技术领域
本发明涉及多肽制备技术领域，尤其涉及一种从鳄鱼骨骼中提 取的鳄鱼小分子肽及其提取方法。
背景技术
氨基酸的分子小，蛋白质大，两个或以上的氨基酸脱水缩合形 成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白 质分子。二胜肽，简称二肽，就是由二个氨基酸组成的蛋白质片断。 生物体内已发现几百种肽，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少 的参与者。所有细胞都能合成多肽物质，其功能活动也受多肽的调节。 它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内 各个系统器官和细胞。酶法多肽的生理和药理作用主要是激活体内有 关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或翻译而 影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。 肽优于氨基酸，一是较氨基酸吸收快速；二是以完整的形式被机体吸 收；三是主动吸收(氨基酸属被动吸收)；四是低耗，与氨基酸比较， 肽吸收具有低耗或不需消耗能量的特点，肽通过十二指肠吸收后，直 接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位；五是肽吸收 较氨基酸，具有不饱和的特点；六是氨基酸只有20种，功能可数， 而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种。
在诸多的多肽中，由于小分子活性肽具有易吸收，不增加人体 消化负担，营养价值极其高而广泛被当代人们所意识和接受，逐渐成 为当下人们养生品而受到热捧。那么在现有技术中制备小分子肽的方 法有多种，例如CN101194733A，CN101532044A，CN102090680A， 以及CN1280834A均公开了关于多肽的制备方法，但是方法单一，提 取性能不高，再例如，CN101120724A公开了一种微生物发酵制作饲 料用多肽制剂，由以下重量百分比原料组成：枯草芽孢杆菌40-55、 植物乳杆菌25-35、干酪乳杆菌10-35。但制备的多肽制剂在用于骨骼 提取多肽时，提取效率不高，生物发酵剂单一，使用场合也受到限制。 CN102488073A公开一种海参肽的提取方法，采用酶解方法，加入海 参专用酶，酶解6小时，酶解过程中每隔1小时搅拌2分钟；加入活 性炭进行去味，然后加氢氧化钠调节pH，浓缩过程中测定控制波美 度在10，该方法不能提取较多成分的多肽，且波美度较低，造成一定 程度的资源浪费。CN1931020A公开了一种低含盐量的多肽生产方法， 其工艺流程包括：牛羊鲜骨的清洗破碎，高压蒸煮，加蛋白酶酶解， 加酸、碱调节pH值，过滤浓缩，喷粉干燥，成品包装，原料来源广 泛，成品的多肽成分可达90％，提高了水解度，可用于配制多种保健 食品，适用于酶法提取牛、羊动物骨骼中多肽的方法，但是对于贵重 的骨骼原料不能尽可能的提高多肽成分，造成不必要的浪费。
综上，现有技术的的多肽提取方法单一，提取效率不高，造成 浪费，适用场合受到限制，制备的多肽尤其是小分子活性肽难以用于 肽类药物和肽类保健品，对满足日益增长的保健品和药品市场不具有 重要意义。
发明内容
本发明为有效解决上述问题，本发明提供一种小分子活性多肽 尤其是从鳄鱼中提取小分子多肽的方法，该方法能够综合优势，极大 的提高小分子活性多肽的提取效率，且该方法能够适用于多种骨骼多 肽的提取。
本发明的技术方案是一种从鳄鱼骨骼中提取鳄鱼小分子肽的方 法，依次包括如下步骤：(1)制备发酵剂；(2)鳄鱼骨骼前处理； (3)初级微生物发酵；(4)电解初级鳄鱼蛋白；(5)酒精激活胰 浆制备；(6)酶解过程；(7)后处理过程。
进一步的步骤(1)制备发酵剂过程中，使用有益菌株的液体培 养制备发酵剂，包括枯草芽孢杆菌、双歧螺杆菌、鼠李糖乳杆菌、光 合菌、地衣芽孢杆菌，还加入营养素，所述的营养素为麦芽汁；
进一步的步骤(2)鳄鱼骨骼前处理中，采用高压蒸煮的方法得 到骨汤；步骤(3)初级微生物发酵中，加入促产剂，所述的促产剂 为植酸质，发酵得到初级微生物发酵的鳄鱼蛋白，即初级鳄鱼蛋白；
进一步的步骤(4)电解初级鳄鱼蛋白中，将所述的初级鳄鱼蛋 白进行电解，得到鳄鱼寡肽骨汤；步骤(5)酒精激活胰浆制备中： 胰脏做蛋白酶来源，采用食用酒精一步激活形成胰酶，形成酒精激活 胰浆；
进一步的步骤(6)酶解过程中：鳄鱼寡肽骨汤、酒精激活胰浆 按照一定质量比进行酶解，分三次加入所述酒精激活胰浆，得到初级 鳄鱼小分子肽；步骤(7)后处理过程中：经过后处理得到鳄鱼小分 子肽。
本发明提供的一种小分子活性多肽尤其是从鳄鱼中提取小分子 多肽的方法，更具体的步骤如下：(1)制备发酵剂：使用有益菌株 的液体培养制备发酵剂，称取枯草芽孢杆菌10重量份，双歧螺杆菌 10重量份，鼠李糖乳杆菌40重量份，麦芽汁15重量份，光合菌20 重量份，地衣芽孢杆菌5重量份混合在一起，并置入到盛装有培养基 的三角瓶中，进行复合培养，所述的培养基为营养琼脂培养基，在所 述三角瓶中进行培养的温度为37℃，在200-250rpm/min下培养 18-20h，使菌体或者孢子浓度达到5×1013个/升(CFU/L)，制得发酵 剂；(2)鳄鱼骨骼前处理：将新鲜的鳄鱼骨骼破碎，清洗，在蒸煮 罐中，采用温度为130℃以上温度，压力0.17-0.18MPa高压蒸煮 300-400min，骨渣排出，汤油导入汤油储罐中分层分离，得到骨汤； (3)初级微生物发酵：将步骤(2)得到的骨汤转入至初级发酵生产 罐中，并加入所述骨汤重量的0.5-0.8％的促产剂，所述的促产剂为植 酸质，在35-38℃的低温下发酵8-10h，然后升温至160-200℃继续发 酵5-8h，得到初级微生物发酵的鳄鱼蛋白，即初级鳄鱼蛋白；(4) 电解初级鳄鱼蛋白，将所述的初级鳄鱼蛋白进行电解，使用常规的蛋 白质电解法，电解过程中，槽电压为20-50mV，电解时间为3-5h，取 三个试样测试，每个试样中的鳄鱼肽的分子量范围均不超过800道尔 顿时，则停止电解，得到鳄鱼寡肽骨汤；(5)酒精激活胰浆制备： 酒精激活胰浆制备过程如下：在胰酶激活器中，放入洗净的胰脏做蛋 白酶来源，采用食用酒精一步激活形成胰酶，所述食用酒精的加入量 是所述胰酶质量的2倍，所述食用酒精的体积浓度是45％，所述激活 时间为60-80h，激活温度为6-8℃，成为酒精激活胰浆；(6)酶解过 程：将所述鳄鱼寡肽骨汤导入水解罐中，然后分三次加入所述酒精激 活胰浆，三次加入的所述酒精激活胰浆的质量之比为1∶1∶4，第一次 是在所述酶解开始时加入，第二次是在所述酶解进行1h时加入，第 三次加入是所述酶解进行2h时加入，所述酶解总时间为7h，所述酒 精激活胰浆的加入质量是鳄鱼寡肽骨汤质量的1/9-1/5，在所述酶解过 程中保持水解罐中pH为6.7-7.0；在所述酶解过程中第一次加入酒精 激活胰浆后至第二次加入酒精激活胰浆前的酶解温度为60℃，第二次 加入酒精激活胰浆后的酶解温度为45℃，得到初级鳄鱼小分子肽；(7) 后处理过程：经过所述酶解过程，即经过所述酒精激活胰浆在水解罐 中的水解，成为水解最终的混合液体，经过过滤后导入浓缩罐进行浓 缩，浓缩温度为50℃，浓缩至少2h，之后降温，在降温至30℃时， 测定波美度不小于30时，停止浓缩，将浓缩液煮沸灭菌，喷粉干燥， 水分含量降至2.5％以下，送入储罐，密封包装，得到鳄鱼小分子肽。
优选，步骤(1)制备发酵剂过程中，在所述三角瓶中进行培养 的温度为37℃，在200rpm/min下培养20h；步骤(2)鳄鱼骨骼前处 理：在蒸煮罐中，采用温度为150℃，压力0.17MPa高压蒸煮400min。
优选，步骤(3)初级微生物发酵中，加入所述骨汤重量的0.8％ 的植酸质，在38℃的低温下发酵8h，然后升温至165℃继续发酵7h， 得到初级鳄鱼蛋白；步骤(4)电解初级鳄鱼蛋白中，槽电压为30mV， 电解时间为4h。
优选，步骤(5)酒精激活胰浆制备中：所述激活时间为60h， 激活温度为6℃，成为酒精激活胰浆；步骤(6)酶解过程中：所述酒 精激活胰浆的加入质量是鳄鱼寡肽骨汤质量的1/7，在所述酶解过程 中保持水解罐中pH为6.8；步骤(7)后处理过程中：浓缩3h，降温， 在降温至30℃时，测定波美度35时停止浓缩。
优选，鳄鱼成品多肽含量接近100％，所述的鳄鱼小分子肽的分 子量为0-480道尔顿的占比不少于88％。
优选，所述的鳄鱼小分子肽的分子量为0-480道尔顿的占比为 89.62％，480-1000道尔顿的占比为7.38％，大于1000道尔顿的占比 为3％；色泽为淡黄色。
本发明还提供了上述鳄鱼小分子肽的应用，所述鳄鱼小分子肽 适用于肽类药物和肽类保健品。
优选，所述鳄鱼小分子肽适用于诊断用肽、肽疫苗、抗菌活性 肽、细胞因子模拟肽、抗病毒肽和/或抗肿瘤肽。
本发明具有以下有益的效果：
本发明的目的在于提鳄鱼小分子活性多肽的提取方法是一种综 合方法，使用范围广泛，不仅可以用于鳄鱼骨骼中提取多肽，还可以 用于其它动物骨骼中提取小分子活性多肽。
本发明制备的鳄鱼小分子活性多肽成分比较纯，远远优于现有 技术中制备的多肽，本发明制备的鳄鱼小分子活性多肽含量接近 100％，所述的鳄鱼小分子肽的分子量为0-480道尔顿的占比不少于 87.5％，具体所述的鳄鱼小分子肽的分子量为0-480道尔顿的占比为 88.54％，480-1000道尔顿的占比为9.58％，大于1000道尔顿的占比 为1.88％，色泽为淡黄色。
本发明制备的鳄鱼小分子肽，可以应用于肽类药物和肽类保健 品，应用范围比较广泛，例如用于诊断用肽、肽疫苗、抗菌活性肽、 细胞因子模拟肽、抗病毒肽和/或抗肿瘤肽等。
本发明制备的鳄鱼小分子肽满足了日益增长的药品和保健品的 使用需要，可以安全大规模制备使用。
具体实施方式
实施例1
鳄鱼小分子肽的制备方法，依次包括如下步骤：(1)制备发酵 剂：使用有益菌株的液体培养制备发酵剂，称取枯草芽孢杆菌10重 量份，双歧螺杆菌10重量份，鼠李糖乳杆菌40重量份，麦芽汁15 重量份，光合菌20重量份，地衣芽孢杆菌5重量份混合在一起，并 置入到盛装有培养基的三角瓶中，进行复合培养，所述的培养基为营 养琼脂培养基，在所述三角瓶中进行培养的温度为37℃，在 200rpm/min下培养20h，使菌体或者孢子浓度达到5×1013个/升 (CFU/L)，制得发酵剂；(2)鳄鱼骨骼前处理：将新鲜的鳄鱼骨 骼破碎，清洗，在蒸煮罐中，采用温度为150℃的温度，压力0.17MPa 高压蒸煮400min，骨渣排出，汤油导入汤油储罐中分层分离，得到 骨汤；(3)初级微生物发酵：将步骤(2)得到的骨汤转入至初级发 酵生产罐中，并加入所述骨汤重量的0.8％的促产剂，所述的促产剂 为植酸质，在38℃的低温下发酵10h，然后升温至200℃继续发酵8h， 得到初级微生物发酵的鳄鱼蛋白，即初级鳄鱼蛋白；(4)电解初级 鳄鱼蛋白，将所述的初级鳄鱼蛋白进行电解，使用常规的蛋白质电解 法，电解过程中，槽电压为50mV，电解时间为5h，取三个试样测试， 每个试样中的鳄鱼肽的分子量范围均不超过800道尔顿时，则停止电 解，得到鳄鱼寡肽骨汤；(5)酒精激活胰浆制备：酒精激活胰浆制 备过程如下：在胰酶激活器中，放入洗净的胰脏做蛋白酶来源，采用 食用酒精一步激活形成胰酶，所述食用酒精的加入量是所述胰酶质量 的2倍，所述食用酒精的体积浓度是45％，所述激活时间为80h，激 活温度为8℃，成为酒精激活胰浆；(6)酶解过程：将所述鳄鱼寡肽 骨汤导入水解罐中，然后分三次加入所述酒精激活胰浆，三次加入的 所述酒精激活胰浆的质量之比为1∶1∶4，第一次是在所述酶解开始时 加入，第二次是在所述酶解进行1h时加入，第三次加入是所述酶解 进行2h时加入，所述酶解总时间为7h，所述酒精激活胰浆的加入质 量是鳄鱼寡肽骨汤质量的1/5，在所述酶解过程中保持水解罐中pH为 6.7；在所述酶解过程中第一次加入酒精激活胰浆后至第二次加入酒精 激活胰浆前的酶解温度为60℃，第二次加入酒精激活胰浆后的酶解温 度为45℃，得到初级鳄鱼小分子肽；(7)后处理过程：经过所述酶 解过程，即经过所述酒精激活胰浆在水解罐中的水解，成为水解最终 的混合液体，经过过滤后导入浓缩罐进行浓缩，浓缩温度为50℃，浓 缩3h，之后降温，在降温至30℃时，测定波美度40时，停止浓缩， 将浓缩液煮沸灭菌，喷粉干燥，水分含量降至1.5％，送入储罐，密 封包装，得到鳄鱼小分子肽。
上述实施例1制备得到的鳄鱼小分子肽的成分纯，远远优于现 有技术中制备的多肽，含量接近100％，鳄鱼小分子肽的分子量为 0-480道尔顿的占比为88.54％，480-1000道尔顿的占比为9.58％，大 于1000道尔顿的占比为1.88％，色泽为淡黄色，可以应用于肽类药 品和/或保健品。
实施例2
鳄鱼小分子肽的制备方法，依次包括如下步骤：(1)制备发酵 剂：使用有益菌株的液体培养制备发酵剂，称取枯草芽孢杆菌10重 量份，双歧螺杆菌10重量份，鼠李糖乳杆菌40重量份，麦芽汁15 重量份，光合菌20重量份，地衣芽孢杆菌5重量份混合在一起，并 置入到盛装有培养基的三角瓶中，进行复合培养，所述的培养基为营 养琼脂培养基，在所述三角瓶中进行培养的温度为37℃，在 220rpm/min下培养19h，使菌体或者孢子浓度达到5×1013个/升 (CFU/L)，制得发酵剂；(2)鳄鱼骨骼前处理：将新鲜的鳄鱼骨 骼破碎，清洗，在蒸煮罐中，采用温度为140℃的温度，压力0.17MPa 高压蒸煮350min，骨渣排出，汤油导入汤油储罐中分层分离，得到 骨汤；(3)初级微生物发酵：将步骤(2)得到的骨汤转入至初级发 酵生产罐中，并加入所述骨汤重量的0.6％的促产剂，所述的促产剂 为植酸质，在37℃的低温下发酵9h，然后升温至190℃继续发酵7h， 得到初级微生物发酵的鳄鱼蛋白，即初级鳄鱼蛋白。(4)电解初级 鳄鱼蛋白，将所述的初级鳄鱼蛋白进行电解，使用常规的蛋白质电解 法，电解过程中，槽电压为40mV，电解时间为4h，取三个试样测试， 每个试样中的鳄鱼肽的分子量范围均不超过800道尔顿时，则停止电 解，得到鳄鱼寡肽骨汤。(5)酒精激活胰浆制备：酒精激活胰浆制 备过程如下：在胰酶激活器中，放入洗净的胰脏做蛋白酶来源，采用 食用酒精一步激活形成胰酶，所述食用酒精的加入量是所述胰酶质量 的2倍，所述食用酒精的体积浓度是45％，所述激活时间为70h，激 活温度为6℃，成为酒精激活胰浆。(6)酶解过程：将所述鳄鱼寡肽 骨汤导入水解罐中，然后分三次加入所述酒精激活胰浆，三次加入的 所述酒精激活胰浆的质量之比为1∶1∶4，第一次是在所述酶解开始时 加入，第二次是在所述酶解进行1h时加入，第三次加入是所述酶解 进行2h时加入，所述酶解总时间为7h，所述酒精激活胰浆的加入质 量是鳄鱼寡肽骨汤质量的1/5，在所述酶解过程中保持水解罐中pH为 7.0；在所述酶解过程中第一次加入酒精激活胰浆后至第二次加入酒精 激活胰浆前的酶解温度为60℃，第二次加入酒精激活胰浆后的酶解温 度为45℃，得到初级鳄鱼小分子肽。(7)后处理过程：经过所述酶 解过程，即经过所述酒精激活胰浆在水解罐中的水解，成为水解最终 的混合液体，经过过滤后导入浓缩罐进行浓缩，浓缩温度为50℃，浓 缩至少2h，之后降温，在降温至30℃时，测定波美度35时，停止浓 缩，将浓缩液煮沸灭菌，喷粉干燥，水分含量降至2.3％，送入储罐， 密封包装，得到鳄鱼小分子肽。
上述实施例2制备得到的鳄鱼小分子肽的成分纯，远远优于现 有技术中制备的多肽，含量接近100％，鳄鱼小分子肽的分子量为 0-480道尔顿的占比为87.9％，480-1000道尔顿的占比为10.24％，大 于1000道尔顿的占比为1.86％，色泽为淡黄色，可以应用于肽类药 品和/或保健品。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让 熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此 限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修 饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。