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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610273952.X (22)申请日 2016.04.28 (83)生物保藏信息 CGMCC No.12188 2016.03.07 (71)申请人 中国科学院上海高等研究院 地址 201210 上海市浦东新区海科路99号 (72)发明人 史吉平颜薇芝孙俊松雷艳芳 余从田张汉强郝健姜标 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 郭婧婧许亦琳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1。
2、/01(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (54)发明名称 一株兼具异养硝化和好氧反硝化能力的高 效脱氮菌株 (57)摘要 本发明属于环境微生物技术领域， 具体涉及 一株兼具异养硝化和好氧反硝化能力的高效脱 氮菌株。 本发明所述菌株名为： 拉乌尔菌属菌株 Raoultellasp.sari01， 其保藏号为： CGMCC NO.12188。 所述拉乌尔菌属菌株Raoultella sp.sari01能够分别以氨氮、 亚硝酸盐、 硝酸盐 为唯一氮源生长； 对污水中的氨氮和COD的去除 率均达到98%以上； 总氮去除率达到92%以上。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3。
3、页 附图3页 CN 105733998 A 2016.07.06 CN 105733998 A 1.一种拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其保藏号为： CGMCCNO.12188。 2.根据权利要求1所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其特征在于， 所述拉 乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01的菌体大小为1.52.5 m。 3.根据权利要求1所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其特征在于， 所述拉 乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01含有如SEQIDNO.3所示的基因序列。 4.根据权利要求1。
4、所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其特征在于， 所述拉 乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01兼具异养硝化-好氧反硝化能力。 5.根据权利要求1所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其特征在于， 所述拉 乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01能够分别以氨氮、 亚硝酸盐、 硝酸盐为唯一氮源生长。 6.根据权利要求1所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其特征在于， 所述拉 乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01对污水中的氨氮和COD的去除率均达到98以上； 总 氮去除率达到92以上。 。
5、7.如权利要求16任一所述的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01在污水治理领 域中的用途。 8.根据权利要求7所述的用途， 其特征在于， 所述用途为： 采用拉乌尔菌属菌株 Raoultellasp.sari01对污水进行生物脱氮。 9.根据权利要求7所述的用途， 其特征在于， 所述用途为： 采用拉乌尔菌属菌株 Raoultellasp.sari01去除污水中的氨氮、 总氮及COD。 10.一种治理污水的方法， 包括如下步骤： (1)将如权利要求16任一所述的拉乌尔菌 属菌株Raoultellasp.sari01， 接种于液体培养基， 培养， 收集菌液； (2)将步骤(1)所得菌。
6、 液投加至污水中， 曝气培养。 11.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述液体培养基为NSM液体 培养基。 12.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述菌液为处于对数生长期 的菌液。 13.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述污水引入至SBR反应器 中。 14.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 室温曝气培养至少8h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105733998 A 2 一株兼具异养硝化和好氧反硝化能力的高效脱氮菌株 技术领域 0001 本发明属于环境微生物技术领域， 具体涉及一。
7、株兼具异养硝化和好氧反硝化能力 的高效脱氮菌株。 背景技术 0002 随着工农业的迅速发展， 人类的生产活动给环境带来的污染越来越严重。 其中， 氮 素是污水中的一类重要的污染因子， 可引起水体富营养化， 危及水生生物和人类健康。 据报 道， 2011年全国地表水污染严重， 氨氮是长江、 黄河、 珠江以及辽河水系的主要污染指标之 一， 主要湖泊富营养化问题突出， 导致水体溶氧降低， 藻类大量繁殖， 水体发黑， 影响鱼类的 正常生长繁殖。 水体中氮素主要以有机氮(如蛋白质， 氨基酸等)和无机氮(氨氮， 硝态氮和 亚硝态氮)两种形式存在。 其中， 有机氮一部分被水生生物同化吸收， 一部分被氨化菌转。
8、化 为氨氮， 然后经硝化菌的硝化作用和反硝化菌的反硝化作用最终转化为氮气释放到空气 中， 完成自然界的氮素循环。 0003 生物脱氮技术是目前应用广泛且经济效益较高的脱氮方法。 传统的生物脱氮由好 氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化作用共同完成， 而异养硝化和好氧反硝化的发现打破了 传统的生物脱氮理论， 不仅可以使硝化和反硝化在同一反应器中完成， 加快反应过程， 减小 反应器容积， 缩短水力停留时间， 降低运行成本， 还可以提高系统抗冲击能力， 处理高浓度 的氨氮废水。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 提供一种兼具异养硝化-好氧反硝化能 力的高效脱氮菌株拉乌尔菌属菌株Ra。
9、oultellasp.sari01及其应用。 0005 为实现上述目的及其相关目的， 本发明采用如下技术方案： 0006 本发明的第一方面， 提供了一种拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 其保藏 号为： CGMCCNO.12188。 0007 优选地， 所述拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01为革兰氏阴性菌， 菌体大小 为1.52.5 m。 0008 优选地， 所述拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01含有如SEQIDNO.3所示的 基因序列。 0009 优选地， 所述拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01兼具异养硝化-好氧反硝化。
10、 能力。 0010 优选地， 所述拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01能够分别以氨氮、 亚硝酸盐、 硝酸盐为唯一氮源生长。 0011 本发明从取自某工厂污水处理池的活性污泥中分离筛选到一种拉乌尔菌属菌株 Raoultellasp.sari01， 该菌株已于2016年03月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC)保藏， 保藏号为CGMCCNO.12188。 说明书 1/5 页 3 CN 105733998 A 3 0012 经形态学鉴定和16SrRNA分子鉴定， 确定该菌株为拉乌尔菌属菌株， 命名为拉乌 尔菌属菌株Raoultellasp.sari01(。
11、按照国际命名规则： 属名+种名+株名对该菌株进行命 名， 属名、 种名、 株名分别为拉乌尔菌属、 Raoultellasp.和sari01， 因此该菌株命名为拉乌 尔菌属菌株Raoultellasp.sari01。 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)， 保藏号为CGMCCNO.12188。 0013 优选地， 所述拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01对污水中的氨氮和COD的去 除率均达到98以上； 总氮去除率达到92以上。 0014 本发明的第二方面， 提供了拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01在污水治理领 域中的用途。 00。
12、15 优选地， 所述用途为： 采用拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01对污水进行生 物脱氮。 0016 优选地， 所述用途为： 采用拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01去除污水中的 氨氮、 总氮及COD。 0017 本发明第三方面公开了一种治理污水的方法， 包括如下步骤： 0018 (1)将拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 接种于液体培养基， 培养， 收集菌 液； 0019 (2)将步骤(1)所得菌液投加至污水中， 曝气培养。 0020 优选地， 步骤(1)中， 所述液体培养基为NSM液体培养基。 0021 优选地， 步骤(1)中， 所述菌。
13、液为处于对数生长期的菌液。 0022 优选地， 步骤(2)中， 所述污水引入至SBR反应器中。 0023 优选地， 步骤(2)中， 室温曝气培养至少8h。 0024 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0025 本发明的拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01， 能分别利用氨氮、 亚硝酸盐、 硝 酸盐为唯一氮源生长， 且在以氨氮为唯一氮源的情况下， 总氮去除率达到99.9， 硝态氮和 亚硝态氮极少积累； 在以亚硝酸盐为唯一氮源的情况下， 总氮去除率达到98， 少量氨氮积 累， 无硝酸盐累积； 在以硝酸盐为唯一氮源的情况下， 总氮去除率达到60， 亚硝态氮累积 量仅1mg/L。
14、左右。 0026 本发明菌株保藏信息如下： 0027 菌株名称： 拉乌尔菌属菌株Raoultellasp.sari01； 0028 保藏号为： CGMCCNO.12188； 0029 保藏日期： 2016年03月07日； 0030 保藏单位名称： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 0031 保藏单位简称： CGMCC； 0032 保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 附图说明 0033 图1： 菌株f5的脱氮性能测试。 0034 图2： 菌株sari01f5在以亚硝酸盐和唯一氮源时， 其脱氮率达到98。 0035 图3： 菌株sari01f5在以硝酸盐为唯一氮源时， 其。
15、脱氮达到60。 说明书 2/5 页 4 CN 105733998 A 4 0036 图4： 菌株sari01f5系统发育树。 0037 图5： 兼具高效异养硝化-好氧反硝化菌株拉乌尔菌属Raoultellasp.sari01在 SBR反应器脱氮效果。 具体实施方式 0038 在进一步描述本发明具体实施方式之前， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。 下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件， 或者按照各制造商所建议的条件。 0039 当实施例给出数值。
16、范围时， 应理解， 除非本发明另有说明， 每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。 除非另外定义， 本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载， 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来实 现本发明。 0040 除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组DNA技术。
17、及 相关领域的常规技术。 这些技术在现有文献中已有完善说明， 具体可参见Sambrook等 MOLECULARCLONING： ALABORATORYMANUAL， Secondedition， ColdSpringHarbor LaboratoryPress， 1989andThirdedition， 2001； Ausubel等， CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY， JohnWiley&Sons， NewYork， 1987andperiodicupdates； the seriesMETHODSINENZYMOLOGY， AcademicPress，。
18、 SanDiego； Wolffe， CHROMATIN STRUCTUREANDFUNCTION， Thirdedition， AcademicPress， SanDiego， 1998； METHODSIN ENZYMOLOGY， Vol.304， Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe， eds.)， Academic Press， SanDiego， 1999； 和METHODSINMOLECULARBIOLOGY， Vol.119， Chromatin Protocols(P.B.Becker， ed.)HumanaPress， Totowa， 19。
19、99等。 0041 实施例1异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选及性能测定 0042 活性污泥取自某工厂污水处理池， 从该活性污泥中取5mL泥水混合液至45mL灭菌 的NSM富集培养基中。 NSM培养基的配方为： (NH4)2SO40.945g/L， 柠檬酸钠16.34g/L， MgSO47H2O1g/L， NaCl0.12g/L， MnSO4H2O0.01g/L， FeSO47H2O0.02g/L， KH2PO4 0.25g/L， Na2HPO40.3g/L， pH7.07.5。 然后置于30， 200rpm的气浴摇床富集培养12h。 将 富集液进行梯度稀释后， 均匀涂布于NSM分离培养基(琼脂2。
20、0g/L， 其余成分同NSM)。 在30 恒温培养箱中培养1d后， 挑取形态大小不同的单克隆， 划线纯化后编号保藏， 经初筛共得到 10个菌株。 0043 将以上初筛的10个菌株接种到溴百里酚蓝(BTB)分离培养基。 BTB培养基的配方 为： KNO31g/L， 琥珀酸钠8.5g/L， MgSO47H2O1g/L， CaCl20.15g/L， FeSO47H2O0.05g/L， KH2PO40.25g/L， Na2HPO40.3g/L， 1BTB1mL， 琼脂20g/L， pH7.07.5。 1gBTB溶于100ml 无水乙醇即得1BTB乙醇溶液。 在30恒温培养箱中培养1d后， 挑取周围培养。
21、基出现蓝色 晕圈的菌株至BTB培养基， 划线纯化并编号保藏。 说明书 3/5 页 5 CN 105733998 A 5 0044 从平板挑取菌落至NSM液体培养基， 30气浴摇床200rpm培养12h， 取4(体积比) 菌液离心洗涤， 接种至NM液体培养基。 NM培养基的配方为： (NH4)2SO40.945g/L， 柠檬酸钠 16.34g/L， MgSO47H2O1g/L， KH2PO40.25g/L， Na2HPO40.3g/L。 30， 200rpm摇瓶培养， 定 期取样测定氨氮(NH3-N)、 硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度， 通过分析总氮(TN)的 去除率来判断菌。
22、株的异养硝化性能。 由图1可以看出， 菌株f5具备很好的脱氮性能， 30h时对 总氮去除率达到99， 并且作为中间产物的硝态氮和亚硝态氮极少积累， 累积量在0.02mg/ L左右。 0045 挑取硝化性能好的菌落至NSM液体培养基， 30气浴摇床200rpm培养12h， 取4 (体积比)菌液离心洗涤， 接种至DM-A(B)液体培养基。 DM-A(B)培养基配方为： KNO30.722g/ L(NaNO20.5g/L)， 柠檬酸钠6.128g/L， MgSO47H2O1g/L， KH2PO40.25g/L， Na2HPO40.3g/L。 30， 200rpm摇瓶培养， 定期取样测定氨氮(NH3-。
23、N)、 硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓 度， 通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的好氧反硝化性能。 由图2、 图3可以看出， 菌株 sari01f5具有良好的脱氮性能， 在以亚硝酸盐和硝酸盐为唯一氮源时， 其脱氮率分别达到 98和60。 0046 实施例2菌株的分子生物学鉴定 0047 采用试剂盒提取sari01的基因组DNA， 并以此为模板扩增16SrDNA， 0048 引物： 16SrDNA-8F： AGAGTTTGATCCTGGCTCA(SEQIDNO.1)； 0049 1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQIDNO.2)。 0050 PCR反。
24、应体系(50uL)： 模板DNA1uL， PCRTaqmix25uL， 上下游引物各1.5uL， DMSO2uL， 加ddH2O至反应体系为50uL。 PCR程序： 945min， 9430s， 5530s， 721min30s， 循环30次， 7210min， 45min。 PCR产物的纯化和测序由美吉生物医药科技有限公司完成， 测序序列登录GenBank进行同源性序列比对分析， 应用MEGA5.0软件构建该菌株系统发育 树(结果如图4所示)。 0051 菌株sari01的基因有效序列长度为1440bp， 如SEQIDNO.3所示。 0052 具体为： 0053 GGCCCTATCAAAGT。
25、GGTAGCGCCCTCCGAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGG CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAG TCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGT ATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGT TT。
26、ATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGAC TTAACCCAACATTTCACAACACGAG 0054 CTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCA AGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCAT TTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGT。
27、CGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGA ACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCAC CTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACA CCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCAAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTT 说明书 4/5 页 6 CN 105733998 。
28、A 6 CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCACTAAGGTTATTAACCTTAATGCC TTCCTCCTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCC ATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTG。
29、TGGCTGGTCATCCTC TCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATG GCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCC CTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGC TCGACTGCATTGTAGCCCGCGCCATTGCC。 0055 经过比对， 该序列与NCBI。
30、数据库的Raoultellasp .XT-8(NCBI登录号为： KR063539.1)同源性达99， 属于拉乌尔菌属(Raoultellasp.)。 所述菌株兼具高效异养 硝化-好氧反硝化功能。 为革兰氏阴性菌， 菌体大小为1.52.5 m。 0056 本申请将菌株sari01f5命名为拉乌尔菌属Raoultellasp.sari01， 该菌株已于 2016年03月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏， 保藏号 为CGMCCNO.12188。 0057 实施例3兼具高效异养硝化-好氧反硝化菌株拉乌尔菌属Raoultellasp.sari01 在SBR反应器脱氮。
31、效果 0058 取小区生活污水， pH为7， 氨氮30mg/L， 总氮42mg/L， COD297mg/L。 将生活污水引入 SBR反应器， 其中反应器水力停留时间为12h， 曝气时间8h， 溶解氧浓度维持在2mg/L左右。 0059 从固体培养基取菌体拉乌尔菌属Raoultellasp.sari01接种于NSM液体培养基， 30气浴摇床200rpm培养12h。 按照10体积比将处于对数生长期菌液离心洗涤后投加至 SBR反应器， 室温下(约25)曝气培养8h， 每隔2h测定水样中氨氮(NH4-N)， 总氮(TN)及化学 需氧量(COD)。 如图4所示为拉乌尔菌属Raoultellasp.sar。
32、i018h内对生活污水的氨氮、 总 氮及COD的去除情况， 最终出水氨氮和COD的去除率均达到98以上， 总氮去除率达到92， 取得了较好的脱氮及COD去除效果。 0060 以上所述， 仅为本发明的较佳实施例， 并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还将可以做出 若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、 修饰与演变的等同变化， 均为本发明的等效实施例； 同时， 凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、 修饰与演变， 均仍属于本发明的技术方案的范围 内。 说明书 5/5 页 7 CN 105733998 A 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 105733998 A 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 105733998 A 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 105733998 A 10 图1 图2 说明书附图 1/3 页 11 CN 105733998 A 11 图3 图4 说明书附图 2/3 页 12 CN 105733998 A 12 图5 说明书附图 3/3 页 13 CN 105733998 A 13 。