技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生物工程 菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系。
背景技术
果葡糖浆是一种新型甜味剂。果葡糖浆的甜度最高，相当于蔗糖1.8倍，并且果葡糖浆具 有类似蜜糖的风味和不易引起血糖升高的性能。当前，国内外需求量大，主要应用于食品领 域的饮料、面包、奶制品、罐头、果糖和其它食品。淀粉是制备果葡糖浆的主要是原料。
用不甜的淀粉为原料转变成具有甜味的葡萄糖，再通过异构化反应转变葡萄糖生成果糖， 生产果葡糖浆(果糖和葡萄糖的混合物)。
淀粉由直链和支链组成。支链由α-1，6糖苷键连接，而直链的糖分子之间由α-1，4糖 苷键连接。在天然的淀粉质原料中，支链淀粉的含量约占70％～95％，而直链淀粉的含量≤ 30％。异淀粉酶(Isoamylase，E.C.3.2.1.68)能专一性地分解支链淀粉中分支点的α-1，6糖苷 键，将支链淀粉转化为直链淀粉，因此又称为脱支酶。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase， E.C.3.2.1.3)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化直链淀粉水解为葡萄糖。在异淀粉酶和葡萄 糖淀粉酶的联合作用下，淀粉水解生成葡萄糖。木糖异构酶具有异构葡萄糖为果糖的功能。 酶法生产果葡糖浆是果葡糖浆生产的主要途径。当前，酶法生产果葡糖浆的方法是先生产异 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，通过异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用，将淀粉水解生成葡萄糖；然 后，再用木糖异构酶异构葡萄糖为果糖，生产果糖与葡萄糖混合的果葡糖浆。这些酶的分别 生产需要大量的人力和能耗。
当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。毕赤酵 母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋 白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固 态厌氧发酵生产重组酶。
发明内容
本发明根据异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有联合水解淀粉生成果葡糖浆的 作用(即异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成果葡糖浆的酶系)，市场上还 没有异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的水解淀粉生成果葡糖浆的酶系产品；毕赤酵母、 酿酒酵母和枯草芽孢杆菌是常用于表达外源蛋白的宿主菌，而通过分子生物学技术构建含异 淀粉酶基因表达框架(说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子)、葡萄糖淀粉酶基 因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌 工程菌。用含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框 架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶 系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。
本发明所采用的技术方案是：
1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，从假单胞杆菌(pseudomonas)基因组中扩增异淀 粉酶基因，从曲霉(Aspergillus)基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因，从栖热菌(Thermus) 基因组中扩增木糖异构酶基因。
2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。
3.构建如附图1的毕赤酵母表达载体、附图2的酿酒酵母表达载体和附图3的枯草芽孢杆菌 表达载体。
4.应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基 因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母； 应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因 表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。分别筛选高表达异淀粉酶、葡萄糖淀 粉酶和木糖异构酶的毕赤酵母重组子、酿酒酵母重组子和枯草芽孢杆菌重组子作为含异淀粉 酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽 孢杆菌工程菌。
5.分别发酵含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框 架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉生成果葡糖浆的 酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。
本发明构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表 达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产异淀粉酶、葡萄糖淀 粉酶和木糖异构酶的优点体现于：
(1)针对异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有协同水解淀粉生成果葡糖浆的特性，即 异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成葡萄糖的酶系，而市场上需求这种酶 系产品。本发明通过构建工程菌，应用工程菌生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖 异构酶，一方面提供混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的新产品，另一方面取代分别 发酵含异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶，发酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生产葡萄糖淀粉 酶，发酵含木糖异构酶基因的菌株生产木糖异构酶。即用一个发酵工序生产整个水解淀粉生 成果葡糖浆的酶系取代用多个工序分别生产水解淀粉生成果葡糖浆的三种酶。达到节省了原 材料、能耗和人力资源的作用。
(2)毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含 异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母 工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，为其重组酶生产提供多种宿主选择。
附图说明
附图1.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 毕赤酵母表达载体
P.毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.α因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉酶基 因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418. 抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性 基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；P.pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。
附图2.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 酿酒酵母表达载体
P.酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.α因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉酶基 因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418. 抗性基因(应用于筛选酿酒酵母重组子)；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性 基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；S.cerevisiae rDNA.酿酒酵母的rDNA序列。
附图3.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 枯草芽孢杆菌表达载体
P.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.α因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉 酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列； G418.抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青 霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B.subtilis rDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA 序列。
具体实施方式
下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1.1构建毕赤酵母表达载体
1.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列、多克隆接头和大肠杆菌 复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连 接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPG
1.1.2获取基因
①PCR扩增假单胞杆菌(Pseudomonas)的异淀粉酶基因
引物1：5’CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下 划线的6个碱基)]
引物2：5’CAGCGGCCGCCTACTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’[说明：5’ 的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编 码6个组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取假单胞杆菌的基因组DNA，以基因组DNA 为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②反转录PCR扩增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽)
引物1：
5’CCGGATCCATGTCGTTCCGATCTCTTCT 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下 划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCAGTCACCGTCGCGGT 3’[说明：5’的 10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6 个组氨酸的DNA序列。]
应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引 物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证 明是曲霉的含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。
③PCR扩增栖热菌的木糖异构酶基因
引物1：
5’GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA 限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCTTACCCCCGCACCCCCAGGAGGTACTCCACC3’[说明：5’的10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个 组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA，以基因组DNA为 模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。
1.1.3分别构建异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达 框架。
①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
引物1：
5’CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG 3’
引物2：
5’GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTC 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有 下划线的6个碱基)]
提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物 经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。 [说明：毕赤酵母基因组DNA提取方法：将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用 1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基 因组DNA。]
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个 碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGA AAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2 个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱 基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列
引物1：
5’CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3’
引物2：
引物2：5’CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有 下划线的6个碱基)]
提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的 PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。
⑥表达框架构建过程：
A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pPG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPG载体的多克 隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于pPG载体 的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPG载体的多克隆 位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPG1。
B.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pPG载体的多克隆位点；将包含信号肽的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列重 组于pPG载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pPG载体 的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为pPG2。 C.含栖热菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pPG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPG载体的多克 隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将栖热菌的木糖异构酶基因序列重组于pPG载体的 多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pPG载体的多克隆位点， 并使其位于信号肽序列的下游。此含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为pPG3。
⑦完成表达载体的构建
A.将表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pPG2和pPG3载体的表达框架， 并将以上的这两套表达框架依次插入于pPG1的多克隆位点。此载体称为pPG123.
B.通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序 列)和G418基因重组于pPG123载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖 淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图1)。
1.2构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架 的毕赤酵母工程菌
用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，将经过电转化作用的毕赤酵母涂布于 G418-YPD(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉，终浓度为700μg/ml的G418) 平板，在30℃培养3天后生长出菌落(重组子)。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分 别用以上所述的异淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因的特异引物，以重组子 基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR 产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因已经重组于重 组子的基因组。将生长于G418抗性平板的并经过用基因特异引物进行PCR验证的重组子分别 在30℃进行摇瓶发酵2天，用常规方法测定发酵液的异淀粉酶活性、葡萄糖淀粉酶活性和木 糖异构酶活性，根据酶活性测定，筛选高表达以上所述的三种酶的重组子作为含异淀粉酶基 因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。
1.3生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶
将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 毕赤酵母工程菌接种于YPD液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中发酵2天， 离心取上清。用常规的His标签亲和纯化方法纯化发酵液中的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木 糖异构酶。将纯化获得的重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶应用于水解木薯淀 粉生成果葡糖浆试验，获得果葡糖浆，证明以上生产的混合酶具有水解淀粉生产果葡糖浆的 功能。
说明.制备果葡糖浆的方法按照常规的酶法水解淀粉生产果葡糖浆的基本方法，但用的酶 是用以上所述的含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表 达框架的毕赤酵母工程菌生产的重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶。
实施例2：
2.1构建酿酒酵母表达载体
2.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆 菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA 连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pSG。
2.1.2获取基因
①PCR扩增假单胞杆菌(Pseudomonas)的异淀粉酶基因
引物1：5’CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下 划线的6个碱基)]
引物2：5’CAGCGGCCGCCTACTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’[说明：5’ 的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编 码6个组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取假单胞杆菌的基因组DNA，以基因组DNA 为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②反转录PCR扩增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽)
引物1：
5’CCGGATCCATGTCGTTCCGATCTCTTCT 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下 划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCAGTCACCGTCGCGGT 3’[说明：5’的 10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6 个组氨酸的DNA序列。]
应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引 物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证 明是曲霉的含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。
③PCR扩增栖热菌的木糖异构酶基因
引物1：
5’GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA 限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCTTACCCCCGCACCCCCAGGAGGTACTCCACC3’[说明：5’的10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个 组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA，以基因组DNA为 模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。
2.1.3分别构建异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达 框架。
①用PCR扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
引物1：
5’CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线 的6个碱基)]
引物2：
5’GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线 的6个碱基)]
提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增， PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启 动子序列。
[说明：酿酒酵母基因组DNA提取方法：将酿酒酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用 1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基 因组DNA。]
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个 碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2 个碱基)和酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱 基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
⑤从酿酒酵母基因组中PCR扩增rDNA序列
引物1：
5’CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3’
引物2：
5’CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下 划线的6个碱基)]
提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的 PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酿酒酵母基因组中的rDNA序列。
⑥表达框架构建过程：
A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pSG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pSG载体的多克 隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于pSG载体 的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pSG载体的多克隆 位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因表达框架的载体称为pSG1。
B.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pSG载体的多克隆位点；将包含信号肽的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列重 组于pSG载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pSG载体 的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为pSG2。
C.含栖热菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子DNA序列重组于pSG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pSG载体的多克 隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将栖热菌的木糖异构酶基因序列重组于pSG载体的 多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pSG载体的多克隆位点， 并使其位于信号肽序列的下游。此含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为pSG3。
⑦完成表达载体的构建
A.将表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切取pSG2和pSG3载体的表达框架， 并将以上的这两套表达框架依次插入于pSG1的多克隆位点。此载体称为pSG123.
B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将酿酒酵母的rDNA序列(DNA重组序 列)和G418基因重组于pSG123载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因基因表达框架、葡 萄糖淀粉酶基因基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体(附图2)。
2.2构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架 的酿酒酵母工程菌
用电转化方法将含异淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因表达框架的酿酒 酵母表达载体转化酿酒酵母，将经过电转化作用的酿酒酵母涂布于G418-YPD(2％蛋白胨，1％ 酵母提取物，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉，终浓度为700μg/ml的G418)平板，在30℃培养3天 后生长出菌落(重组子)。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用以上所述的异淀粉酶 基因、葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行 PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其 异淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因已经重组于重组子的基因组。将生长于 G418抗性平板的并经过用基因特异引物进行PCR验证的重组子分别在30℃进行摇瓶发酵2 天，用常规方法测定发酵液的异淀粉酶活性、葡萄糖淀粉酶活性和木糖异构酶活性，根据酶 活性测定，筛选高表达以上所述的三种酶的重组子作为含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀 粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌。
2.3生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶
将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 酿酒酵母工程菌接种于接种于固态发酵培养基(在每1000克中分别含玉米粉44克，豆粕2.5 克，谷壳2.5克，水51克)中发酵3天，离心取上清。用常规的His标签亲和纯化方法纯化 发酵液中的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶。将纯化获得得的重组混合异淀粉酶、葡 萄糖淀粉酶和木糖异构酶应用于水解木薯淀粉生成果葡糖浆试验，获得果葡糖浆，证明以上 生产的混合酶具有水解淀粉生产果葡糖浆的功能。
说明.制备果葡糖浆的方法按照常规的酶法水解淀粉生产果葡糖浆的基本方法，但用的酶 是用以上所述的含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表 达框架的酿酒酵母工程菌生产的重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶。
实施例3：
3.1构建枯草芽孢杆菌表达载体
3.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列、多克隆接头和大肠杆菌 复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连 接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pBG
3.1.2获取基因
①PCR扩增假单胞杆菌(Pseudomonas)的异淀粉酶基因
引物1：5’CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下 划线的6个碱基)]
引物2：5’CAGCGGCCGCCTACTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’[说明：5’ 的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编 码6个组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取假单胞杆菌的基因组DNA，以基因组DNA 为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②反转录PCR扩增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽)
引物1：
5’CCGGATCCATGTCGTTCCGATCTCTTCT 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下 划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCAGTCACCGTCGCGGT 3’[说明：5’的 10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6 个组氨酸的DNA序列。]
应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引 物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证 明是曲霉的含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。
③PCR扩增栖热菌的木糖异构酶基因
引物1：
5’GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA 限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCTTACCCCCGCACCCCCAGGAGGTACTCCACC3’[说明：5’的10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个 组氨酸的DNA序列。]
应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA，以基因组DNA为 模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。
3.1.3分别构建异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达 框架。
①用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列
引物1：
5’CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3’
引物2：
5’GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线 的6个碱基)]
提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA[巨大枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法：将枯草芽孢杆 菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L的山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟， 然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]，以巨大芽孢杆菌的基因组DNA 为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软 件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是 酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是巨大芽 孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]：
CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCC GCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAAC ACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGAT ACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCG ATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAG GCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCC GCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCA AGGAGGAAATACCCGCATGCCC
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个 碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2 个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱 基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
⑤用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列
引物1.
5’CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3’
引物2.
5’CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3’
[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的 6个碱基)]。
提取枯草芽孢杆菌基因组DNA(基因组DNA提取方法同以上所述的巨大枯草芽孢杆菌的基 因组DNA提取方法)，以基因组DNA为模板应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序 列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。
⑥表达框架构建过程：
A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶 启动子DNA序列重组于pBG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBG载体的 多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于pBG 载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pBG载体的多 克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因表达框架的载体称为pBG1。
B.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶 启动子DNA序列重组于pBG载体的多克隆位点；将包含信号肽的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序 列重组于pBG载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pBG 载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为 pBG2。
C.含栖热菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶 启动子DNA序列重组于pBG载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBG载体的 多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将栖热菌的木糖异构酶基因序列重组于pBG载 体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pBG载体的多克隆位 点，并使其位于信号肽序列的下游。此含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为pBG3。
⑦完成表达载体的构建
A.将表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切取pBG2和pBG3载体的表达框架， 并将以上的这两套表达框架依次插入于pBG1的多克隆位点。此载体称为pBG123.
B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将枯草芽孢杆菌的rDNA序列(DNA重 组序列)和G418基因重组于pBG123载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因表达框架、葡 萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图3)。
3.2构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架 的枯草芽孢杆菌工程菌
用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌，将经过电转化作用的枯草芽孢杆菌 涂布于G418-LB[(每100毫升LB固体培养基的配置：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯 化钠，1.5％琼脂粉，加水至100毫升，高压灭菌)；在溶解的LB固体培养基(温度45-50℃) 中加入终浓度为700μg/ml的G418，混匀后倒入平板中]平板，在37℃培养2天后生长出菌落 (重组子)。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用以上所述的异淀粉酶基因、葡萄糖 淀粉酶基因和木糖异构酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重 组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、 葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因已经重组于重组子的基因组。将生长于G418抗性平板的 并经过用基因特异引物进行PCR验证的重组子分别在固态发酵培养基(稻草粉150克，玉米 粉250克、葡萄糖50克、胰蛋白胨20克、NH4NO315克、KH2PO410克、H2O 500克)37℃ 培养2天，用常规方法测定发酵液的异淀粉酶活性、葡萄糖淀粉酶活性和木糖异构酶活性， 根据酶活性测定，筛选高表达以上所述的三种酶的重组子作为含异淀粉酶基因表达框架、葡 萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。 3.3生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶
将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 枯草芽孢杆菌工程菌接种于固态发酵培养基(稻草粉150克，玉米粉250克、葡萄糖50克、 胰蛋白胨20克、NH4NO315克、KH2PO410克、H2O 500克)37℃培养2天，离心取上清。 用常规的His标签亲和纯化方法纯化发酵液中的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶。将 纯化获得的重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶应用于水解木薯淀粉生成果葡糖 浆试验，获得果葡糖浆，证明以上生产的混合酶具有水解淀粉生产果葡糖浆的功能。
说明.制备果葡糖浆的方法按照常规的酶法水解淀粉生产果葡糖浆的基本方法，但用的酶 是用以上所述的含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表 达框架的枯草芽孢杆菌工程菌生产的重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶。