣的糖的保留性能通常约为40％至100％，较佳的约为70％至100％。其中合适的RO膜包括，但不局限于，Filmtec BW-30、Filmtec SW-30、Filmtec SW-30HR、UOP RO膜、Desal RO膜、Osmonics RO膜、Advanced Membrane Technologies RO膜和Nitto RO膜。合适的RO膜例子是Millipore Cat.No.CDRN500 60(Millipore Corp.，Bedford MA)。
用于本发明的膜可采用任何已知的膜结构。例如，膜可以是扁平的、板状和框状、管状、螺旋缠绕式、中空纤维等。在一个较佳的实例中，膜是螺旋缠绕式的。膜可采用任何合适的构型，包括错流(cross-flow)或深滤构象(depthconfigutation)。在“错流”过滤(适于本发明的超滤、纳滤和反渗透纯化)中，待从中纯化感兴趣的糖的“原料”或溶液以平行于膜表面或切线方向流经通过膜通道，并分离成保留(也称为再循环或浓缩)液和渗滤液。为了维持有效的膜滤，液流应在足够高的速度下平行于膜表面流动，以产生剪切力和/或湍流，除去被膜排斥而堆积的颗粒。错流过滤有三股液流—原料液流、渗滤液流和残留液流。相反，“终端式”或“深层”过滤只需两股液流—原料液流和滤过液流(或渗滤液)。再循环液或保留液保留了被膜排斥的所有颗粒和大分子，它们可全部再循环到产生再循环液流的膜组件中，或可部分从系统中除去。例如，当用本发明的方法来纯化低分子量组分中的糖时，保留液流(或对于深度过滤来说是原料液)中含有所需的糖，而渗滤液含有被除去的污染物。
通过调节进行过滤时的压力、流速和温度，可进一步优化本发明的纯化方法。UF、NF和RO通常需要将压力升高至大于环境压力，以克服穿过膜的溶液的渗透压。可以根据膜生产商说明书的最大的和推荐的操作压力，再通过逐步调节作进一步优化。例如，UF的推荐压力通常在约25-100psi之间，对于NF则在50-1500psi之间，对于RO在约100-1500psi之间。还可调节浓缩液(原料液)和渗滤液的流速以使所需的纯化达到最优。还可以生产商对具体膜的建议作为起点，通过逐步调节来优化纯化过程。浓缩液(Pc)的流速通常在约1-15加仑/分钟(GPM)之间，更佳的在约3-7GPM之间。对于渗滤液，流速通常在约0.05-10GPM之间，较佳的在约0.2-1GPM之间。进行纯化时的温度对纯化效果和速度也有影响。对于大多数场合，温度通常在约0-100℃之间，较佳的在约20-40℃之间。对于一些膜，较高的温度会使膜孔径增加，从而提供了可调节的另一种参数来优化纯化。
在一个较佳的实例中，过滤在膜纯化机器中进行，该机器能自动控制流速、压力、温度和其它影响纯化的参数。例如，Osmonics 213T膜纯化机器以及上述其它公司生产的机器适用于本发明的方法。
在使用后或渗透性降低后，膜很容易进行清洗。清洗可在稍高的温度下进行(如果希望这样)，用水或苛性碱溶液来冲洗。如果液流含有少量酶，则可在少量表面活性剂(例如ULTRASIL)存在下冲洗。另外，还可用预滤膜(100-200μm)来保护更为昂贵的纳滤膜。如果需要，可使用其它清洁剂。清洗方法的选择取决于待清洗的膜，应当参考膜生产商的说明书。清洗可用顺流冲洗或逆流冲洗。
本发明的纯化方法可单独使用或与纯化糖类的其它方法联合使用。例如，在纳滤/反渗透前后，或在过滤前后，可用离子交换树脂从含感兴趣糖的混合液中除去特定的离子。如果需要除去离子(如第一轮纳滤或反渗透后剩余的磷酸盐和核苷酸)，离子交换树脂是特别理想的。在上述唾液酸基乳糖合成的情况下，这可通过(例如)在pH约为3.0或更低的保留液中加入阴离子交换树脂(如AG1 X-8，乙酸盐形式，BioRad；例如参见，BioRad的其它离子交换树脂的产品目录)直至磷酸盐浓度减少到所需程度来实现。在该过程中，乙酸释放出来，这样也许可在离子交换后通过纳滤或反渗透系统进行再次的纯化。例如，可以使pH3.0或更低的溶液循环通过Osmonics MX07或类似的膜，直至渗滤液的电导率很低并稳定。然后，用NaOH使溶液的pH升高至7.4，使溶液再循环通过相同的膜，以除去剩余的乙酸钠和盐。可以相似方式除去阳离子；例如，为了除去Mn2+，可加入酸性离子交换树脂，如AG50WX8(H+)(BioRad)。
本发明的纯化方法特别适用于纯化用酶促合成制得的寡糖。用糖基转移酶的酶促合成方法提供了非常有效的制备寡糖的方法；对于一些应用，需要从酶促合成反应混合物中的酶和其它反应物中纯化出寡糖。生产许多寡糖的较佳的方法涉及糖基转移酶循环，每形成1摩尔产物将产生至少1摩尔无机焦磷酸盐，它通常在二价金属离子存在下进行。糖基转移酶循环的实例是采用一种或多种酶和其它反应物的唾液酸基转移酶循环。例如参见，美国专利No.5,374,541 WO 9425615 A，PCT/US96/04790和PCT/US96/04824。例如，用来合成唾液酸基寡糖的反应物可以含有唾液酸基转移酶、CMP-唾液酸合成酶、唾液酸和唾液酸基转移酶受体、CTP和可溶的二价金属阳离子。典型的α(2，3)唾液酸基转移酶指α(2，3)唾液转移酶(sialtransferase)(EC 2.4.99.6)将唾液酸转移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal上。见，Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.，256：3159(1981)，Weinstein等，J.Biol.Chem.，257：13845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.，267：21011(1992)。另一个典型的α2，3-唾液酸基转移酶(EC 2.4.99.4)将唾液酸转移到二糖或糖苷的非还原末端Gal上。见，Rearick等，J.Biol.Chem.，254：4444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.，267：21004(1992)。其它典型的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸基转移酶(见，Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。反应混合物还含有唾液酸基转移酶的接纳体(acceptor)，较佳的有一个半乳糖基单位。合适的接纳体包括，例如，Galβ1→3GalNAc、乳糖-N-四糖、Galβ1→3GlcNAc、Galβ1→3Ara、Galβ1→6GlcNAc、Galβ1→4Glc(乳糖)、Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH3、Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH2CH3、Galβ1→4Glcβ1-OCH2C6H5、Galβ1→4GlcNAc、Galβ1→OCH3、蜜二糖、蜜三糖、木苏糖和乳糖-N-新四糖(LNnT)。反应混合物中的唾液酸不仅可以包括唾液酸本身(5-N-乙酰神经氨酸；5-N-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulosonic acid；NeuAc，有时也简称为AcNeu或NANA)，而且还包括9-取代的唾液酸，如9-O-C1-C6-乙酰基-NeuAc，如9-O-乳酸基-NeuAc或9-O-乙酰基-NeuAc、9-脱氧-9-氟代-NeuAc和9-叠氮-9-脱氧-NeuAc。这些化合物的合成和在唾液酸化过程中的应用在国际专利申请WO9216640(1992年10月1日公开)中有所描述。
在较佳的实例中，反应介质还可包括CMP-唾液酸再循环系统，它包括每摩尔唾液酸至少2摩尔的磷酸供体，催化量的腺嘌呤核苷酸、能将磷酸从磷酸供体转移到核苷二磷酸上的激酶、能将末端磷酸从核苷三磷酸转移到CMP上的核苷单磷酸激酶。例如，合适的CMP-唾液酸再生系统包括胞苷一磷酸(CMP)、核苷三磷酸(例如腺苷三磷酸(ATP))、磷酸供体(例如磷酸烯醇丙酮酸或乙酰磷酸)、能将磷酸从磷酸供体转移到核苷二磷酸上的激酶(例如丙酮酸激酶或乙酸激酶)、以及能将末端磷酸从核苷三磷酸转移到CMP上的核苷单磷酸激酶(例如肌激酶)。前述的α(2，3)唾液酸基转移酶和CMP-唾液酸合成酶也可正式看作CMP-唾液酸再生系统的一部分。对于那些不采用CMP-唾液酸再循环系统的实例来说，反应介质最好还包括磷酸酶。
丙酮酸是唾液酸基转移酶循环的副产物，它可用于另一反应中，其中N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在NeuAc醛缩酶(EC 4.1.3.3)的存在下反应形成唾液酸。另外，优点还在于GlcNac异构变成ManAc的作用，可用廉价的GlcNAc作为唾液酸产生的起始原料。这样，唾液酸可由ManNAc(或GlcNAc)和催化量的NeuAc醛缩酶代替。尽管NeuAc醛缩酶也催化逆向反应(NeuAc到ManNAc和丙酮酸盐)，但是产生的NeuAc不可逆地掺入了CMP-唾液酸合成酶催化的经由CMP-NeuAc的反应循环中。另外，用本领域已知的从GlcNAc化学转化的方法也可制得起始原料ManNAc(例如参见Simon等，J.Am.Chem.Soc.110：7159(1988))。唾液酸及其9-取代的衍生物的酶合成、以及所得唾液酸在不同唾液酸化反应方案中的应用公开在国际专利申请WO 9216640(1992年10月1日公开)中并纳入本文作参考。
当用半乳糖基转移酶来酶合成寡糖时，反应介质除了半乳糖基转移酶、供体底物、接纳体糖和二价金属阳离子外，最好还含有一个供体底物再循环系统，该系统包括每摩尔接纳糖至少1摩尔的葡糖-1-磷酸、磷酸供体、能将磷酸从磷酸供体转移到核苷二磷酸上的激酶、能从UTP和葡糖-1-磷酸形成UDP-葡萄糖的焦磷酸化酶和催化量的UDP和UDP-半乳糖-4-差向异构酶。典型的半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如见Dabkowski等，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等，Nature 345：229-233(1990))和β(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.38)。
用其它酶方法合成的寡糖也可用本发明方法纯化。例如，该方法可用来纯化非循环或部分循环反应(例如在有效地转移并使糖共价结合到接纳分子的条件下简单地培育活化的糖和合适的接纳分子与糖基转移酶)中产生的寡糖。糖基转移酶包括在例如美国专利No.5,180,674和国际专利公开号WO 93/13198和WO95/02683中描述的那些，以及由奈瑟氏菌属(Neisseria)的los基因座编码的糖基转移酶(见USPN 5,545,553)，发现它们与细胞表面结合或不结合。可用这些糖基转移酶获得的寡糖包括，例如，Galα(1→4)Galβ(1→4)Glc、GlcNAcβ(1，3)Galβ(1，4)Glc、Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc、和GalNAcβ(1→3)Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc。
可用所述方法纯化的化合物包括唾液酸和有唾液酸部分的任何糖。它们包括唾液酸基半乳糖，包括唾液酸基乳糖以及有下式的化合物：
NeuAcα(2，3)Galβ(1→4)GlcN(R′)β-OR或
NeuAcα(2，3)Galβ(1→4)GlcN(R′)β(1→3)Galβ-OR。
在这些化学式中，R′是1-8个碳原子的烷基或酰基、5，6，7，8-四氢-2-萘酰氨基；苯甲酰氨基、2-萘酰氨基；4-氨基苯甲酰氨基；或4-硝基苯甲酰氨基。R是氢、C1-C6的烷基、糖、寡糖或至少有一个碳原子的糖苷配基。术语“至少有一个碳原子的糖苷配基”指基团-A-Z，其中A代表1-18个碳原子的亚烷基，该亚烷基可被卤素、巯基、羟基、氧、硫、氨基、亚氨基或烷氧基；Z是氢、-OH、-SH、-NH2、-NHR1、-N(R1)2、-CO2H、-CO2R1、-CONH2、-CONHR1、-CON(R1)2、-CON(R1)2或-OR1，其中R1独立为1-5个碳原子的烷基。此外，R可以是其中n，m，o＝1-18；(CH2)n-R2(其中n＝0-18)中的R2是各种取代的芳环，较佳的是被一个或多个烷氧基(最好是甲氧基或O(CH2)mCH3(其中m＝0-18)，或其组合)取代的苯基。R还可以是3-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙基。
本发明还可用来纯化包含结合选择蛋白的糖部分的各种化合物。这些选择蛋白结合部分有以下通式：
R1Galβ1，m(Fucα1，n)GlcNR0(R2)p-
其中R0是(C1-C8烷基)羰基、(C1-C8烷氧基)羰基或(C2-C9链烯基氧)羰基，R1是有下式的寡糖
R3和R4可以相同或不同，可以是H、取代或非取代的C1-C8烷基、羟基-(C1-C8烷基)、芳基-(C1-C8烷基)或(C1-C8烷氧基)-(C1-C8烷基)。R2可以是H、C1-C8烷基、羟基-(C1-C8烷基)、芳基(C1-C8烷基)、(C1-C8烷基)-芳基、烷基硫代、α1，2Man、α1，6GalNAc、β1，3Galβ1，4Glc、α1，2Man-R8、α1，6GalNAc-R8、和β1，3Gal-R8。R8可以是H、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基-(C1-C8烷基)、芳基-(C1-C8烷基)、(C1-C8烷基)芳基或烷基硫代。在该式中，m和n是整数，可以是3或4；p可以是0或1。
上述取代基可以由羟基、羟基(C1-C4烷基)、多羟基(C1-C4烷基)、烷醇酰氨基或羟基烷醇酰氨基取代基取代。较佳的取代基包括羟基、多羟基(C3烷基)、乙酰氨基和羟基乙酰氨基。取代基可以有一个以上的取代基，它们可以相同或不同。
对于R1是寡糖的实例，该寡糖宜为三糖。较佳的三糖包括NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAcβ1，3或NeuGcα2，3Galβ1，4GlcNAcβ1，3。
对于R1是下式的实例来说，
R3和R4宜形成化学式为-R5-或-(R6)q-O-(R7)r-的一个基团，
其中R5是取代或非取代的C3-C7二价烷基，R6和R7相同或不同，是取代或非取代的C1-C6二价烷基。在该式中，q和r是整数，可以相同或不同，可以是0或1。q和r的总和至少为1。
R3和R4形成的单一基团的更佳的结构是化学式为-(R6)-O-的基团，其中R6是取代或非取代的C3-C4二价烷基。例如，R6式为-CH2-CH2-CH2-CH2-，最好是取代的。此基团可以用羟基、多羟基(C3烷基)和取代或非取代的烷醇酰氨基，如乙酰氨基或羟乙酰氨基取代。取代后的结构通常形成单糖，较佳的是唾液酸如NeuAc或NeuGc，将α2，3连接到Gal残基上。
在上述通式中，m和n是整数，可以是3或4。因此，在一组结构中，Gal与GlcNAcβ1，4连接，Fuc与GlcNAcα1，3连接。该式包括SLex四糖。SLex的化学式为NeuAcα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAcβ1-。该结构被携带LECCAM的细胞选择性识别。可用本发明的方法纯化的SLex化合物包括NeuAcα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAcβ-1-Gal-OEt、NeuAcα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAcβ1，4Galβ1-OEt，以及国际申请WO91/19502描述的其它化合物。可用该方法纯化的其它化合物包括美国专利No.5,604,207中描述的有下式的化合物
其中Z是氢，C1-C6酰基或
Y选自C(O)、SO2、HNC(O)、OC(O)和SC(O)；
R1选自芳基、取代的芳基、苯基C1-C3亚烷基、其中所述芳基取代基选自卤素、三氟甲基、硝基、C1-C18烷基、C1-C18烷氧基、氨基、单-C1-C18烷基氨基、二-C1-C18烷基氨基、苄基氨基、C1-C18烷基苄基氨基、C1-C18硫代烷基和C1-C18烷基甲酰氨基，或
R1Y是烯丙氧羰基或氯乙酰基；
R2选自单糖(包括β1，3Gal-OR，其中R＝H、烷基、芳基或酰基)、二糖、氢、C1-C18直链、支链或环状烃基、C1-C6烷基、3-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙基、C1-C5亚烷基ω-羧酸盐、ω-三取代的甲硅烷基C2-C4亚烷基，其中所述ω三取代的甲硅烷基是有三个独立取代基的甲硅烷基，它们独立选自C1-C4烷基、苯基，
或OR2一起形成C1-C18直链、支链或环状烃基氨基甲酸酯；
R3是氢或C1-C6酰基；
R4是氢、C1-C6烷基或苄基；
R5选自氢、苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基和C1-C6酰基；R7是甲基或羟基甲基；和
X选自C1-C6酰氧基、C2-C6羟基酰氧基、羟基、卤素和叠氮基。
通式中包括的一组相关的结构是Gal与β1，3连接，Fuc与α1，4连接。例如，四糖NeuAcα2，3Galβ1，3(Fucα1，4)GlcNAcβ1-，这里称为SLex，由选择蛋白受体识别。见，Berg等，J.Biol.Chem.，266：14869-14872(1991)。Berg等人特别示出了E-选择蛋白cDNA转化的细胞可选择性地结合包括SLex在内的新糖蛋白。
本发明的方法还可用于纯化有通式Galα1，3Gal-的寡糖化合物，其包括Galα1，3Galβ1，4Glc(R)β-O-R1，其中R1是-(CH2)n-COX，X为OH、OR2、-NHNH2，R为OH或NAc，R2是氢、糖、寡糖或至少有一个碳原子的糖苷配基，n是2-18的整数，更佳的为2-10。例如，用实施例7-8所述的步骤可纯化化学式为Galα1，3Galβ1，4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH的化合物。按照本发明纯化的化合物中包括乳糖-N-新四糖(LNnT)、GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glc(LNT-2)、唾液酸基(α2，3)-乳糖和唾液酸基(α2，6)-乳糖。
在上述描述中，术语通常采用其标准含义。本文所用的术语“烷基”指有支链或无支链的、饱和或不饱和的、单价或二价的1-20个碳原子的烃基，包括1-8个碳原子的低级烷基(如甲基、乙基、正丙基、丁基、正己基等)，环烷基(3-7个碳原子)、环烷甲基(4-8个碳原子)和芳烷基。术语“烷氧基”指通过氧连接分子其余部分的烷基，例如乙氧基、甲氧基或正丙氧基。术语“烷基硫代”指通过硫与分子其余分布连接的烷基。术语“酰基”指从有机酸除去羟基而衍生得到的基团。例子包括乙酰基、丙酰基、油酰基、肉豆蔻酰基。
术语“芳基”指通过除去一个原子从芳烃衍生获得的基团，例如从苯获得苯基。芳烃可以有一个以上的不饱和碳环，如萘基。
术语“烷氧基”指通过氧与分子其余部分连接的烷基，例如乙氧基、甲氧基或正丙氧基。
术语“烷基硫代”指通过硫与分子其余部分连接的烷基。
术语“烷醇酰氨基”的通式为-NH-CO-(C1-C6烷基)，可被取代或不取代。如果被取代，取代基通常为羟基。该术语特别包括两个较佳的结构，乙酰氨基(-NH-CO-CH3)和羟乙酰氨基(-NH-CO-CH2-OH)。
术语“杂环化合物”指有三个或多个原子的环状化合物，其中至少一个原子非碳原子(例如是N、O、S、Se、P或As)。这些化合物的例子包括呋喃(包括五糖的呋喃糖形式，如岩藻糖)、吡喃(包括六糖的吡喃糖形式，如葡萄糖和半乳糖)、嘧啶、嘌呤、吡嗪等。
本发明的方法不仅可用来纯化新合成的糖类，而且还可纯化降解(如酶降解)产物。例如参见，Sinnott，M.L.，Chem.Rev.90：1171-1202(1990)中关于催化寡糖降解的酶的例子。
本发明还提供了纯化核苷酸、核苷酸糖及相关化合物的方法。例如用本文所述的方法可纯化核苷酸糖，如GDP-岩藻糖、GDP-甘露糖、CMP-NeuAc、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰半乳糖胺等。该方法还适用于纯化核苷酸和处于各种磷酸化状态的核苷酸(如CMP、CDP、CTP、GMP、GDP、GTP、TMP、TDP、TTP、AMP、ADP、ATP、UMP、UDP、UTP)，以及这些和其它核苷酸的脱氧形式。
提供下列实施例以便于描述，它们并不意味着限制或限定了本发明。
实施例
实施例1-5说明了唾液酸基乳糖的合成以及用纳滤和离子交换进行的纯化。概括地说，N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)是在碱性条件下从N-乙酰-D-葡糖胺(GluNAc)获得。ManNAc与丙酮酸钠促酶缩合生成唾液酸。用唾液酸转移酶循环将唾液酸转变成唾液酸基乳糖，然后用纳滤和离子交换纯化。实施例6说明了用纳滤来分离有机物和无机盐。实施例说明了聚苯甲酰胺纳滤膜的分离性能。实施例8说明聚酰胺纳滤膜的分离性能。
实施例1
唾液酸的合成和纯化
本实施例说明了用相对廉价的底物GlcNAc来合成唾液酸的方法(而不是用较昂贵的ManNAc来合成或直接采用唾液酸)。采用类似于Simon等，J.Am.Chem.Soc.110：7159(1988)所述的步骤来将GlcNAc转变成ManNAc。简言之，将GlcNAc(1000g，4.52摩尔)溶解在500毫升水中。用50％氢氧化钠(约115毫升)将pH调至12.0。在氩气下搅拌溶液7.5小时，然后在冰浴中冷却，用浓盐酸(约200毫升)将pH调至7.7。然后通过ManNAc的醇醛缩合形成唾液酸。÷
为了获得唾液酸，使前一步中产生的ManNAc受N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)醛缩酶和丙酮酸介导的醇醛缩合。在含约57克(0.258摩尔)ManNAc和193克GlcNAc(来自碱催化的差向异构作用)的1.5升水溶液中加入123.8克丙酮酸钠(1.125摩尔)、1.5克牛血清白蛋白和0.75克叠氮钠。将pH调至7.5，加入11930U唾液酸醛缩酶。使溶液在37℃下培育7天。Aminex HPX87H(BioRad)柱(0.004M硫酸，0.8毫升/分钟，监测A220)上的HPLC分析表明，溶液含有0.157M唾液酸(91％的ManNAc转化，0.235摩尔)。
实施例2
用唾液酸基转移酶循环合成唾液酸基乳糖
在实施例1制得的唾液酸中加入乳糖单水合物(79.2克，0.22摩尔)、0.7克牛血清白蛋白、磷酸烯醇丙酮酸一钾盐(37克，0.22摩尔)，pH调至7.5。加入CMP(2.48克，0.0088摩尔)、ATP(0.54克，0.0009摩尔)，将pH调至7.5。加入叠氮钠(0.35克)，以及下列酶：丙酮酸激酶(19800U)、肌激酶(13200U)、CMP唾液酸合成酶(440U)和唾液酸基转移酶(165U)。加入66毫升MnCl2，用水将最终体积调至2.2升。使反应在室温下进行。
每日用薄层层析(TLC)监测反应，用离子层析测定[Mn2+]。如表1所示进行添加/调节：
表1
第2天 加入44毫升1M MnCl2
第4天 加入43毫升1M MnCl2
第6天 加入34.3毫升1M MnCl2，37克PEP；重新调节pH7.5；丙酮酸激酶(19800U)、肌激酶(13200U)、CMP唾液酸合成酶(440U)和唾液酸基转移酶(165U)
第7天 31.7毫升1M MnCl2
第8天 24.6毫升1M MnCl2
第9天 44毫升1M MnCl2
第10天 30.8毫升1M MnCl2
第11天 31.7毫升1M MnCl2
第12天 24.6毫升1M MnCl2，重新调节pH7.5
第13天 440U CMP唾液酸合成酶，82.5U唾液酸基转移酶
第14天 重新调节pH7.5
第16天 37.7毫升1M MnCl2，19800U丙酮酸激酶，13200U肌激酶
第17天 26克磷酸烯醇丙酮酸，三钠盐
经TLC测得，唾液酸基乳糖产率约为70-80％。
实施例3
用唾液酸基转移酶循环合成唾液酸基乳糖
本实施例描述了用唾液酸基转移酶循环并对锰离子浓度进行控制以生产α-N-乙酰神经氨酸(2，3)β-半乳糖基(1，4)葡萄糖。
在聚丙烯容器中，将磷酸烯醇丙酮酸三钠盐(285.4克，1.22摩尔)和唾液酸(197克，0.637摩尔)溶解在5升水中，用6M氢氧化钠调节pH至7.1。加入胞苷-5′-单磷酸(5.14克，15.9毫摩尔)和氯化钾(7.9克，0.106摩尔)，用6M氢氧化钠重新调节pH至7.45。加入丙酮酸激酶(28000单位)、肌激酶(17000单位)、腺苷三磷酸(0.98克，1.6毫摩尔)、CMP NeuAc合成酶(1325单位)、α2，3唾液酸基转移酶(663单位)和MnCl2·4H2O(52.4克，0.265摩尔)并混合。在所得混合物的3.7升部分中加入乳糖(119克，0.348摩尔)和叠氮钠(1.75克)。使反应混合物保持在室温下，每日用薄层层析(TLC)和离子层析监测。两天后，如下加入额外的酶：丙酮酸激酶(38100单位)、肌激酶(23700单位)、CMP NeuAc合成酶(935单位)和α2，3唾液酸基转移酶(463单位)。定期用6M氢氧化钠将pH调至7.5。另外测定锰离子浓度并如下表2所示添加。
表2 天数 [Mn++] (测定值，mM) Mn++的损失 (从前一天) 添加量(1M的毫升数，加入后的最终浓度 1 28 22.0 没有 2 23.9 4.1 没有 3 10.7 13.2 111毫升，+30mM 4 1.4 3.9.3 111毫升，+30mM 5 3.0 28.4 148毫升，+40mM 6 12.9 30.1 74毫升，+20mM 7 10.0 22.9 80毫升，+20mM 8 12.0 18.0 80毫升，+20mM 9 24.3 7.7 没有
在第9天时，TLC表明反应基本完全。如表中结果所示，Mn++的损耗导致几乎每天均需加入MnCl2·4H2O以维持金属离子浓度。锰离子是唾液酸基转移酶循环中至少一种酶所需的辅助因子。然而，锰离子和产生的无机磷酸盐形成了溶解度非常低的配合物。由于在溶解度的限制，转移酶循环能虽然继续进行，但反应速度减慢。通过添加补充因与焦磷酸盐沉淀而损失的锰离子，可以维持反应速度。因此，当锰离子浓度维持在最适范围内时，唾液酸基转移酶反应循环可以趋向完全。
实施例4
用离子交换和反渗透纯化唾液酸基乳糖
本实施例描述了实施例2制得的三糖经过乙酰化和酯化后的核查和纯度。使唾液酸基转移酶在合适的乳糖辅因子(55克)下产生的5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-nonulo吡喃糖基酯-(2-3)-O-β-D-半乳糖吡喃糖基-(1-4)-O-β-D-葡糖吡喃糖钠溶液(2升)过滤通过滤纸。使滤液通过3000-10000分子量截留的滤膜，以从所需产物中除去蛋白。使洗脱液在合适的装置(Cat.No.CDRN500 60，Millipore，Bedford，MA)中的聚酰胺反渗透膜上进行浓缩和脱盐。将含有产物的保留物蒸发成稠浆。还可任选地用螯合树脂处理保留液，以除去二价阳离子。在过滤后，含有所需产物的滤液基本上不含盐，经1Hmr光谱法显示，其纯度高。另外，用吡啶(2×200毫升)蒸发浆状物两次。在蒸发瓶中加入1.2升吡啶中的N，N-二甲基氨基吡啶(2.2克)溶液。在1小时内加入乙酸酐(0.83升)。使所得混合物在室温下缓慢搅动24-48小时。用TLC(甲醇∶二氯甲烷为1∶9)监测反应。在反应结束后，抽真空，蒸发溶液，获得残余物。
将残余物溶解在1.5升乙酸乙酯中。用5％盐酸水溶液(1.5升)洗涤该溶液，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(1.5升)洗涤，最后用水(1.5升)洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层并过滤。将滤液浓缩成半固态残余物。将过-O-乙酰基化乳糖三糖(69克)溶解在甲醇(350毫升)中，加入甲醇钠溶液(17.5毫升，25％，在甲醇溶液中)，然后加入3.5毫升水。当用异丙醇∶氢氧化铵∶水为7∶1∶2进行TLC显示反应结束时，在溶液中加入乙酸(2毫升)。在溶液中加入乙醚(180毫升)，使产物沉淀。过滤该固体，并溶解在水中(350毫升)。在该溶液中加入炭24克，在60℃下加热至1小时。然后将该溶液冷却至室温并过滤。蒸发滤液，获得固态产物(34克)。1H-NMR光谱法显示，该固体是纯的唾液酸基乳糖，其含有11％重量的乙酸钠。
实施例5
用纳滤纯化唾液酸基乳糖
用MWCO为10kDa的超滤膜对类似于实施例2所述的反应混合物进行过滤，以除去蛋白。经下述标准磷试验步骤测得，磷酸浓度[PO43-]大于2.8mM。
用浓盐酸(约500毫升)调节溶液至pH3.0。然后使其在pH3下在Osmonics213T膜纯化仪(膜类型为MX07)上纯化3-5小时，直至渗滤液的电导率保持不变。然后从仪器上洗下溶液，合并的清洗液和原料液用氢氧化钠处理至pH为7.4。如下所述用HPLC测定Mn2+浓度。纳滤参数如下：
操作压力：Pf＝100psi
浓缩液流速：Qc＝5GPM
渗滤液流速：Qf＝7GPH
温度范围：20-40℃
体积：5加仑
最初的渗滤液电导率为28.1mS；再循环5小时后，电导率降低至115μS，磷酸根浓度[PO43+]减少至770μM，锰浓度[Mn2+]为3.4mM。
然后调节溶液至pH7.4，在膜纯化仪(Osmonics，膜类型为MX07)上进一步纯化约1小时，直至渗滤液的电导率保持不变。然后将溶液从膜仪器上洗出。纳滤参数为：
操作压力：Pf＝100psi
浓缩液流速：Qc＝5GPM
渗滤液流速：Qf＝0.3GPH
温度范围：20-40℃
体积：5加仑
过滤结果如下：
电导率：最初渗滤液电导率：2.01mS
再循环5小时后：93.7μS
磷酸根浓度：[PO43-]＝410μM
锰浓度：[Mn2+]＝3.0mM
然后用AG50WX8(H+)树脂(BioRad，1.18千克)处理上述溶液(6Gal)，搅拌2小时直至pH＝2.0。然后过滤树脂以提供非常亮的黄色溶液。HPLC监测到只有少量[Mn2+]。然后用氢氧化钠(50％w/w)将溶液中和至pH7.4。树脂处理前： [Mn2+]＝3mM [PO43-]＝410μM树脂处理后： pH＝3，[Mn2+]＝1.23mM
pH＝2，[Mn2+]＝6.8μM [PO43-]＝190μM
用AG1X8(乙酸盐形式)树脂处理上述一些少部分的溶液，以进一步除去磷酸盐。结果显示在下表3中：
表3 样品体积(毫升) 树脂重量(克) 搅拌时间(小时) [PO43-]μM 50毫升 0.25克 1 86 50毫升 0.5克 1 41 50毫升 1.0克 1 30 50毫升 2.0克 1 8
用Osmonic膜纯化仪(Osmonic MX07)使溶液再循环，在下述条件下纯化溶液5小时：
操作压力：Pf＝100psi
浓缩液流速：Qc′＝5GPM
渗滤液流速：Qf＝0.2GPH
温度范围：20-40℃
体积：5加仑
结果如下：
渗滤液电导率：最初渗滤液电导率：0.136mS
分离5小时后：45μS
然后，将溶液浓缩至3-4升，然后加入活性炭(J.T.Baker，180克)。使悬浮液加热至55℃2小时。然后过滤除去炭，得到非常亮的黄色溶液，其冻干呈白色固体。
表4中显示了上述纯化获得的唾液酸基乳糖溶液的分析数据。
表4 测定 结果 方法 PO43-含量 330ppm(重量) 磷酸盐测定法1 核苷酸/核苷含量a)未测(ABS280＝0.0)b)未测UV(0.1mM，唾液酸基乳糖) 1H-NMR Mn2+含量 80ppm(重量) HPLC2测得 唾液酸基乳糖含量 71％1H-NMR(用1，2-异亚丙基D- 葡萄糖呋喃糖作为标准) 唾液酸含量 约2％ 1H-NMR 乳糖含量 未测 1H-NMR 乙酸盐含量 未测 1H-NMR N-乙酰葡糖胺含量 未测 1H-NMR 丙酮酸盐含量 未测 1H-NMR
1磷酸测定法
用去离子水(775μl)稀释未知样品(100μl)。然后用100μl酸性钼酸盐(将1.25克钼酸铵溶解在100μl 2.5N硫酸中制得)、25μl Fiska Subha Row溶液(粉末购自Sigma，并按生产商说明书制备)处理该溶液。100℃加热该混合物7分钟，然后记录810nm下的吸光度。与磷酸标准曲线比较，以确定浓度。
2HPLC试验测定Mn2+浓度：
柱：Alltech Universal阳离子柱，0.46×10cm
监测器：Alltech302型电导率监测器
流动相：3mM酞酸，0.5mM吡啶二羧酸
流速：1.5毫升/分钟
柱烘箱温度：35℃。
实施例6
纳滤分离有机物和无机盐
测试各种纳滤膜分离出水溶液中各种有机化合物和无机盐的能力。在两个不同的pH下对膜进行测试，以证明通过调节某些化合物的离子电荷可以调节分离分布图。结果如表5所示。
测试的纳滤膜是Osmonics，Inc.(Minnetonka MN)生产的MX07、SX12和B006，以及Osmonics，DeSalination Systems生产的DL2540。MX07膜如上述实施例5所述方式使用。其它膜的参数列于表6。
表5：30分钟内通过膜的化合物百分数 膜 MX07a SX12a B006a DL2540a pH7.5 pH3.0 pH7.5 pH3.0 pH7.5 pH3.0 pH7.5 pH3.0 化合物 磷酸钠 10 46 20 39 15 64 1.8b 锰 86 40 40 92 92 丙酮酸钠 35 59 45 65 34 65 GlcNAc 70 28 84 12 乳糖 36 ＜5 通过 蜜三糖 0 0 8 52 唾液酸 12 5 ＜1 1 钠 56 CMP ＜1 ＜1 PEP ＜1 8
注意：a通过％根据30分钟时的分离程度
b在20℃和40℃下测试
GluNAc：N-乙酰-D-葡糖胺
PEP：2-磷酸烯醇丙酮酸三钠盐
CMP：胞苷5′-单磷酸
膜MX07、SX12、B006购自Osmonics，Inc.，DL2540购自
Osmonics，Desalination Systems(Escondido，CA)。
表6 SX12 B006 DL2540 压力(Pf)(PSI) 200 100 200 浓缩液流速 (Qc)(GPM) 4.5 4 4 渗滤液流速 (Qf)(GPM) 0.2 0.5 0.6 温度范围(℃) 20-40 20-40 20-40 体积(Gal) 5 5 5
实施例7
聚苯甲酰胺纳滤膜的分离性能
本实施例描述的试验证明了平板式和螺旋缠绕形式的聚苯甲酰胺膜(YK，Osmonics)可有效地纯化糖。在各种pH水平下测试膜对糖和盐的通过和保留作用。
材料和方法
A.平板式和螺旋缠绕式仪器操作和膜制备。
首先彻底清洗有YK膜的脱盐膜仪器(Osmonics，Desalination Systems，Escondido，CA)，清洗4到5次，每次用大约1升蒸馏水。将水倒入进料槽中，循环约1分钟(约100psi)，将排水阀逆时针转到开位，排空。排水后关闭阀门，重复该过程4-5次。在清洗后，再加入1升以上的水。重新使系统在150psi的压力下循环30分钟，然后排空。然后将带膜系统用于下列试验。
在每次试验结束后，如上所述那样水洗仪器3-4次。然后使大约1升水在100-150psi下再循环约15-20分钟，并从仪器内排空。如果怀疑一些试验化合物仍残留在仪器中，有时此步后还可进行额外的简单清洗。应始终监测电导率，以确保所有样品已除去。如果电导率仍然很高，则清洗仪器直至基本监测不到污染物。大多数离子化合物很容易被除去，例外的是MnCl2，它还需要1或2次额外的简短的清洗。
B.盐的测试
为了测定对各种盐的保留性能，用平板式膜测试下列盐的10mM溶液：MnCl2、NaH2PO4、NaC3H3O3、NaOAc、Na4P2O7、苯甲酸钠、MgSO4、NaN3、和NaCl。将一种盐的1升溶液倒入进料槽中，在100psi下再循环约15分钟。此时，收集渗滤液和浓缩液样品，用电导率仪测定。此后，每隔5分钟收集样品，每个样品运行总共至少收集三次。将渗滤液的电导率除以浓缩液的电导率，算得通过膜的盐的百分数(“通过百分数”)。
当首次运行结束后，将溶液的pH降低至pH3.0，可能的话，采用测试的盐的共轭酸。在调节pH时，使溶液再循环，以确保仪器内的溶液充分混合。重复测试过程，并测定渗滤液和浓缩液的电导率。然后用共轭碱将溶液pH提高至约为7.0，再次在新的pH下重复运行。再次测定渗滤液和浓缩液的电导率。
C.糖的测试
测试的糖包括唾液酸基乳糖、乳糖、N-乙酰葡糖胺、NeuAcα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAcβ1，4Galβ1-OEt(化合物I)、Galα1，3Galβ1，4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH(化合物II)、LNT-2、LNnT、CMP、胞苷、和唾液酸。将糖溶液(1升)倒入进料容器中，在100psi下再循环至少10分钟。在10分钟时取渗滤液和浓缩液样品，在15分钟时再取渗滤液另一样品。用TLC肉眼比较样品。任何pH调节采用HCl和/或NaOH。
结果：
A.平板式膜
平板式聚苯甲酰胺纳滤膜(YK002，在YV+纸背衬上，Osmonics)对各种盐和糖的保留性能显示在表7中。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为2-8毫升/分钟。
表7 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 100 66 12 9.8 NaH2PO4 10mM 100 82 15 4.6 丙酮酸钠 10mM 100 80 36 9.8 氯化钠 10mM 100 - - 18唾液酸基乳糖*** 10g/L 100 0 - 0 化合物I*** 10g/L 100 0 - 0 化合物II*** 2g/L 100 0 - 0 LNT-2*** 0.4g/L 100 0 - 0 LNnT*** 0.35g/L 100 0 - 0 乳糖 10g/L 100 0.0 0.3 - GlcNAc 10g/L 100 5.9 - 3.7 Na4P2O7 10mM 100 19 2.0 1.4 唾液酸*** 10mM 100 0 - - 胞苷*** 1g/L 100 0 - 痕量 CMP*** 1g/L 100 0 - 0 苄醇*** 1.5％(体积) 100 - - 100 NaN3 10mM 100 81 - 67 MgSO4 10mM 100 38 - 2.9 苯甲酸 约0.5g/L 100 99 - - 苯甲酸钠 2.5％ 100 - - 42
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.8-5.6
“pH7”范围为6.1-7.4
***用TLC肉眼测定
B.螺旋膜
螺旋状聚苯甲酰胺纳滤膜(YK1812CZA；Osmonics)对各种盐和糖的保留性能显示在表8中。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为3毫升/秒。
表8 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 100 50 - 40(pH6.2) NaH2PO4 10mM 100 67 49 19 NaOAc 10mM 100 - 81 65 丙酮酸钠 10mM 100 81 - 26 氯化钠 10mM 100 79 78 -唾液酸基乳糖*** 10g/L 100 0 - 0 化合物I*** 10g/L 100 0 - 0 化合物II*** 2g/L 100 0 - 0 LNT-2*** 0.4g/L 100 0 - 0 乳糖 10g/L 100 0.59 - 2.3 GlcNAc 10g/L 100 13 7.1 19 Na4P2O7 10mM 100 65 - 5.2 唾液酸*** 10mM 100 0 - 0 胞苷*** 1g/L 100 约10 - 约5-10 CMP*** 1g/L 100 痕量 - 痕量 苯甲酸钠 约0.5g/L 100 93 - 97
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.5-5.2
“pH7”范围为6.6-7.0
“pH3”范围为2.8-3.4
***用TLC肉眼测定
#“痕量”指TLC上肉眼勉强观察得到。
这些结果表明YK002平板式膜和YK1812CZA螺旋膜保留了唾液酸基乳糖以及化合物I和II、LNT-2和LNnT，而使离子化合物通过，使得这种膜是纯化这些糖的良好选择。
实施例8
聚酰胺纳滤膜的分离性能
本实施例描述了对几种平板式和螺旋缠绕式的聚酰胺膜在纯化糖用途中的评价。在各种pH水平下测试膜对糖和盐的通过或保留作用。
材料和方法
A.平板式和螺旋缠绕式仪器操作和膜制备。
首先彻底清洗有聚酰胺膜G-5(GE；Osmonics)的脱盐膜仪器(Osmonics，Desalination Systems，Escondido，CA)，清洗4到5次，每次用大约1升蒸馏水。将水倒入进料槽中，循环约1分钟(约100psi)，用排水阀排空水。排空后关闭阀门，重复该过程4-5次。在清洗后，再加入1升以上的水。使系统在150psi的压力下再循环30分钟，然后排空。然后，带膜系统已准备好可用于下列试验。
在每次试验后，如上所述那样水洗仪器3-4次。然后使大约1升水在100-150psi下再循环约15-20分钟，并从仪器内排空。如果怀疑一些试验化合物仍残留在仪器中，有时此后还可进行额外的简单清洗。始终监测电导率，以确保所有样品被除去。如果电导率仍然很高，则清洗仪器直至基本测不出污染物。大多数离子化合物很容易被除去，例外的是MnCl2，它还需要1或2次额外的简短清洗。
B.盐的测试
用平板式膜测试下列盐的10mM溶液：MnCl2、NaH2PO4、NaC3H3O3和NaCl。将一种盐的1升溶液倒入进料槽中，在100psi下再循环约15分钟。此时，收集渗滤液和浓缩液样品，用电导率仪测定。此后，每隔5分钟收集样品，每个样品运行总共至少收集三次。将渗滤液的电导率除以浓缩液的电导率，算得通过百分数。当运行结束后，将溶液的pH降低至3.0，可能的话，采用测试盐的共轭酸。在调节pH时，使溶液再循环，以确保仪器内的溶液充分混合。重复测试过程，如上所述收集数据。然后用共轭碱将pH提高至约7.0，再次在新的pH下重复。然后如上所述排空并清洗。
C.糖的测试
测试的糖包括唾液酸基乳糖、乳糖、NeuAcα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAcβ1，4Galβ1-OEt(化合物I)、Galα1，3Galβ1，4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH(化合物II)、LNT-2、LNnT。将糖溶液(1升)倒入进料容器中，在100psi下再循环至少10分钟。在10分钟时取渗滤液和浓缩液样品，在15分钟时再取渗滤液另一样品。用TLC肉眼比较样品。任何pH调节采用HCl和/或NaOH。在对糖进行测试后，将其转移至Pyrex烧瓶中以备再次用于其它膜。
结果：
A.平板式膜
平板式聚酰胺纳滤膜(G-10(GH，Osmonics)对各种盐和糖的保留性能显示在表9中。膜的A-值为10.0，自来水透过百分数为62.8(用2000ppmMgSO4在室温下测得)。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为5-8毫升/分钟。
表9 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 200 82.4 82.4 84.6 NaH2PO4 10mM 200 33.0 18.0 10.5 丙酮酸钠 10mM 200 49.4 - 8.9 氯化钠 10mM 200 - - 17.8唾液酸基乳糖*** 10g/L 200 ＜5 - ＜5 化合物I*** 10g/L 200 - - 0 化合物II*** 2g/L 200 0 - - LNT-2*** 0.4g/L 200 - - 痕量# LNnT*** 0.35g/L 200 - - 痕量# 乳糖 10g/L 200 2.0 - 4.2
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.8-5.6
***用TLC肉眼测定
#“痕量”指TLC上肉眼勉强观察得到。
在另一个试验中，测试A-值为8.0、自来水透过百分数为38.9的G-10(GH)聚酰胺膜。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为6-8毫升/分钟。结果列于表10中。
表10 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 200 70.8 - 77.7 NaH2PO4 10mM 200 39.4 32.1 16.2 丙酮酸钠 10mM 200 60.8 - 21.8 氯化钠 10mM 200 - - 14.2唾液酸基乳糖*** 10g/L 200 痕量# - 痕量# 化合物I*** 10g/L 200 - - 0 化合物II*** 2g/L 200 痕量# - - LNT-2*** 0.4g/L 200 - - 痕量# LNnT*** 0.35g/L 200 - - 痕量# 乳糖 10g/L 200 3.8 - 22.1
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.8-5.6
***用TLC肉眼测定
还测试了G-5(GE)聚酰胺膜(A-值为3.9，自来水透过百分数为33.9)。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为3-5毫升/分钟。结果列于表11中。
表11 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 200 77.6 80.1 81.8 NaH2PO4 10mM 200 30.0 8.6 4.8 丙酮酸钠 10mM 200 48.2 - 8.4 氯化钠 10mM 200 - - 15.0唾液酸基乳糖*** 10g/L 200 0 - 0 化合物I*** 10g/L 200 - - 0 化合物II*** 2g/L 200 0 - - LNT-2*** 0.4g/L 200 - - 0 LNnT*** 0.35g/L 200 - - 0 乳糖 10g/L 200 6.3 - 15.1
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.8-5.6
***用TLC肉眼测定
HL(Osmonics)聚酰胺膜对糖和盐的保留性能显示于表12中。试验在25-35℃下进行，渗滤液流速为8-13毫升/分钟。
表12 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 100 48 22 23 NaH2PO4 10mM 100 67 24 7.5 丙酮酸钠 10mM 100 76 29 16 氯化钠 10mM 100 71 66 -唾液酸基乳糖*** 10g/L 100 0 - 0 乳糖 10g/L 100 1.9 4.1 -
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.5-5.8
***用TLC肉眼测定
B.螺旋缠绕式膜
还测定了螺旋缠绕式状聚酰胺膜对盐和糖的保留性能。GH1812CAZ膜(Osmonics)在25-35℃下进行测试，渗滤液流速为1.5-2毫升/秒。结果列于表13。
表13 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 100 93 94 - NaH2PO4 10mM 100 69 29 19 丙酮酸钠 10mM 100 68 - 42 氯化钠 10mM 100 66 61 64唾液酸基乳糖*** 10g/L 100 痕量# - 痕量# 化合物I*** 10g/L 100 0 - 0 化合物II*** 2g/L 100 0 - 0 LNT-2*** 0.4g/L 100 痕量# - 痕量# 乳糖 10g/L 100 73 - 34 GlcNAc 10g/L 100 48 - 56 Na4P2O7 10mM 100 13 - 5.7 唾液酸*** 10mM 100 25-50 - - 胞苷*** 1g/L 100 ＞50 - ＞50 CMP*** 1g/L 100 ＞50 - ＞50 苯甲酸钠 约0.5g/L 100 90 - -
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.5-5.6
“pH7”范围为6.1-7.4
***用TLC肉眼测定
#“痕量”指TLC上肉眼勉强观察得到。
GE1812CAZ螺旋缠绕式聚酰胺膜(Osmonics)在25-35℃、降低的渗滤液流速0.9毫升/秒下测试所得结果列于表14中。
表14 材料 浓度压力(psi) 通过％* pH3.0 pH5** pH7 MnCl2 10mM 100 90 94 - NaH2PO4 10mM 100 54 14 8.7 NaOAc 10mM 100 98 - 24 丙酮酸钠 10mM 100 73 - 45 氯化钠 10mM 100 54 - 44唾液酸基乳糖*** 10g/L 100 0 - 0 化合物I*** 10g/L 100 0 - 0 化合物II*** 2g/L 100 0 - 0 乳糖 10g/L 100 41 - 43 GlcNAc 10g/L 100 72 - 69 MgSO4 10mM 100 50 37 - Na4P2O7 10mM 100 11 - 4.7 唾液酸I*** 10mM 100 痕量# - 痕量# 胞苷*** 1g/L 100 ＞50 - ＞50 CMP*** 1g/L 100 ＞50 - ＞50 苯甲酸钠 约0.5g/L 100 63 40 -
*通过％是渗滤液中物质的量与浓缩液中物质的量之百分比。
**“pH5”范围为4.8-5.6
***用TLC肉眼测定
#“痕量”指TLC上肉眼勉强观察得到。
这些结果表明，G-10(GH)(A值为10)、G-10(GH)(A值为8)平板式膜以及GH1812CZA螺旋缠绕式膜使离子通过，但不能有效保留唾液酸基乳糖或类似的三糖。G-5(GE)(A值为3.9)平板式膜和GE1812CZA螺旋缠绕式膜可保留唾液酸基乳糖、化合物I和II、LNT-2和LNnT，并使离子化合物通过。
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上述描述是描述性的，无限制性。在参照了本文公开内容后，本领域技术人员很容易对本发明作许多变化。例如，许多底物、酶和反应条件可替代入糖基转移酶循环中，这是本发明的一部分，没有脱离本发明的范围。因此本发明的范围不应根据上述描述来确定，而是应根据所附权利要求及其等价的全部范围来确定。