一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102747062 A (43)申请公布日 2012.10.24 CN 102747062 A *CN102747062A* (21)申请号 201210251837.4 (22)申请日 2012.07.09 C12N 9/90(2006.01) C12N 9/44(2006.01) C12N 9/34(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/75(2006.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/66(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/84(2006.01) C12R 1/86

2、5(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 中国热带农业科学院热带生物技术 研究所 地址 571101 海南省海口市学院路 4 号中国 热带农业科学院热带生物技术研究所 (72)发明人 张爱联 罗进贤 张添元 尹慧祥 符仙 (54) 发明名称 一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种生产水解淀粉生成果葡糖 浆的酶系的方法。属生物技术领域。首先分别克 隆假单胞杆菌的异淀粉酶基因、 曲霉的葡萄糖淀 粉酶基因和栖热菌木糖异构酶基因 ； 构建含上述 三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体、 酿酒酵 母将表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，

3、并将载 体转化相应的宿主菌而获得工程菌。发酵毕赤酵 母工程菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程 菌生产重组混合异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖 异构酶 ( 水解淀粉生成果葡糖浆的酶系 )。本发 明用一道工序同时生产水解淀粉生成果葡糖浆的 酶系， 解决分别生产这三种酶的成本高而制约酶 法生产果葡糖浆产业发展的问题， 为市场提供上 述酶系新产品， 有利于加速酶法生产果葡糖浆产 业的发展。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 15 页 序列表 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 15 页 序列表 9 页 附图

4、2 页 1/1 页 2 1. 一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法， 其特征在于， 其具体步骤如下 ： 1)、 应用分子生物学技术克隆假单胞杆菌的异淀粉酶基因、 曲霉的葡萄糖淀粉酶基因 和栖热菌的木糖异构酶基因 ； 2)、 分别构建含上述基因的表达框架的毕赤酵母表达载体、 酿酒酵母表达载体和枯草 芽孢杆菌表达载体 ； 3)、 将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母获得毕赤酵母重组子， 将上述构建 的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母获得酿酒酵母重组子， 将上述构建的枯草芽孢杆菌表达 载体转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组子 ； 4)、 筛选高表达以上所述的异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶

5、的毕赤酵母重组子 作为含假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、 曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌 的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌， 筛选高表达以上所述的异淀粉酶、 葡萄糖 淀粉酶和木糖异构酶的酿酒酵母重组子作为含假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、 曲霉 的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母工程， 筛选 高表达以上所述的异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含假 单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、 曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌的木糖异 构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程 ； 5)、 分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌、 酿酒

6、酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生 产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系 ( 异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶 )。 2. 根据权利要求 1 所述一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法， 其特征在于 ： 利用权利要求 1 所述的生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法制备水解淀粉生成果葡 糖浆的酶系 ( 异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶 ) 产品。 权 利 要 求 书 CN 102747062 A 2 1/15 页 3 一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生 物工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系。 背景

7、技术 0002 果葡糖浆是一种新型甜味剂。果葡糖浆的甜度最高， 相当于蔗糖 1.8 倍， 并且果葡 糖浆具有类似蜜糖的风味和不易引起血糖升高的性能。 当前， 国内外需求量大， 主要应用于 食品领域的饮料、 面包、 奶制品、 罐头、 果糖和其它食品。淀粉是制备果葡糖浆的主要是原 料。 0003 用不甜的淀粉为原料转变成具有甜味的葡萄糖， 再通过异构化反应转变葡萄糖生 成果糖， 生产果葡糖浆 ( 果糖和葡萄糖的混合物 )。 0004 淀粉由直链和支链组成。支链由 -1， 6 糖苷键连接， 而直链的糖分子之间由 -1， 4 糖苷键连接。在天然的淀粉质原料中， 支链淀粉的含量约占 70 95， 而直链

8、 淀粉的含量 30。异淀粉酶 (Isoamylase， E.C.3.2.1.68) 能专一性地分解支链淀粉中 分支点的 -1， 6 糖苷键， 将支链淀粉转化为直链淀粉， 因此又称为脱支酶。葡萄糖淀粉酶 (Glucoamylase， E.C.3.2.1.3)， 简称糖化酶。 葡萄糖淀粉酶能催化直链淀粉水解为葡萄糖。 在异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的联合作用下， 淀粉水解生成葡萄糖。木糖异构酶具有异构葡 萄糖为果糖的功能。酶法生产果葡糖浆是果葡糖浆生产的主要途径。当前， 酶法生产果葡 糖浆的方法是先生产异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶， 通过异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用， 将 淀粉水解生成葡萄糖 ； 然后， 再用

9、木糖异构酶异构葡萄糖为果糖， 生产果糖与葡萄糖混合的 果葡糖浆。这些酶的分别生产需要大量的人力和能耗。 0005 当前市面上只有这些酶的单种酶， 尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。 毕赤酵母 (Pichia pastoris)、 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌， 但各具有特征。 毕赤酵母的主要 特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点， 枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼 性需氧的特性， 适合于固态厌氧发酵生产重组酶。 发明内容 0006 本发明根据异淀粉酶和葡萄糖淀粉

10、酶和木糖异构酶具有联合水解淀粉生成果葡 糖浆的作用 ( 即异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成果葡糖浆的酶 系 )， 市场上还没有异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的水解淀粉生成果葡糖浆的酶系 产品 ； 毕赤酵母、 酿酒酵母和枯草芽孢杆菌是常用于表达外源蛋白的宿主菌， 而通过分子生 物学技术构建含异淀粉酶基因表达框架 ( 说明 . 表达框架 ： 启动子 - 信号肽 - 基因 - 转录 终止子 )、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、 酿酒 酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。用含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达 框架和木糖异构酶基因表达框架

11、的毕赤酵母工程菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程 说 明 书 CN 102747062 A 3 2/15 页 4 菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系 ( 异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶 )。 0007 本发明所采用的技术方案是 ： 0008 1. 克隆酶基因 ： 应用分子生物学技术， 从假单胞杆菌 (pseudomonas) 基因组中 扩增异淀粉酶基因， 从曲霉 (Aspergillus) 基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因， 从栖热菌 (Thermus) 基因组中扩增木糖异构酶基因。 0009 2. 获得构建表达载体所需的启动子， 重组序列， 信号肽， 转录终止子序列和抗性基 因。 0010

12、 3. 构建如附图 1 的毕赤酵母表达载体、 附图 2 的酿酒酵母表达载体和附图 3 的枯 草芽孢杆菌表达载体。 0011 4. 应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架、 木 糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母 ； 应用电转化方法将含异淀粉 酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架、 木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达 载体转化酿酒酵母 ； 应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达 框架、 木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。分别筛选高 表达异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的毕赤酵母重组子、 酿

13、酒酵母重组子和枯草芽 孢杆菌重组子作为含异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程 菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。 0012 5. 分别发酵含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶 基因表达框架的毕赤酵母工程菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉生 成果葡糖浆的酶系 ( 异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶 )。 0013 本发明构建含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶 基因表达框架的毕赤酵母工程菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的优点体现于 ： 0014

14、 (1) 针对异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有协同水解淀粉生成果葡糖浆 的特性， 即异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成葡萄糖的酶系， 而市场上 需求这种酶系产品。 本发明通过构建工程菌， 应用工程菌生产重组混合异淀粉酶、 葡萄糖淀 粉酶和木糖异构酶， 一方面提供混合异淀粉酶、 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的新产品， 另一方 面取代分别发酵含异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶， 发酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生 产葡萄糖淀粉酶， 发酵含木糖异构酶基因的菌株生产木糖异构酶。即用一个发酵工序生产 整个水解淀粉生成果葡糖浆的酶系取代用多个工序分别生产水解淀粉生成果葡糖浆的三 种酶。达到节省了

15、原材料、 能耗和人力资源的作用。 0015 (2) 毕赤酵母、 酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在生产重组蛋白方面各具特征， 本发明分 别构建含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架 的毕赤酵母工程菌、 酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌， 为其重组酶生产提供多种宿 主选择。 附图说明 0016 附图 1. 含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的毕赤酵母表达载体 说 明 书 CN 102747062 A 4 3/15 页 5 0017 P. 毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 ； S. 因子信号肽 ； iso. 假单胞杆菌 的异淀

16、粉酶基因 ； gai. 曲霉的葡萄糖淀粉酶基因 ； xi. 栖热菌的木糖异构酶基因 ； T. 转录 终止子序列 ； G418. 抗性基因 ( 应用于筛选毕赤酵母重组子 ) ； ColE1. 大肠杆菌复制起点 ； AMP. 氨苄青霉素抗性基因 ( 应用于筛选大肠杆菌转化子 ) ； P.pastoris rDNA. 毕赤酵母的 rDNA 序列。 0018 附图 2. 含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的酿酒酵母表达载体 0019 P. 酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 ； S. 因子信号肽 ； iso. 假单胞杆菌 的异淀粉酶基因 ； gai. 曲霉的葡

17、萄糖淀粉酶基因 ； xi. 栖热菌的木糖异构酶基因 ； T. 转录 终止子序列 ； G418. 抗性基因 ( 应用于筛选酿酒酵母重组子 ) ； ColE1. 大肠杆菌复制起点 ； AMP. 氨苄青霉素抗性基因 ( 应用于筛选大肠杆菌转化子 ) ； S.cerevisiae rDNA. 酿酒酵母 的 rDNA 序列。 0020 附图 3. 含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体 0021 P.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 ； S.因子信号肽 ； iso.假单胞杆 菌的异淀粉酶基因 ； gai. 曲霉的葡萄糖淀粉酶基因 ； xi

18、. 栖热菌的木糖异构酶基因 ； T. 转 录终止子序列 ； G418.抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子) ； ColE1.大肠杆菌复制 起点 ； AMP. 氨苄青霉素抗性基因 ( 应用于筛选大肠杆菌转化子 ) ； B.subtilis rDNA. 枯草 芽孢杆菌的 rDNA 序列。 具体实施方式 0022 下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。 0023 实施例 1 ： 0024 1.1 构建毕赤酵母表达载体 0025 1.1.1 构建克隆载体 0026 由专业的 DNA 序列合成公司合成含氨苄青霉素 (AMP) 基因序列、 多克隆接头和大 肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链， 并且

19、在每条 DNA 链序列的两端形成粘性末端。通 过 DNA 连接酶的作用使其环化， 形成 DNA 克隆载体。将其克隆载体命名为 pPG 0027 1.1.2 获取基因 0028 PCR 扩增假单胞杆菌 (Pseudomonas) 的异淀粉酶基因 0029 引物 1 ： 5 CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3 0030 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 有下划线的 6 个碱基 ) 0031 引物2：5 C A G C G G C C G C C T A CTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGAT

20、TG3 说明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个碱基是编码 6 个组氨酸的 DNA 序列。 0032 应用常规的细菌基因组 DNA 提取的方法提取假单胞杆菌的基因组 DNA， 以基因组 DNA为模板， 应用引物1和引物2进行PCR扩增， PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。 说 明 书 CN 102747062 A 5 4/15 页 6 0033 反转录 PCR 扩增曲霉 (Aspergillus) 的葡萄糖淀粉酶基因 ( 包括信号肽 ) 0034 引物 1

21、： 0035 5 CCGGATCCATGTCGTTCCGATCTCTTCT 3 0036 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 其中有下划线的 6 个碱基是酶识别位点 ) 0037 引物 2 ： 0038 5 CAGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCAGTCACCGTCGCGGT 3 说 明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个 碱基是编码 6 个组氨酸的 DNA 序列。 0039 应用真菌 RNA 提取试剂盒提取曲霉的总 RNA， 应用

22、cDNA 合成试剂盒合成其 cDNA， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增， 获得的 PCR 产物经序列分析和用 NCBI 提供的 BLAST 软 件分析证明是曲霉的含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。 0040 PCR 扩增栖热菌的木糖异构酶基因 0041 引物 1 ： 0042 5 GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3 说明 ： 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶识别位点 ( 其中有下划线的 6 个碱基是酶识别位点 ) 0043 引物 2 ： 0044 5 CAGCGGCCGCTTACCCCCGCACCCCCAGGAGG

23、TACTCCACC3 说 明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个 碱基是编码 6 个组氨酸的 DNA 序列。 0045 应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA， 以基因组DNA为 模板， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增， PCR 产物经序列测定和用 NCBI 提供的 BLAST 软 件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。 0046 1.1.3 分别构建异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构 酶基因表达框架。 0047 用 PCR 扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶

24、启动子序列。 0048 引物 1 ： 0049 5 CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG 3 0050 引物 2 ： 0051 5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTC 3 0052 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 其中有下划线的 6 个碱基 ) 0053 提取毕赤酵母基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩 增， PCR 产物经序列测定和用 NCBI 提供的 BLAST 软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基 因的启动

25、子序列。 说明 ： 毕赤酵母基因组 DNA 提取方法 ： 将毕赤酵母细胞加于 9mg/ml 的 蜗牛酶溶液 ( 蜗牛酶用 1mol/L 山梨醇溶解 ) 于 30振摇 30 分钟， 然后按照常规的细菌基 因组 DNA 提取方法提取其基因组 DNA。 0054 由专业的 DNA 序列合成公司合成 因子信号肽 如下序列有下划线的是酶切 说 明 书 CN 102747062 A 6 5/15 页 7 保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶识别位点 (6 个碱基 )， 没有下划线的是 因子 信号肽序列 ： 0055 CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGT

26、TTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGG GATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAG CATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGA AAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC 0056 由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列如下序列有下划线的是酶切 保护碱基(2

27、个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)， 没有下划线的是转录终止 子序列 ： 0057 GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAG ATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAA CCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC TGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTT

28、TGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTC AGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC 0058 ： 用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列如下序列有下划线的是酶切保护 碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶识别位点 (6 个碱基 )， 没有下划线的是 G418 抗性基 因序列 0059 GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGG ATTATCAATACCATATTT

29、TTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGG CAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATA AGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCA GACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATT GCGCCT

30、GAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGG AACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGG GATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCG TCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACA

31、ACTCT GGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCC ATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTAC CGG 0060 从毕赤酵母基因组中 PCR 扩增 rDNA 序列 0061 引物 1 ： 0062 5 CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3 0063 引物 2 ： 0064 引物 2 ： 5 CCTTCGAAag

32、ccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3 0065 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 有下划线的 6 个碱基 ) 0066 提取毕赤酵母基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩 增， 获得的 PCR 产物经序列分析和用 NCBI 提供的 BLAST 软件分析证明是毕赤酵母基因组中 的 rDNA 序列。 说 明 书 CN 102747062 A 7 6/15 页 8 0067 表达框架构建过程 ： 0068 A. 含异淀粉酶基因的表达框架的构

33、建 ： 0069 通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用， 将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢 酶启动子 DNA 序列重组于 pPG 载体的多克隆位点 ； 将 因子信号肽 DNA 序列重组于 pPG 载 体的多克隆位点， 并使其位于启动子序列的下游 ； 将假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组 于pPG载体的多克隆位点， 并使其位于信号肽序列的下游 ； 将转录终止子序列重组于pPG载 体的多克隆位点， 并使其位于基因序列下游。 此含异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPG1。 0070 B. 含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建 0071 通过 DNA 限制性内切酶和 T4DNA 连接酶的作用， 将毕赤

34、酵母的三磷酸甘油醛脱氢 酶启动子 DNA 序列重组于 pPG 载体的多克隆位点 ； 将包含信号肽的曲霉的葡萄糖淀粉酶基 因序列重组于 pPG 载体的多克隆位点， 并使其位于启动子的下游 ； 将转录终止子序列重组 于 pPG 载体的多克隆位点， 并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的 载体称为 pPG2。C. 含栖热菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建 0072 通过 DNA 限制性内切酶和 T4DNA 连接酶的作用， 将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢 酶启动子 DNA 序列重组于 pPG 载体的多克隆位点 ； 将 因子信号肽 DNA 序列重组于 pPG 载 体的多克隆位点， 并使其位

35、于启动子序列的下游 ； 将栖热菌的木糖异构酶基因序列重组于 pPG 载体的多克隆位点， 并使其位于启动子的下游 ； 将转录终止子序列重组于 pPG 载体的多 克隆位点， 并使其位于信号肽序列的下游。此含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的载体 称为 pPG3。 0073 完成表达载体的构建 0074 A. 将表达框架组装于同一个克隆载体。 0075 通过 DNA 限制性内切酶和 T4DNA 连接酶的作用， 分别切取 pPG2 和 pPG3 载体的表 达框架， 并将以上的这两套表达框架依次插入于 pPG1 的多克隆位点。此载体称为 pPG123. 0076 B. 通过 DNA 限制性内切酶和 T4D

36、NA 连接酶的作用依次将毕赤酵母的 rDNA 序列 (DNA 重组序列 ) 和 G418 基因重组于 pPG123 载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因表达 框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体 ( 附图 1)。 0077 1.2 构建含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基 因表达框架的毕赤酵母工程菌 0078 用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异 构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母， 将经过电转化作用的毕赤酵母涂布 于 G418-YPD(2蛋白胨， 1酵母提取物， 2葡萄糖， 1.

37、5琼脂粉， 终浓度为 700g/ml 的 G418) 平板， 在 30培养 3 天后生长出菌落 ( 重组子 )。用 PCR 方法扩增目标基因验证重组 子 ： 分别用以上所述的异淀粉酶基因、 葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因的特异引物， 以 重组子基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增 ； 重组子能扩增出目标大小的 PCR 扩增带， 并且对 其 PCR 产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、 葡萄糖淀粉酶基因和木糖异构酶基因已经 重组于重组子的基因组。将生长于 G418 抗性平板的并经过用基因特异引物进行 PCR 验证 的重组子分别在 30进行摇瓶发酵 2 天， 用常规方法测定发酵液的异淀粉

38、酶活性、 葡萄糖 淀粉酶活性和木糖异构酶活性， 根据酶活性测定， 筛选高表达以上所述的三种酶的重组子 说 明 书 CN 102747062 A 8 7/15 页 9 作为含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的 毕赤酵母工程菌。 0079 1.3 生产重组混合异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶 0080 将含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达 框架的毕赤酵母工程菌接种于YPD液体培养基(2蛋白胨， 1酵母提取物， 2葡萄糖)中 发酵 2 天， 离心取上清。用常规的 His 标签亲和纯化方法纯化发酵液中的异淀粉酶、 葡萄糖

39、淀粉酶和木糖异构酶。将纯化获得的重组混合异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶应用 于水解木薯淀粉生成果葡糖浆试验， 获得果葡糖浆， 证明以上生产的混合酶具有水解淀粉 生产果葡糖浆的功能。 0081 说明 . 制备果葡糖浆的方法按照常规的酶法水解淀粉生产果葡糖浆的基本方法， 但用的酶是用以上所述的含异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异 构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产的重组混合异淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶和木糖异构 酶。 0082 实施例 2 ： 0083 2.1 构建酿酒酵母表达载体 0084 2.1.1 构建克隆载体 0085 由专业的 DNA 序列合成公司合成含氨苄青霉

40、素 (AMP) 基因序列， 多克隆接头和大 肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链， 并且在每条 DNA 链序列的两端形成粘性末端。通 过 DNA 连接酶的作用使其环化， 形成 DNA 克隆载体。将其克隆载体命名为 pSG。 0086 2.1.2 获取基因 0087 PCR 扩增假单胞杆菌 (Pseudomonas) 的异淀粉酶基因 0088 引物 1 ： 5 CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3 0089 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 有下划线的 6 个碱基 ) 0090 引物2：5 C A G C

41、 G G C C G C C T A CTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3 说明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个碱基是编码 6 个组氨酸的 DNA 序列。 0091 应用常规的细菌基因组 DNA 提取的方法提取假单胞杆菌的基因组 DNA， 以基因组 DNA为模板， 应用引物1和引物2进行PCR扩增， PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST 软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。 0092 反转录 PCR 扩增曲霉 (Aspergillus) 的葡萄糖淀粉酶基因 ( 包括信号肽

42、) 0093 引物 1 ： 0094 5 CCGGATCCATGTCGTTCCGATCTCTTCT 3 0095 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 其中有下划线的 6 个碱基是酶识别位点 ) 0096 引物 2 ： 0097 5 CAGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCAGTCACCGTCGCGGT 3 说 明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个 说 明 书 CN 102747062 A 9 8/15 页 10 碱基是编码 6 个组氨

43、酸的 DNA 序列。 0098 应用真菌 RNA 提取试剂盒提取曲霉的总 RNA， 应用 cDNA 合成试剂盒合成其 cDNA， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增， 获得的 PCR 产物经序列分析和用 NCBI 提供的 BLAST 软 件分析证明是曲霉的含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。 0099 PCR 扩增栖热菌的木糖异构酶基因 0100 引物 1 ： 0101 5 GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3 说明 ： 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶识别位点 ( 其中有下划线的 6 个碱基是酶识别位点 ) 0102 引

44、物 2 ： 0103 5 CAGCGGCCGCTTACCCCCGCACCCCCAGGAGGTACTCCACC3 说 明 ： 5 的 10 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和酶识别位点 (8 个碱基 )， 方框中的 18 个 碱基是编码 6 个组氨酸的 DNA 序列。 0104 应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA， 以基因组DNA为 模板， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增， PCR 产物经序列测定和用 NCBI 提供的 BLAST 软 件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。 0105 2.1.3 分别构建异淀粉酶基因表达框架、 葡萄糖淀粉酶基因表

45、达框架和木糖异构 酶基因表达框架。 0106 用 PCR 扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。 0107 引物 1 ： 0108 5 CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3 0109 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 有下划线的 6 个碱基 ) 0110 引物 2 ： 0111 5 GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3 0112 说明 ： 引物 5 端的 8 个碱基是酶切保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶 识别位点 ( 有下划线的 6 个碱基 )

46、0113 提取酿酒酵母基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板， 应用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩 增， PCR 产物经序列测定和用 NCBI 提供的 BLAST 软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基 因的启动子序列。 0114 说明 ： 酿酒酵母基因组 DNA 提取方法 ： 将酿酒酵母细胞加于 9mg/ml 的蜗牛酶溶 液 ( 蜗牛酶用 1mol/L 山梨醇溶解 ) 于 30振摇 30 分钟， 然后按照常规的细菌基因组 DNA 提取方法提取其基因组 DNA。 0115 由专业的 DNA 序列合成公司合成 因子信号肽 如下序列有下划线的是酶切 保护碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA

47、 限制性内切酶识别位点 (6 个碱基 )， 没有下划线的是 因子 信号肽序列 ： 0116 CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGG GATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAG CATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCT

48、CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC 说 明 书 CN 102747062 A 10 9/15 页 11 0117 由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列如下序列有下划线的是酶切 保护碱基 (2 个碱基 ) 和酶识别位点 (6 个碱基 )， 没有下划线的是转录终止子序列 ： 0118 GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAG ATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTT

49、TTATTTGTAA CCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC TGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTC AGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC 0119 ： 用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列如下序列有下划线的是酶切保护 碱基 (2 个碱基 ) 和 DNA 限制性内切酶识别位点 (6 个碱基 )， 没有下划线的是 G418 抗性基 因序列 0120 GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGG ATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGG CAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAAT