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1、(10)申请公布号 CN 102776200 A (43)申请公布日 2012.11.14 CN 102776200 A *CN102776200A* (21)申请号 201110119289.5 (22)申请日 2011.05.10 C12N 15/13(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C07K 16/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院北京基因组研究所 地址 100029 北京市朝阳区北土城西路 7 号 G 座 申请人 舟山同生生物科技有限公司 (72)发明人 邵长君 高静 王绪敏 冯杰 于军 (54) 发明名。
2、称 一种单克隆抗体制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种单克隆抗体制备方法。该 方法采用向淋巴 B 细胞培养微孔中加入固相化抗 原的磁颗粒微球， 磁力分离磁颗粒微球至对应微 孔板， 免疫化学发光法或免疫荧光方法检测出分 泌特异抗体的单个 B 细胞， 通过单细胞 RT-PCR 及 巢式 PCR 的方法扩增出抗体轻、 重链可变区基因 并重组至包含抗体恒定区的表达质粒， 转染宿主 细胞表达单克隆抗体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 6。
3、 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种单克隆抗体制备方法， 其特征在于该方法由六个步骤组成 ： (a) 动物免疫 ； (b) 有限稀释免疫动物血液细胞， 置细胞培养微孔板中培养， 每孔一个淋巴细胞 ； (c) 向细胞培 养微孔中加入固相化抗原的磁颗粒微球， 捕获靶淋巴 B 细胞分泌的特异抗体 ； (d) 磁力分离 出磁颗粒微球， 免疫荧光法或化学发光酶联免疫方法检测， 确定阳性孔细胞 ； (e) 单细胞反 转录 (RT-PCR) 和核苷酸聚合链式反应 (PCR) 扩增得到抗体可变区序列 ； (f) 抗体可变区序 列克隆到抗体表达载体， 转化或转染宿主细胞表达抗体。 2. 根据权利要求 。
4、1 所述的方法， 其特征在于细胞培养微孔板微孔的容积为 0.01l-100l， 优选微孔的容积为 0.05l-2l。 3.根据权利要求1所述的方法， 根据权利要求4所述的磁颗粒， 其特征在于磁颗粒表面 活性基团可为氨基、 羧基、 环氧基、 甲苯磺酰基及巯基中的任意一种， 优选为环氧基， 抗原共 价键固定于磁颗粒表面。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于通过磁力吸引将抗原固相化的磁颗粒吸引 至另一微孔板对应的微孔中。 5. 根据权利要求 1 所述的免疫荧光法方法， 其特征在于采用生物素化二抗、 荧光素标 记亲和素的免疫荧光系统。 6. 根据权利要求 1 所述的化学发光酶联免疫方法，。
5、 其特征在于采用了生物素二抗、 亲 和素化过氧化物酶的化学发光酶联免疫系统。 7.根据权利要求1所述的兔抗体基因逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)， 其特征在于以 位于抗体重链、 轻链恒定区核苷酸序列的特异引物为 RT-PCR 引物， 以位于 5 端 Leader 及 FR1 区的引物为上游引物， 以位于抗体恒定区的引物为下游引物进行 nest PCR 扩增出抗体 重链、 轻链可变区基因。 8. 根据权利要求 7 所述的兔抗体基因 RT-PCR 引物， 其特征在于抗体重链 RT 引物序列 如 SEQ ID NO ： 1， 抗体 轻链 RT 引物序列如 SEQ ID NO ： 13， 抗体 轻。
6、链 RT 引物序列如 SEQ IDNO ： 18。 9. 根据权利要求 7 所述的聚合酶链式反应 (PCR) 引物及组合， 其特征在于抗体重链第 一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 2-3， 下游引物序列如SEQ ID NO ： 4， Nest PCR上游引 物序列如 SEQ ID NO ： 5-11， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 12。抗体 轻链第一次 PCR 上游 引物序列如 SEQ ID NO ： 14， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 15， Nest PCR 上游引物序列如 SEQ ID NO ： 16， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 17。。
7、抗体 轻链第一次 PCR 上游引物序列如 SEQ ID NO ： 19， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 20， Nest PCR 上游引物序列如 SEQ ID NO ： 21， 下游 引物序列如 SEQ IDNO ： 22。 10. 一种高通量制备单克隆抗体的方法， 其特征在于使用了权利要求 1 所述的基本方 法。 权 利 要 求 书 CN 102776200 A 2 1/4 页 3 一种单克隆抗体制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程和单克隆抗体生产技术领域。具体地， 本发明涉及检测识别 分泌抗原特异抗体的单个 B 细胞， 经 RT-PCR 和 PCR 的方法扩增出抗体轻。
8、、 重链可变区基因， 经同源重组构建于包含恒定区基因的载体， 转染细胞制备单克隆抗体。 背景技术 0002 抗体是机体的免疫系统在抗原刺激下， 由 B 淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆 细胞合成、 分泌所产生， 能够与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白， 是介导体液免疫重 要的免疫效应分子。 抗体具有中和病毒、 激活补体系统、 介导免疫细胞活性包括抗体的调理 与抗体依赖细胞介导的细胞毒等作用， 是机体抵抗外来病原体入侵的重要机制。抗体单体 分子是由两条相同、 相对分子量较大的重链和两条相同、 相对分子量较小的轻链， 四条多肽 链通过二硫键连接和非共价键联结形成， 呈 “Y” 字形结构。每条重链。
9、、 轻链由可变区与恒定 区组成， 抗体的可变区内的核苷酸序列变化较大， 是抗原决定簇的所在， 抗体的 L 链可变区 可分为 C、 V、 J 三部分， H 链可分为 C、 V、 D、 J 四个部分。抗体的恒定区核苷酸序列相对保守， 根据重链恒定区的不同， 又抗体可分为 IgM()、 IgG()、 IgA()、 IgD() 和 IgE()， 其 中 IgG 是目前应用最广泛的抗体类别。 0003 大多数抗原分子具有多个抗原表位， 每一种表位均可刺激机体一个 B 细胞克隆产 生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是将抗原免疫动物制备出抗血清， 再经纯化得到 抗体。由于抗原刺激多个 B 细胞克隆产生针对。
10、不同抗原表位的多种抗体。因此， 所获得的 抗体实际上是含有多种抗体的混合物， 称为多克隆抗体 (Po1yclonal antibody， pAb)。由 于这种抗体是针对多种抗原表位， 特异性不高， 易出现交叉反应， 其应用也受到限制。 0004 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 采用细胞杂交技术创立了单克隆抗体技 术 (Monoclonal antibody)， 由此获 1984 年诺贝尔奖。该技术是将永生的骨髓瘤细胞与免 疫小鼠产生致敏 B 淋巴细胞在聚乙二醇作用下融合， 形成杂交瘤细胞。融合后的杂交瘤细 胞采用 HAT 选择性培养基。在 HAT 培养基中， 未融合。
11、的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤 - 鸟嘌 呤-磷酸核糖转移酶， 不能利用补救途径合成DNA而死亡， 而未融合的淋巴细胞虽具有次黄 嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶， 但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂 交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶， 并具有骨髓瘤细胞能无限 增殖的特性， 因此能在 HAT 培养基中存活和克隆增殖。由于不是所有的杂交瘤细胞是分泌 特异性单克隆抗体， 因此还需要筛选和克隆化。该方法制备单克隆抗体周期长、 操作繁杂， 杂交瘤细胞体外培养抗体产量低等缺点。 Aishun Jin等人发明经微孔芯片法扩增人外周血 抗原特异的 B 细胞抗体基因。该技术采用。
12、的硅微孔芯片的微孔直径约 20m， 高约 20m， 刚好容纳一个细胞， 因此是单细胞芯片。该技术在微孔表面包被抗人二抗， 捕获 B 细胞分泌 的抗体， 加入生物化抗原、 荧光素标记的亲和素孵育后， 形成抗体 - 生物素化二抗 - 荧光素 标记的亲和素复合物， 分泌抗体阳性细胞孔在荧光显微镜呈现荧光信号。 通过显微操作， 将 单个细胞移至 PCR 管内经 RT-PCR 扩增出抗体轻、 重链可变区基因， 将基因克隆于含有恒定 说 明 书 CN 102776200 A 3 2/4 页 4 区的抗体表达质粒， 转染细胞表达抗体。该技术具有高通量、 操作快速的特点， 能够在两周 内完成单克隆抗体的制备，。
13、 但该技术中的微孔芯片制备及芯片检测信号的读取需要专门的 仪器， 实验费用及条件要求高不能为一般实验室所采用。 发明内容 0005 本发明提供一种新的制备单克隆抗体方法， 能够以较高通量、 较低成本、 快速制备 出单克隆抗体， 该方法由五个步骤组成， (a) 动物免疫 ； (b) 有限稀释免疫动物血液细胞， 置 细胞培养微孔板中培养， 每孔一个淋巴细胞 ； (c) 使用固相化抗原载体筛选出分泌特异抗 体的靶淋巴 B 细胞 ； (d) 采用抗体可变区引物组合， 通过反转录 (RT-PCR) 和核苷酸聚合链 式反应 (PCR) 扩增得到抗体可变区序列 ； (e) 将抗体可变区序列克隆到包含恒定区基。
14、因的 抗体表达载体， 转化或转染宿主细胞制备单克隆抗体抗体。 0006 本发明提供了一种方法， 通过有限稀释法将单个 B 细胞分布于细胞培养微孔板 内， 于微孔内加入包被特异抗原的磁颗粒以捕获分泌的抗体， 通过磁力吸引将磁颗粒从细 胞培养板中分离转入另一微球检测微孔板对应孔内， 加入生物素化二抗、 亲和素化 HRP 及 化学发光底物， 检测化学发光信号， 确定阳性信号的B细胞， 经RT-PCR扩增抗原特异的抗体 基因。 0007 本发明不同于Aishun Jin等人的微孔芯片法在于， 该技术制备了仅能容纳一个细 胞的固相化抗原微孔芯片， 进行后面反应时要小心避免悬浮生长的 B 细胞跑掉， 在获。
15、取目 的细胞时要采用显微操作， 这不能为一般实验室所使用， 而本发明采用固相化抗原磁颗粒 球在细胞周围形成包裹层， 通过磁力分离培养细胞和磁颗粒球， 使操作在宏观下进行成为 可能。 0008 本发明提供了一种方法， 是将抗原经共价键固定于磁颗粒表面， 磁颗粒表面活性 基团可为氨基、 羧基、 环氧基及巯基， 直径范围为 1-10m， 优选直径为 2.0-5.0m。磁颗粒 是由各种含活性功能基团的有机高分子材料与无机磁性物质复合制备而成的， 目前使用最 多的是 F e2O 3， 外面包裹的高分子材料为聚苯乙烯， 活化的磁颗粒表面带有氨基、 羧基、 环 氧基、 甲苯磺酰基、 巯基、 羟基等， 已被广。
16、泛应用于免疫学检测。 本发明对磁颗粒的封闭液进 行了优化， 组分为0.02M PH 7.4PBS 1BSA-V 1Triton X-100。 此外对包涵体复性蛋白 标记条件进行了优化， 包涵体用 6M 盐酸胍、 1 SDS 溶解后可进行环氧基磁颗粒的标记。 0009 本发明提供了一种方法， 是通过有限稀释法将单个 B 细胞分布于细胞培养微孔板 内， 细胞培养微孔板的微孔体积为0.1-2l。 研究表明， 一个人抗体分泌细胞(ASC)一天可 以分泌的1pg抗体， 而工业化生产细胞PER.C6细胞一天最高可以分泌10pg。 为了提高检测 检测灵敏度， 本发明对生物素二抗、 亲和素化过氧化物酶或碱性磷。
17、酸酶的酶联免疫系统化 学发光系统进行了优化， 检测灵敏度达 fg 水平。本发明对微孔体积、 磁颗粒进行了优化， 较 佳的微孔体积在 0.1-2l， 每孔加入磁颗粒微球数目为 40-200 个， 优选的磁颗粒微球直径 为 2.8-4.5m。 0010 本发明对扩增兔抗体重链、 轻链可变区的 RT-PCR、 PCR 引物及组合进行了优化， 抗 体重链 RT 引物位于抗体恒定区， 序列如 SEQ ID NO ： 1， 第一次 PCR 上游引物序列如 SEQ ID NO ： 2-3， 下游引物序列如SEQ ID NO ： 4， Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 5-11， 下游引 。
18、物序列如SEQ ID NO ： 12。 抗体轻链RT引物位于抗体恒定区， 序列如SEQ ID NO ： 13， 第一 说 明 书 CN 102776200 A 4 3/4 页 5 次PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 14， 下游引物序列如SEQ ID NO ： 15， Nest PCR上游引物 序列如SEQ ID NO ： 16， 下游引物序列如SEQ ID NO ： 17。 抗体轻链RT引物位于抗体恒定 区， 序列如SEQ ID NO ： 18， 第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 19， 下游引物序列如SEQ IDNO ： 20， Nest PCR 上游引物序列如 。
19、SEQ ID NO ： 21， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 22。这些 上述抗体基因扩增引物也可重新组合后进行抗体基因的扩增， 如重链 RT 引物位于抗体恒 定区第一次 PCR 下游引物为 RT 引物， Nest PCR 下游引物为第二次 PCR 的下游引物。本发 明采用 Infusion 同源重组技术将抗体重链、 轻链可变区重组至抗体表达载体如 Invivogen 公司的 pFUSE2-CLIg-rk1、 pFUSE2-CLIg-rK2 与 pFUSE-CHIg-rG 或者是包含抗体 leader 和 FC 基因的腺病毒、 慢性毒载体， 相比传统内切酶方法联接提高连接效率。 00。
20、11 本发明提供单克隆抗体制备方法， 抗原特异 B 细胞来源可是经抗原致敏的任何部 位的 B 细胞包括脾与外周血淋巴细胞。 0012 本发明提供的方法可用于单克隆抗体基因的扩增和抗体制备 附图说明 0013 图 1 是通量扩增抗原特异的单 B 细胞抗体基因技术流程。 0014 图 2 是细胞微孔培养板和检测板示意图。 0015 图 3 是磁颗粒分离示意图 0016 图 4 是磁颗粒 - 微孔化学放光法测定兔单 B 细胞分泌的抗体。 0017 实施方式 0018 具体实施例 1 抗原致敏的兔淋巴 B 细胞制备 0019 将纯化后的 hbub3 蛋白溶解在 1PBS， 取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐。
21、剂 (Sigma) 混匀乳化， 取体重 2Kg 的新西兰大耳白兔， 背部皮下多点注射抗原。3 周后， 取适量 的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂 (Sigma) 混匀乳化， 在大耳白兔的背部皮下， 进行第二次免 疫， 隔 3 周， 进行第三免疫， 免疫后 3-7 天， 取外周血淋巴细胞。 0020 具体实施例 2 抗体分泌阳性细胞的筛选 0021 (1) 抗原偶联 0022 取 3mg 直径为 2.8m 表面为环氧基基团的磁颗粒干粉 (Dynabeads M-270Epoxy， Invitrogen 公司 )， 加入 200l 的 0.1M PB， pH 7.4， 震荡混悬后静止 10 分钟， 置磁力。
22、架上 2min 聚集磁颗粒， 去液体， 重复洗 2 次加入。取 60l 体积 1mg hbub3 抗原 ( 可溶性抗原溶 解于 PB， 包涵体于 SDS 中复溶， SDS 终浓度为 1 )， 加入 60l 0.1M PB， pH 7.4 悬浮的磁 颗粒， 震荡混匀。再向管内加入 60l 3M(NH4)2SO4( 溶于 0.1M PB， pH 7.4)， 混匀， 旋转反 应 37 20h。反应完毕后， 置磁力架上 4min， 分离磁颗粒， 用 0.1 BSAPBS 洗两次。 0023 (2) 抗体检测 0024 取外周血淋巴细胞与磁颗粒混匀， 记数后稀释至 0.9 个细胞 /10 个磁颗粒 /1。
23、l， 1l/孔于1536细胞培养板微孔内培养3小时， 磁颗粒通过磁力器吸至化学发光微孔板内， 细胞培养板冻存于 -80。向化学发光微孔板内加入 6l 100ng/ml 生物素化山羊抗兔 二抗 (0.02M PH 7.4PBS1 BSA-V 1 Triton X-100)， 室温 1h， 再加入洗涤液 (0.02M PH 7.4PBS， 1 Triton X-100)， 洗涤 3 次， 加入 6l100ng/ml 亲和素 -HRP(0.02M PH 7.4PBS 1 BSA-V 1 Triton X-100)， 室温 30min， 再加入洗涤液 (0.02M PH 7.4PBS， 1 Trito。
24、n 说 明 书 CN 102776200 A 5 4/4 页 6 X-100)， 洗涤 3 次。加入 6l 化学发光底物， 化学发光仪读值。RLU 值为阴性对照孔 RLU 值 的 2.1 倍为阳性。 0025 具体实施例 3 抗体可变区基因扩增 0026 将细胞培养板从 -80移至室温 ( 以下操作按 RNA 操作进行 )， 将阳性孔内细胞裂 解液移至RT-PCR管内， 加入0.5l RNasin。 以位于抗体恒定区的引物作为特异引物， 采用 SuperScript III First-Strand Synthesis(Invitrogen公司)合成抗体重链、 轻链CDNA。 以上为位 5 端。
25、 Leader 及 FRI 区的引物为上游引物， 以位于抗体恒定区的引物为下游引物 进行 nest PCR 扩增出抗体重链、 轻链可变区基因。扩增兔抗体重链 RT 引物位于抗体恒定 区， 序列如SEQ ID NO ： 1， 第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 2-3， 下游引物序列如SEQ IDNO ： 4， Nest PCR 上游引物序列如 SEQ ID NO ： 5-11， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 12。抗 体 轻链 RT 引物位于抗体恒定区， 序列如 SEQ ID NO ： 13， 第一次 PCR 上游引物序列如 SEQ IDNO ： 14， 下游引物序列如。
26、SEQ ID NO ： 15， Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 16， 下游引 物序列如 SEQ ID NO ： 17。抗体 轻链 RT 引物位于抗体恒定区， 序列如 SEQ ID NO ： 18， 第 一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO ： 19， 下游引物序列如SEQ ID NO ： 20， Nest PCR上游引 物序列如 SEQ ID NO ： 21， 下游引物序列如 SEQ ID NO ： 22。 0027 具体实施例 4 抗体表达质粒的构建与表达 0028 (1) 抗体表达质粒构建 0029 PCR 扩增抗体重链、 轻链可变区基因片段， 通过 clon。
27、etch 公司 Infusion 重组技 术连接到抗体表达质粒上如 Invivogen 公司的 pFUSE2-CLIg-rk1、 pFUSE2-CLIg-rK2 与 pFUSE-CHIg-rG 或者是包含抗体 leader 和 FC 基因的腺病毒、 慢性毒载体。 0030 (2) 转染、 永生化筛选 0031 利用转染试剂 Lipofectamine2000(Invitrogen)， 将构建好的质粒共转染 293T 细 胞。5 小时后加入含 10 FBS 培养过夜， 0.5mg/mL G418， 每周换两次液， 三周后亚克隆， 培 养一段时间后 westerblot 或 ELISA 检测细胞分。
28、泌抗体 IgG 识别 hbub3 的特异性。 说 明 书 CN 102776200 A 6 1/6 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102776200 A 7 2/6 页 8 0003 序 列 表 CN 102776200 A 8 3/6 页 9 0004 序 列 表 CN 102776200 A 9 4/6 页 10 0005 序 列 表 CN 102776200 A 10 5/6 页 11 0006 序 列 表 CN 102776200 A 11 6/6 页 12 序 列 表 CN 102776200 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102776200 A 13 2/2 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102776200 A 14 。