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1、(10)授权公告号 CN 102757929 B (45)授权公告日 2013.07.24 CN 102757929 B *CN102757929B* (21)申请号 201210244458.2 (22)申请日 2012.07.16 C12N 1/38(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (73)专利权人 江苏远山生物技术有限公司 地址 224001 江苏省盐城市亭湖区迎宾大道 888 号 101 室 （28） (72)发明人 李拖平 李妍 左其海 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 夏平 CN 101624611 A,2010.0。
2、1.13, 全文 . CN 102404990 A,2012.04.04, 全文 . (54) 发明名称 促进酪酸梭菌增殖的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高效的促进酪酸梭菌增殖 的方法， 包括 ： 把酸性寡糖加入到含有酪酸梭菌 的培养基或动物体内。优点是 ： 植物低聚糖与酪 酸梭菌在离体或动物体内共存的条件下可以明显 促进酪酸梭菌的增殖。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 田颖 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102757929 B 。
3、CN 102757929 B *CN102757929B* 1/1 页 2 1. 促进酪酸梭菌增殖的方法， 其特征在于 ： 包括 ： 把酸性寡糖按 0.25% 的比例加入到 含有酪酸梭菌的培养基 , 所述酸性寡糖的制备方法如下 ：（1） 取质量百分浓度为 1%-2% 的果胶水溶液， 调 pH 为 2-4， 在 90-120， 分解反应 15 分钟 -24 小时 ； 或取质量百分浓度 为 1%-2% 的果胶水溶液， 按每克果胶加入 0.01-1.0Unit 酶活单位的比例， 加入果胶水解酶 或果胶裂解酶， 在 30-50， pH 为 3.5-4.5， 分解反应 30 分钟 -24 小时， 得到果。
4、胶分解物 ； （2） 将得到的果胶分解物用中空纤维膜或陶瓷过滤膜处理， 回收分子量 6000 道尔顿以下 的寡糖混合物后， 用纳滤膜回收分子量 200-6000 的寡糖混合物， 用 Bio-gel P-2 凝胶柱或 Sephadex G-25 凝胶柱层析分离得到重合度为 2-20 的果胶酸性寡糖 ； 或将得到的果胶分解 物用中空纤维膜或陶瓷过滤膜处理， 回收分子量 6000 道尔顿以下的寡糖混合物后， 再用纳 滤膜回收分子量200-6000的寡糖混合物， 过DEAE-Sephadex A-25阴离子交换树脂， 用相当 床体积 5-10 倍的 0.05-1M 的无机盐水溶液梯度洗脱， 得到重合度。
5、为 2-20 的果胶酸性寡糖。 2. 按照权利要求 1 所述的促进酪酸梭菌增殖的方法， 其特征在于 ： 所述的酸性寡糖是 粉末、 片剂。 3. 按照权利要求 1 或 2 所述的促进酪酸梭菌增殖的方法， 其特征在于 ： 所述的酸性寡 糖可以与辅料配合使用， 所述的辅料是 ： 碳水化合物、 蛋白质、 维生素或矿质元素的一种或 几种的混合。 权 利 要 求 书 CN 102757929 B 2 1/2 页 3 促进酪酸梭菌增殖的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种促进酪酸梭菌增殖的方法。 背景技术 0002 近年来， 肠道微生物菌群对人体与动物健康的影响作用被逐渐阐明， 肠道微生物 菌群的生殖平。
6、衡对健康的重要意义也逐渐被人们所认识。 其中酪酸梭菌是近年来被人们普 遍关注的一种动物肠道益生菌。酪酸梭菌是一种厌氧芽苞杆菌， 具有耐热耐酸及对常用抗 生素有抗性等特点， 具有修复肠黏膜、 恢复肠道菌群平衡、 提高免疫力、 抗炎抑癌等多方面 的生理作用。有研究报告证实， 酪酸梭菌有抑制引起痢疾的致病菌如霍乱弧菌、 志贺氏菌、 沙门氏菌、 致病性大肠杆菌、 出血性大肠杆菌以及引起伪膜性肠炎的魏氏梭菌的增殖的作 用。 酪酸梭菌制剂用于治疗细菌性腹泻、 病毒性腹泻和霉菌性腹泻， 其治愈率与抗生素相当 且无抗生素的不良反应。酪酸梭菌可以促进双歧杆菌、 乳酸菌和粪链球菌等肠道益生菌的 生长繁殖。 此外，。
7、 酪酸梭菌的代谢产物丁酸还具有活化与修复动物肠道上皮细胞、 治疗炎症 性肠炎、 促进动物肠道对水分和营养物质的吸收、 抑制肠内腐败物质的生成等作用。在食 品、 饲料、 医药品中具有广泛的用途。 但是， 酪酸梭菌也具有生长繁殖量低， 体外培养难度大 等特性。到目前为止， 国内外还没有报道过能有效的促进酪酸梭菌增殖的物质与方法。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是 ： 提供一种高效的促进酪酸梭菌增殖的方法。 0004 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 促进酪酸梭菌增殖的方法， 包 括 ： 把酸性寡糖加入到含有酪酸梭菌的培养基或动物体内。 0005 为了更好地解决上述技。
8、术问题， 本发明采用的进一步技术方案是 ： 所述的酸性寡 糖可以是粉末、 片剂或液体。 0006 为了更好地解决上述技术问题， 本发明采用的进一步技术方案是 ： 所述的酸性寡 糖可以与辅料配合使用， 所述的辅料可以是 ： 碳水化合物、 蛋白质、 维生素或矿质元素的一 种或几种的混合。 0007 本发明的优点是 ： 植物低聚糖与酪酸梭菌在离体或动物体内共存的条件下可以明 显促进酪酸梭菌的增殖。 附图说明 0008 图 1 酸性寡糖对酪酸梭菌生长的影响 0009 图 2 酸性寡糖对大鼠肠道酪酸梭菌生长量的影响 0010 图 3 酸性寡糖对鸡肠道酪酸梭菌生长量的影响 0011 图 4 酸性寡糖对仔猪。
9、肠道酪酸梭菌生长量的影响。 具体实施方式 说 明 书 CN 102757929 B 3 2/2 页 4 0012 下面结合附图和具体实施例详细描述一下本发明的具体内容。 0013 促进酪酸梭菌增殖的方法， 包括 ： 把酸性寡糖加入到含有酪酸梭菌的培养基或动 物体内。所述的酸性寡糖为专利号 ： 200910012598.5 专利名称 ： 具有减肥与降血脂效果的 酸性寡糖及其应用中所提到的酸性寡糖。所述的酸性寡糖可以是粉末、 片剂或液体。所述 的酸性寡糖可以与辅料配合使用， 所述的辅料可以是 ： 碳水化合物、 蛋白质、 维生素或矿质 元素的一种或几种的混合。 0014 离体实验 ： 0015 把酸。
10、性寡糖粉末按0.25%的比例加入到酪酸梭菌的培养基 （葡萄糖1%、 酵母粉1%、 NaCl0.5%） 中， 以未加酸性寡糖的培养基作为对照， 经灭菌处理后接入一定量的酪酸梭菌， 37进行厌氧培养 36h 后在 660 nm 处检测其培养液的吸光度。以吸光度的变化来判定酸 性寡糖对酪酸梭菌生长的促进作用。结果如图 1 所示， 酸性寡糖与酪酸梭菌在离体条件下 共同培养后， 其生殖生长的菌数显著的多于未添加植物寡糖的菌数。 0016 大鼠盲肠实验 ： 0017 将大鼠随机分为对照组和样品组2组， 每组6只。 样品组每只大鼠每天按150 mg/ kg 体重剂量灌胃液态的酸性寡糖， 对照组每天灌胃蒸馏水。
11、， 每天一次， 连续灌胃 2 周后解 剖， 取盲肠部分的粪便分离培养 （培养基 ： 蛋白胨 15g/L、 酵母粉 2g/L、 葡萄糖 20g/L、 可 溶性淀粉 0. 5g/L、 NaCl 5g/L、 5% 半胱氨酸 10ml/L） 考察其酪酸梭菌菌落数的变化情况。 结果如图 2 所示， 酸性寡糖可以显著的增加大鼠肠道中的益生菌酪酸梭菌的数量， 起到 调节肠道菌落的作用。 0018 鸡粪便实验 ： 0019 采用随机区组设计， 选择同一品种的雏鸡45只， 随机分为3组， 每组15只。 第1组 为对照组 （玉米 豆粕型基础日粮） ， 第 2 组在基础日粮中添加酪酸梭菌制剂 （1108cfu/ g。
12、， 5g/kg） ， 第 3 组在基础日粮中添加酪酸梭菌制剂 （1108cfu/g， 5g/kg）和酸性寡糖 （2.25g/kg） 。各组每天均定时饲喂 3 次， 不限制采食量， 自由饮水。连续饲喂 14 天， 于给受 试物最后一次 24h 后无菌采取鸡粪便， 经分离菌处理接种到选择性培养基 （蛋白胨 15g/L、 酵母粉 2g/L、 葡萄糖 20g/L、 可溶性淀粉 0. 5g/L、 NaCl 5g/L、 5% 半胱氨酸 10ml/L） 上 37厌氧培养 48h， 以考察粪便中酪酸梭菌的数量。结果如图 3 所示， 与对照及 0020 酪酸梭菌单独使用相比， 酸性寡糖可以明显的促进酪酸梭菌在鸡。
13、肠道内的增殖。 0021 猪粪便实验 0022 选择同一品种的断奶仔猪 30 头， 随机分为 3 组， 每组 10 只。第 1 组为对照组 （玉 米 豆粕型基础日粮） ， 第 2 组在基础日粮中添加酪酸梭菌制剂 （1108cfu/g， 5g/kg） ， 第 3 组在基础日粮中添加酪酸梭菌制剂 （1108cfu/g， 5g/kg） 和酸性寡糖 （4g/kg） 。试验为期 14 天， 各组每天定时饲喂 3 次， 不限制采食量， 自由饮水。连续饲喂 14 天 , 于给受试物最 后一次 24h 后无菌采取猪粪便， 经分离菌处理接种到选择性培养基 （蛋白胨 15g/L、 酵母 粉 2g/L、 葡萄糖 20g/L、 可溶性淀粉 0. 5g/L、 NaCl 5g/L、 5% 半胱氨酸 10ml/L） 上 37厌 氧培养 48h 以考察粪便中酪酸梭菌的数量。结果如图 4 所示， 与对照及酪酸梭菌单独使用 相比， 酸性寡糖可以明显的促进酪酸梭菌在猪肠道内的增殖。 说 明 书 CN 102757929 B 4 1/2 页 5 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757929 B 5 2/2 页 6 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757929 B 6 。