一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711379899.2 (22)申请日 2017.12.20 (71)申请人 河南农业大学 地址 450000 河南省郑州市金水区文化路 95号 (72)发明人 丁胜利文才艺李震郭康迪 赵玉华赵莹 (74)专利代理机构 北京力量专利代理事务所 (特殊普通合伙) 11504 代理人 宋林清 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12。

2、R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过 PCR试剂盒检测的方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR 引物及通过PCR试剂盒检测的方法， 通过URP通用 引物扩增尖孢镰孢菌不同专化型， 获得URP-32F 引物苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特 异性扩增条带， 通过参考比对尖孢镰孢菌公开的 基因组序列， 设计了可用于检测苦瓜枯萎病菌尖 孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物及其PCR检测 试剂盒； 该试剂盒对苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦 瓜专化型的检测特异性好、 灵敏度高、 检测时间 短、 操作简便， 可以实现从土壤和植物样品中快 速准。

3、确地检测出苦瓜枯萎病菌， 而对于其它常见 的瓜类枯萎病菌的扩增结果均为阴性； 因此， 本 发明为苦瓜枯萎病的早期诊断和快速鉴定提供 了一种特异性、 有效的检测技术手段， 而且该方 法操作简单、 对设备的要求低。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 107916295 A 2018.04.17 CN 107916295 A 1.一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物， 其特征在于， 包括由上游引物和下游引物； 所述 的上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3， 所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所 示， 分别来自URP-32F(SEQ.ID.No.1)扩增的特异。

4、片段SEQ.ID.No.2和经优化的特异性扩增 片段SEQ.ID.No.5。 2.一种如权利要求1所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： 步骤一， 提取待检样品基因组DNA， 使用PCR试剂盒进行PCR扩增； 步骤二， 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌； 所述判断具 体为： 如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带， 则说明样品中含有苦瓜枯萎病菌； 如果没有出现相应的单一扩增条带， 则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。 3.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述PCR试剂盒含有引物。

5、FOMM-SPF和引物FOMM-SPR。 4.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述步骤一中所述的PCR试剂盒还含有PCR扩增缓冲液、 阳性对照以及阴性对照。 . 5.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片段的质粒DNA。 6.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述的阴性对照为无菌水。 7.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增所采用的检测体系为25 l， 反应体。

6、系包括： 2Green Taq Master Mix 12.5 l， 10 M的上下游引物各1 l， 模板溶液1 l， 最后用灭菌的去离子水补足至25 l。 8.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述步骤一中所述的PCR扩增所采用的扩增程序为： 95预变性3min， 之后开始扩增循环， 每个循环的程序为： 94变性15s， 57退火30s， 72延伸20s,循环共30个； 循环结束后72 延伸5min， 降温至16结束。 9.根据权利要求3所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SP。

7、R的摩尔比为1:1。 根据权利要求3所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 其特征在于， 所 述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的浓度均为10 M。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107916295 A 2 一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的 方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术检测领域， 具体是一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过 PCR试剂盒检测的方法。 背景技术 0002 由尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的蔬菜瓜类枯萎病是一种典型土 传病害， 也是一种毁灭性维管束病害； 近年来， 由于设施农业的广泛推广。

8、， 以及作物重茬面 积不断扩大， 瓜类枯萎病的发生和危害日益严重； 瓜类枯萎病发病率一般在1030， 严 重时高达80， 甚至绝产， 且一旦发病， 难以根除， 已成为影响蔬菜瓜类生产的严重障碍之 一。 0003 尖孢镰孢菌对不同属(种)寄主植物以及同种寄主植物不同品种的致病性存在明 显差异， 因此具有高度的寄主专化性； 目前， 我国已明确报道的尖孢镰孢菌瓜类专化型有6 个， 分别为黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、 西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、 甜瓜专化型(Fusarium oxysporum 。

9、f.sp.melonis)、 苦瓜专化型 (Fusarium oxysporum f .sp .momodicae)、 冬瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.benincasae)和葫芦专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lagenariae)； 研究表明， 瓜 类枯萎病菌各专化型并非严格的寄主专化性， 不同专化型菌株除强侵染相应的寄主植物 外， 也可侵染其它寄主植物， 如尖孢镰孢菌黄瓜专化型菌株除强侵染黄瓜外， 还可弱侵染甜 瓜和西瓜； 尖孢镰孢菌西瓜专化型菌株除强侵染西瓜外， 还可弱侵染黄瓜和甜瓜； 尖孢镰孢 菌苦瓜专化型菌株除强侵染苦瓜外， 还可。

10、弱侵染葫芦和丝瓜等等； 因此， 给瓜类枯萎病菌的 早期鉴定带了巨大的困难； 目前， 对瓜类枯萎病菌的鉴定除采用形态学和分子生物学方法 外， 还必须结合病原菌分离物对不同寄主植物的致病性测定结果； 对于由尖孢镰孢菌苦瓜 专化型侵染引起的苦瓜枯萎病而言， 早期诊断是指导该病害有效防控的关键； 但是， 目前关 于尖孢镰孢菌苦瓜专化型的早期分子检测几乎还是空白， 因此， 急需一种特异性、 灵敏、 快 速、 简便的苦瓜枯萎病菌检测技术； 现有的苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型鉴定方法， 由于目前并没有公认的鉴别寄主， 且接种试验结果受环境条件的影响较大， 因此， 采用现有 的鉴定方法获得的鉴定结果往往具。

11、有不确定性， 加之， 致病性测定的时间长(从接种到发病 并表现典型的症状一般为913天)， 费时费工， 不利于苦瓜枯萎病的早期诊断， 导致错失病 害防控的最佳时机， 给生产造成难以挽回的损失。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测 的方法， 以解决上述背景技术中提出的问题。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物， 包括由上游引物和下游引物； 所述的上游引物 说明书 1/9 页 3 CN 107916295 A 3 的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3， 所述的下游引物的核苷酸序。

12、列如SEQ.ID.No.4所示， 分别来 自URP-32F(SEQ.ID.No.1)扩增的特异片段SEQ.ID.No.2和经优化的特异性扩增片段 SEQ.ID.No.5。 0007 一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 包括以下步骤： 0008 步骤一， 提取待检样品基因组DNA， 使用PCR试剂盒进行PCR扩增； 0009 步骤二， 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌； 所述判 断具体为： 如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带， 则说明样品中含有苦瓜枯萎病 菌； 如果没有出现相应的单一扩增条带， 则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。 0010 作为本发明进一。

13、步的方案： 所述PCR试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR。 0011 作为本发明再进一步的方案： 所述步骤一中所述的PCR试剂盒还含有PCR扩增缓冲 液、 阳性对照以及阴性对照。 0012 作为本发明再进一步的方案： 所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片 段的质粒DNA。 0013 作为本发明再进一步的方案： 所述的阴性对照为无菌水。 0014 作为本发明再进一步的方案： 所述PCR扩增所采用的检测体系为25 l， 反应体系包 括： 2Green Taq Master Mix 12.5 l， 10 M的上下游引物各1 l， 模板溶液1 l， 最后用灭 菌的去离子水补足。

14、至25 l。 0015 作为本发明再进一步的方案： 所述步骤一中所述的PCR扩增所采用的扩增程序为： 95预变性3min， 之后开始扩增循环， 每个循环的程序为： 94变性15s， 57退火30s， 72 延伸20s， 循环共30个； 循环结束后72延伸5min， 降温至16结束。 0016 作为本发明再进一步的方案： 所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的摩尔比为1:1。 0017 作为本发明再进一步的方案： 所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的浓度均为10 M。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 本发明包括引物FOMM-SPF和引物FOMM- SPR，。

15、 它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列； 还制备了相应的PCR 试剂盒并建立了相应的检测方法， 该试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR、 PCR扩增试 剂、 尖孢镰孢菌苦瓜专化型阳性对照和阴性对照； 具有特异、 灵敏、 快速、 简便的特点， 弥补 了目前对尖孢镰孢菌苦瓜专化型早期检测的技术空缺， 可作为保护地栽培、 基础实验室等 场所开展快速检测的良好方法； 为生产上苦瓜枯萎病的预测预警、 早期诊断和有效防控提 供及时、 准确的信息和指导。 0019 说明书附图 0020 图1是本发明PCR检测方法退火温度实验检测结果图， 图中： 1-5。

16、3； 2-55； 3-57 ； 4-60； 5-62和6-65； M.DL 2000分子质量标准。 0021 图2是本发明PCR检测方法特异性实验结果图， 图中： M-2000bp DNA标准分子质量, 1-尖孢镰孢菌古巴专化型， 2-尖孢镰孢菌西瓜专化型， 3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型， 49-苦 瓜枯萎病菌分离物， 10-假禾谷镰孢菌， 11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌, 14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。 0022 图3是本发明特异性检测实验ITS检测各菌株的DNA质量， 图中样品与图2相对应： M-2000bp DNA标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型， 2-尖孢。

17、镰孢菌西瓜专化型， 3-尖孢 说明书 2/9 页 4 CN 107916295 A 4 镰孢菌甜瓜专化型， 49-苦瓜枯萎病菌分离物， 10-假禾谷镰孢菌， 11-燕麦镰孢菌,12-黄 色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。 0023 图4是本发明PCR检测方法灵敏性试验结果图， 图中： 1-50ng； 2-20ng； 3-10ng； 4- 5ng； 5-2ng； 6-1ng； 7-0ng； M,2000bp DNA ladder。 0024 图5是本发明PCR检测方法的土壤的检测结果图， 图中： 1-5101个分生孢子； 2-5 102个分生孢子； 3-5103个分。

18、生孢子； 4-5104个分生孢子； 5-5105个分生孢子； 6-阴 性对照-未加分生孢子的土壤； 7-阳性对照-基因组DNA； 8-无菌水； M-2000bp DNA标准分子 量。 0025 图6是本发明PCR检测方法检测接种苦瓜枯萎病菌后12天苦瓜植株带菌检测结果 图， 图中： 1、 2： 接种的苦瓜子叶； 3、 4、 6、 7： 接种的苦瓜根； 5、 8、 9： 接种的苦瓜叶柄， 10-未接 种苦瓜叶柄对照； 11-未接种苦瓜根对照； 12-阳性对照。 0026 图7是本发明PCR检测方法检测不同土壤中苦瓜枯萎病菌的检测结果图。 0027 图8是本发明PCR检测方法检测不同地区健康和罹病。

19、植物的检测结果图。 具体实施方式 0028 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 0029 实施例 0030 一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物， 包括上游引物和下游引物； 所述的上游引物的 核苷酸序列如SEQ.ID.No.3， 所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所示， 分别来自 URP-32F(SEQ .ID .No .1)扩增的特异片段SEQ .ID .No .2和经优化的特异性扩增片段 SEQ.ID.No.5。 0031 一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法， 包括以下步骤： 0032 步骤一， 提取待检样品基因组DNA， 使用PCR试剂盒进行P。

20、CR扩增； 0033 步骤二， 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌； 所述判 断具体为： 如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带， 则说明样品中含有苦瓜枯萎病 菌； 如果没有出现相应的单一扩增条带， 则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。 0034 所述PCR试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR。 0035 所述步骤一中所述的PCR试剂盒还含有PCR扩增缓冲液、 阳性对照以及阴性对照。 0036 所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片段的质粒DNA。 0037 所述的阴性对照为无菌水。 0038 所述PCR扩增所采用的检测体系为25 l， 反应体系包。

21、括： 2Green Taq Master Mix 12.5 l， 10 M的上下游引物各1 l， 模板溶液1 l， 最后用灭菌的去离子水补足至25 l。 0039 所述步骤一中所述的PCR扩增所采用的扩增程序为： 95预变性3min， 之后开始扩 增循环， 每个循环的程序为： 94变性15s， 57退火30s， 72延伸20s， 循环共30个； 循环结 束后72延伸5min， 降温至16结束。 0040 所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的摩尔比为1:1。 0041 所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的浓度均为10 M。 0042 引物设计 0043 根据URP-32F。

22、(Universal Rice Primer-32F)引物扩增尖孢镰孢菌古巴专化型、 西 说明书 3/9 页 5 CN 107916295 A 5 瓜专化型、 甜瓜专化型代表菌株和苦瓜枯萎病分离物的多态条带， 得到苦瓜专化型1014bp 差异条带， 经切胶回收该片段， ddH2O洗脱DNA,送上海生工测序， 得到特异片段的序列， 其全 长序列见SEQ.ID.No.2， 根据该特异性测序结果， 设计获得特异性引物FOMM-SPF和引物 FOMM-SPR， 见表1， 扩增294bp的条带见序列SEQ.ID.No.5。 0044 表1 引物序列 0045 0046 PCR反应体系与反应程序的建立 0。

23、047 1、 DNA模板制备 0048 液体YEPG摇培苦瓜枯萎病菌培养物5天， 过滤收集分生孢子， 血球计数板定量孢子 浓度， CTAB法快速震荡破碎分生孢子， 酚氯仿抽提DNA， 产物直接用于PCR反应或置于4保 存。 0049 2、 PCR扩增反应 0050 按PCR反应体系， 见表2； 配制反应混合物放入PCR仪， PCR反应程序： 预变性： 95 3min； 扩增30个循环(包括： 94 15s； 退火： 57 30s； 延伸： 72 20s)； 最后延伸： 72 5min。 反应结束后， 取PCR产物5 l点样于1琼脂糖凝胶加样孔电泳， 在溴化乙锭(0.5 g/ ml)溶液中染色，。

24、 漂洗后进行鉴定， 如电泳结果在294bp处出现扩增条带， 同时阴、 阳性成立， 即表明待检样品中有苦瓜枯萎病菌。 0051 表2 PCR反应组份 说明书 4/9 页 6 CN 107916295 A 6 0052 0053 PCR检测方法退火温度确定 0054 用提取好的样品DNA做模板， 设置不同的退火温度， 然后其它条件均设置相同进行 PCR， PCR完成后取产物6 l点样于1琼脂糖凝胶； 电泳后在含有0.5 g/ml溴化乙锭溶液染 色， 并在紫外分析仪下观察照相， 以确定其最佳退火温度。 结果显示， 退火温度从53,55 ,57,60,62至65， PCR产物结果均很特异， 见图1， 。

25、最终确定检测方法的退火温度 设定为57。 0055 特异性实验 0056 用前述已建立的PCR方法， 分别以尖孢镰孢菌苦瓜分离物DNA、 土壤中几种常见镰 孢菌DNA、 ddH2O为模板进行PCR检验， 按表2的体系配制反应液， 按照实例2的方法进行特异 性检测； 结果显示只有苦瓜枯萎菌能进行特异性扩增， 其它尖孢镰孢菌专化性和其它属的 镰孢菌不能扩增出目的条带， 见图2； 结果显示， 本发明检测方法具有很高的特异性； 为了测 定模板DNA质量， 利用都能扩增出条带的通用引物ITS1(SEQ ID No .6)和引物ITS4 (SEQ.ID.No.7)测定DNA模板， 结果显示PCR反应的各模。

26、板DNA质量良好， 见图3： M-2000bp DNA标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型， 2-尖孢镰孢菌西瓜专化型， 3-尖孢镰孢菌甜 瓜专化型， 49-苦瓜枯萎病菌分离物， 10-假禾谷镰孢菌， 11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌, 13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。 0057 灵敏度实验 0058 用核酸测定仪测定了模板DNA浓度并稀释后进行PCR测定， 30个循环后检测该方法 的灵敏性， 最终测定该方法的最低检测量为1-5ng， 见图4。 0059 试剂盒组装 0060 根据以上实施例子的研究结果， 组装检测试剂盒以方便使用。 0061 1、 引物FOMM-SP。

27、F和FOMM-SPR， 浓度均为10 M。 0062 3、 PCR扩增试剂： 普通2Green Taq Mix。 0063 4、 苦瓜枯萎病菌阳性对照和阴性对照。 0064 阳性对照： 将FOMM-SPF/FOMM-SPR特异性扩增片段克隆到pMD-18T载体， 并测序验 证为100同源， 最后制备目的片段重组质粒pMD-FOMM， 在含有氨苄青霉素的LB细菌培养液 说明书 5/9 页 7 CN 107916295 A 7 中培养， 收集菌液， 提取质粒DNA作为阳性对照； 阴性对照： 无菌水作为阴性对照。 0065 土壤中苦瓜枯萎病菌检测实验 0066 液体摇培苦瓜枯萎病菌株， 过滤收集分生。

28、孢子， 血球计数板定量孢子浓度， 调整到 5106孢子/ml， 在2ml灭菌的离心管中再系列稀释， 获得5105/ml、 5104/ml、 5103/ml、 5102/ml和5101/ml孢子悬浮液， 无菌水为对照； 取1ml转入新的螺口带橡皮垫圈且耐低 温的2ml灭菌的离心管， 12000g离心1min， 弃上清液， 加入500mg过筛的灭菌土和300 l研 磨沙； 按照Mag-Bind Soil DNA Kit M5635-01土壤提取DNA试剂盒说明书介绍的方法提取 土壤中苦瓜枯萎病菌分生孢子DNA； 具体步骤： 在上述离心管中加入0.8ml SLX Mlus缓冲 液， 在SCIENTZ。

29、-48高通量组织研磨器中， 以70Hz震荡研磨， 60s间歇一次， 共5次； 然后加80 l DS缓冲液， 涡旋震荡混匀， 70水浴10min， 13000g离心5min； 取600 l上清液， 转入新的 2ml离心管， 加入200 l SP2缓冲液， 涡旋震荡混匀， 加100 l试剂HTR， 涡旋震荡10s， 冰上放 置5min， 然后13000g离心5min； 转移450 l Binding缓冲液和40 l MagSi微磁珠， 离心管 置于磁力架上， 移去液体； 取回离心管， 加500 l Binding缓冲液， 涡旋悬浮微磁珠， 在磁力 架上移去液体； 加1000 l PHB缓冲液悬浮微。

30、磁珠， 同样方法移去液体； 加1000 lSPM清洗缓 冲液， 涡旋悬浮微磁珠， 同样方法移去液体， 重复该步骤一次； 把离心管倒扣在吸水纸上， 干 燥15min， 加100 l的DNA洗脱缓冲液， 涡旋震荡， 65水浴10min， 在磁力架上， 小心转移DNA 洗脱液至新的1.5ml离心管中， 作为模板用于PCR扩增检测； 取2 l上述DNA洗脱液做模板， 同 样PCR反应体系， 扩增DNA,上样检测5 l PCR产物， 结果500mg土壤中50个苦瓜枯萎病菌分生 孢子能够被检测出来； 图中1.5101个分生孢子； 2.5102个分生孢子； 3.5103个分生孢 子； 4.5104个分生孢子。

31、； 5.5105个分生孢子； 6.阴性对照： 为未加分生孢子的灭菌土壤； 7.阳性对照： 为苦瓜枯萎病菌基因组DNA； 8.无菌水； M.2000bp DNA标准分子量， 见图5。 0067 苦瓜植株带菌诊断 0068 在育苗钵中育苦瓜苗， 用上述5105/ml孢子悬浮液50ml灌根， 在苦瓜生长的不同 时期， 取子叶和叶片叶柄， 切成小段， 放入有灭菌钢珠的耐低温2ml旋口离心管中， 液氮速 冻， -80保存。 装有样品的离心管在液氮中预处理， 然后在上述震荡仪上， 70Hz震荡30s， 取 出离心管液氮处理后， 再震荡30s， 如此重复5次， 用来破碎苦瓜组织和真菌的细胞壁。 加700 l。

32、 65预热的CTAB提取液和700 l酚氯仿抽提缓冲液， 颠倒混匀， 65水浴1h， 期间间歇颠 倒混样； 12000g离心5min， 取600 l上清液至新的1.5ml离心管， 加等量的氯仿异戊醇抽提 液， 颠倒混匀5min， 12000g离心5min， 取500 l上清液至新的1.5ml离心管， 加1ml无水乙 醇， -20放置15min， 12000g离心5min， 弃上清， 加500 l 75冷乙醇， 涡旋， 7500g离心 5min， 弃乙醇， 干燥DNA， 加10 l灭菌ddH2O溶解DNA， 该DNA将用于PCR检测。 使用前述试剂盒， 按照本发明的PCR检测方法进行PCR扩增，。

33、 以苦瓜枯萎病菌基因组DNA为阳性对照， 取5 l PCR产物用于1.5琼脂糖凝胶电泳， EB染色照相。 结果显示， 图6中： 1， 2： 接种株的苦瓜子 叶； 3， 4， 6， 7： 接种株的苦瓜根； 5， 8， 9： 接种株的苦瓜叶柄， 10.未接种的苦瓜叶柄为对照； 11.未接种苦瓜根为对照； 12.阳性对照。 在2、 3、 8和9， 苦瓜子叶、 叶柄和根组织中可以扩增 到近300bp的特异性条带， 检测为尖孢镰孢菌苦瓜专化型。 0069 苦瓜保护地土壤中苦瓜枯萎病菌的检测 0070 按照5点取样法， 从山东泰安的两个苦瓜保护地分别采集土壤样品各一份， 分别编 号为T1和T2； 按照实例。

34、7中提取土壤总DNA的方法提取样品的总DNA， 作为模板用于PCR扩增 说明书 6/9 页 8 CN 107916295 A 8 检测； 按照本发明试剂盒组装中规定的PCR反应体系和反应条件， 扩增DNA， 上样检测6 l PCR产物。 结果表明， 编号为T1的土壤检测为阳性， 表明该土壤中含有苦瓜枯萎病菌； 编号为 T2的土壤样品检测结果为阴性， 表明该土壤中不含有苦瓜枯萎病菌； 图中M为2000bp DNA标 准分子量， CK-为阴性对照， CK+为阳性对照， T1为土壤样品1， T2为土壤样品2， 见图7。 0071 苦瓜保护地罹病苦瓜植株枯萎病菌的检测， 以健康苦瓜植株为对照。 007。

35、2 分别从山东泰安和福建漳州采集健康苦瓜和罹病苦瓜植株各三份。 其中， 山东泰 安的一份健康植株样品的编号为J1， 两份罹病植株样品的编号分别为B1和B2； 福建漳州的 一份健康植株样品编号为J2， 两份罹病植株样品编号分别为B3和B4， 按照实例8中的方法提 取植株样品茎基部的总DNA， 作为模板用于PCR扩增检测。 按照本发明试剂盒说明书中规定 的PCR反应体系和反应条件， 扩增DNA， 上样检测6 l PCR产物。 结果显示， 从山东泰安和福建 漳州采集的健康植株样品， 其检测结果均为阴性， 而从其它两个地区采集的罹病植株样品 的检测结果均为阳性， 表明本发明的试剂盒检测结果具有很强的特。

36、异性和可靠性。 图中M为 2000bp DNA标准分子量， CK-为阴性对照， CK+为阳性对照， J1为山东泰安的健康植株样品， B1和B2分别为山东泰安的罹病植株样品； J2为福建漳州的健康植株样品， B3和B4分别为福 建漳州的罹病植株样品， 见图8。 0073 序列表 0074 SEQ.ID.No.1 0075 URP-32F： 5 TACACGTCTCGATCTACAGG 3 (20bp) 0076 SEQ.ID.No.2 0077 说明书 7/9 页 9 CN 107916295 A 9 0078 说明书 8/9 页 10 CN 107916295 A 10 0079 0080 S。

37、EQ.ID.No.3 0081 FOMM-SPF： 5 AAGGATAACGAGGCTAGCT 3 (19bp) 0082 SEQ.ID.No.4 0083 FOMM-SPR： 5 GTATAGAGCATCTAGACACGAATGC 3 (25bp) 0084 SEQ.ID.No.5 0085 0086 SEQ.ID.No.6 0087 ITS1： 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 (19bp) 0088 SEQ.ID.No.7 0089 ITS4： 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 (20bp) 0090 上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明， 但是本发明并不。

38、限于上述实施方 式， 在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内， 还可以在不脱离本发明宗旨的前提下 作出各种变化。 说明书 9/9 页 11 CN 107916295 A 11 申请人： 河南农业大学 发明名称： 一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法 发明人:丁胜利 文才艺 李震 郭康迪 赵玉华 赵莹 序列表 SEQ.ID.No.1 URP-32F： 5 TACACGTCTCGATCTACAGG 3 (20 bp) SEQ.ID.No.2 1 GAGCAAAGAA TAAAGGTGAG TCGAGATATC TACTGGCTCG CGAATCGAGG 51 GAGATA。

39、GTGC TCGGTAGAGA GCATTTTCTT CGGTTGTACG TGGCCTTGTC 101 TTGCGATAGT GCTCTTCGCG GGGGGAGGCA GGAGGGGCAG GACTTCCAAT 151 TACTACGATG TGTCCGGTGA AGGGAGAAGG TGCTCGGCAA AAAACGCTTT 201 CTCGCCTGAT GATCCGCAGC TAGCATGGGG TGGTGCAGAT CGAACTGGGA 251 AGACTTGGGA AGGGGGAGCT GATGGCTCGA CAACCTTTGG AGGGGAAGGA 301 AAGGTAGTCT 。

40、GCTTGGAGTT TACCTCTTTG CCTTTCTAGA TGGCCTCCCC 351 TATTACAATA GATCCCGCGC TTTTCAGAAA AATAATAGAC GTATTCAATG 401 GTTCGAAGAG AATGCAAAAT TTATATATAG TTCTTCCGTT CACCTGCGCA 451 GTGTCTTCTT GCTACTCCTG GTTCGGTAGC ACTAATGCAA GAATGTTGAT 501 GCTCATGAGC GTCTCTGGAT GCTCTCTGCC AAACATCTTT TCTTACCTTT 551 CCATGGCTCT TCGAG。

41、CCATC TGTACCGCCT CTTCGTGTTC TCCCTGCTGT 601 TGCAGCACCA ACGCAAGGAT AACGAGGCTA GCTAGCGTGA GAGGATGCTC 651 TTTGCCAACC ACCCTTCTAT TCCCCTCAAG AGCTCGTCGA GCCATCATCT 701 CTGCCTCTTC ATGTTTCCAC TGTTTTTGTA GCACCACCGC AAGATTGTTG 751 AGGCTCATAA GCGTGTCTAG ATGTTCTCTG CCGAGCACCC TCTCCCTCGC 801 CTCTAGAGCT AGTCAAGCCA。

42、 TCTGCTCGGC TTCCTCAAAA TTCGCCTGGT 851 TCTGTATCAC TATCGCAAGG ATTGTTGACG CTTGCATTCG TGTCTAGATG 901 CTCTATACCG AGCACTGTTC TCCCTCGCTT CCAGAGCTCG TCGATTCGCC 951 GACTCTGCCT TCTTTCGTAC TTTCCCTGGC CGTGTAGATC GAGACGTGAT 1001 AAAGGTAAAA AGGC 1014 SEQ.ID.No.3 FOMM-SPF： 5 AAGGATAACGAGGCTAGCT 3 (19 bp) SEQ.ID.No。

43、.4 FOMM-SPR： 5 GTATAGAGCATCTAGACACGAATGC 3 (25 bp) SEQ.ID.No.5 1 AAGGATAACG AGGCTAGCTA GCGTGAGAGG ATGCTCTTTG CCAACCACCC 51 TTCTATTCCC CTCAAGAGCT CGTCGAGCCA TCATCTCTGC CTCTTCATGT 101 TTCCACTGTT TTTGTAGCAC CACCGCAAGA TTGTTGAGGC TCATAAGCGT 151 GTCTAGATGT TCTCTGCCGA GCACCCTCTC CCTCGCCTCT AGAGCTAGTC 201 。

44、AAGCCATCTG CTCGGCTTCC TCAAAATTCG CCTGGTTCTG TATCACTATC 序列表 1/2 页 12 CN 107916295 A 12 251 GCAAGGATTG TTGACGCTTG CATTCGTGTC TAGATGCTCT ATAC 294 SEQ.ID.No.6 ITS1： 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 (19 bp) SEQ.ID.No.7 ITS4： 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 (20 bp) 序列表 2/2 页 13 CN 107916295 A 13 图1 图2 图3 说明书附图 1/4 页 14 CN 107916295 A 14 图4 图5 说明书附图 2/4 页 15 CN 107916295 A 15 图6 图7 说明书附图 3/4 页 16 CN 107916295 A 16 图8 说明书附图 4/4 页 17 CN 107916295 A 17 。