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1、(10)申请公布号 CN 102757907 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757907 A *CN102757907A* (21)申请号 201210106224.1 (22)申请日 2012.04.12 CGMCC No.5839 2012.03.02 201210088647.5 2012.03.30 CN C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安市环城北路 88 号浙江农林大学 (72)发明人 虞方伯 管莉菠 骆林平 单。
2、胜道 刘畅 龙珍 杨萍 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 林宝堂 (54) 发明名称 一株硫丹降解菌及其在土壤修复方面的应用 (57) 摘要 本发明公开了一株硫丹降解菌及其土壤修复 应用。本发明所提供的硫丹降解菌是嗜根寡养 单胞菌 （Stenotrophomonasrhizophila）的菌株 LD-6， 于 2012 年 3 月 2 日在中国普通微生物菌 种保藏管理中心保藏， 编号为 CGMCC No.5839， 该 菌可在好养条件下， 10 日内实现对 100mg/L 硫丹 的完全降解， 且降解产物低毒或无毒、 环境降解快 速 ； 菌株 LD-6 对常。
3、用抗生素四环素和卡那霉素敏 感， 对 13 种供试重金属呈现耐受性， 且对能够抑 制若干植物病原菌生长 ； 具备在实际土壤环境下 高效降解硫丹的能力， 能够显著缩短硫丹降解时 长， 具备实际应用意义和价值。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一株硫丹降解菌， 该菌是嗜根寡养单胞菌 （Stenotrophomonas rhizophila）的 菌株 LD-6， 于 2012 年 3。
4、 月 2 日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏， 编号为 CGMCC No.5839， 该菌具有降解硫丹的能力。 2. 权利要求 1 所述硫丹降解菌在受硫丹污染土壤修复中的应用。 3. 权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 将所述菌株 CGMCC No.5839 接种至含硫丹 50-100 mg/L的基础无机盐液体培养基中， 120 r/min震荡培养48 h以上， 所述的基础无机 盐液体培养基成份为 （g/L） ： MgCl2 0.2， NH4NO3 1， KH2PO4 2， K2HPO4 7.5， NaCl 1， 硫丹 0.1， 去离子水 1 L。 4. 权利要求 3 所述的应用，。
5、 其特征在于 ： 所述的液体培养温度为 25-30， 基础无机盐 液体培养基的 pH 为 5.4-6.8。 5. 权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的液体培养温度为 30。 6. 权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 ： 将所述菌株 CGMCC No.5839 接种至发酵培养 基中 30恒温培养 24 小时以上， 得到菌体发酵液， 对受硫丹污染的土壤喷施菌体发酵液进 行降解 ； 发酵培养基的成份为 （g/L） ： 玉米粉 10 g/L， 豆粕粉 8 g/L， (NH4)2SO4 6 g/L， 玉米 浆 6 g/L， MgSO47H2O 1 g/L， K2HPO43H2O 2 g。
6、/L， MnSO4 0.05 g/L， pH 7.2。 权 利 要 求 书 CN 102757907 A 2 1/6 页 3 一株硫丹降解菌及其在土壤修复方面的应用 技术领域 0001 本发明属于环境污染物生物处理技术领域， 具体涉及一株高效降解硫丹的细菌及 其在土壤环境污染修复中的应用。 背景技术 0002 农药作为一种重要的农业生产资料， 在保护农业生产、 提高农业综合生产能力、 促 进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国， 也是使用大国， 年使用量和平均用量分别约为 120 万吨和 2.34 kg/ha， 位列世界第一。然 而， 农药的利用率却仅为 。
7、10-20%， 其余部分全部进入土壤、 水体和大气， 造成了严重的污染。 据统计， 全国受农药残留污染的农田约有 1300-1600 万公顷， 占可耕面积的 10% ； 近半数蔬 菜农药残留超标， 每年因农残超标问题蒙受出口损失近 80 亿美元。 0003 我国自 20 世纪 50 年代开始发展有机氯农药， 主要包括六六六、 艾氏剂、 狄氏剂、 氯丹和七氯等产品， 它们曾在工农业生产中发挥重大作用。但由于这类化合物在食物链中 有着极强的富集作用， 是重要的环境类激素和持久性有机污染物， 大部分已停止生产和使 用。至今， 此类农药残留仍在不断威胁国民健康， 制约农业经济良性发展。 0004 硫 。
8、丹 （Endosulfan）由 和 b 硫 丹 组 成，商 品 名 为 赛 丹 （Thionex） 、硕 丹 （Thiodan） ， 是一种高效广谱有机氯杀虫剂， 价格相对低廉， 广泛用于茶叶、 棉花、 果树和蔬 菜等作物的虫害防治。 硫丹属高毒农药， 对动物尤其是鱼类有毒， 会损害动物的中枢神经系 统、 免疫系统、 生殖系统， 以及脑、 肝和肾等器官。硫丹残留期长， 是有机氯杀虫剂中环境残 留浓度最高的几类品种之一， 具有生物富集作用， 在土壤中的半衰期长达 6-11 个月。 0005 目前， 通过人工富集培养等技术， 已经分离出许多具有降解有机氯农药化合物能 力的细菌和真菌。其中， 细菌由。
9、于具有适应能力强、 繁殖快和降解快速等特点占据主要地 位。然而， 已分离到的具硫丹降解能力的高效降解菌仍十分有限， 绝大多数菌株无法于 10 日内实现对 100 mg/L 硫丹的完全降解， 且降解产物多为毒性更大、 残留期更长和环境危 害更大的硫丹硫酸盐 （Endosulf sulfate） 。李文等人曾报道过一株具硫丹降解能力的高 效苍白杆菌 （C7） ， 但该菌株对 50 mg/L 硫丹的降解能力在 90.2% 左右， 无法实现完全降解 （降解速率为每日 5.64 mg/L） （李文， 彭香， 张京顺， 张琛， 闫艳春。硫丹降解菌的筛选及 降解性能研究。山东农业科学， 2009,1 ： 6。
10、7-70） 。已报道降解速率最高的菌株为绿色木霉 （Trichoderma viride） H082， 该菌株能够于 7 日内高效降解 100 mg/L 硫丹， 降解率达 95% （竺利红， 吴吉安， 孙东昌， 施跃峰。硫丹降解菌 H082 的分离、 筛选和抑菌性能研究） ， 但无法 实现完全降解。此外， 菌株 H082 属丝状真菌， 与细菌菌株相比， 存在以下明显不足 ： 1） 生长 速率迟缓。细菌工业发酵一般介于 2-3 天， 而丝状真菌发酵则不少于 4 日， 多介于 6-8 日。 就一般工业发酵而言， 细菌发酵液菌体浓度可达 1-5109 CFU/mL（CFU， 菌落形成单位） ， 而 。
11、真菌固体发酵孢子数则要低一个数量级 ； 2） 发酵设备通用性差。丝状真菌发酵多采用固体 发酵床或发酵罐， 设备通用性差。细菌发酵用发酵罐除可生产菌体外还可用于次生代谢物 生产， 如抗生素、 色素和维生素等， 通用性能良好 ； 3） 菌剂施用效果相对迟缓。细菌菌剂喷 说 明 书 CN 102757907 A 3 2/6 页 4 施后， 细菌直接作用于农药残留， 而丝状真菌孢子则需待萌发、 形成菌丝后方可作用。 此外， 上述二株降解菌的硫丹代谢产物、 抗生素抗性和重金属耐受性等均尚未探明， 存在一定的 环境施用风险。 综上所述， 筛选高效、 耐受重金属、 对抗生素敏感， 且降解产物非硫丹硫酸盐 的。
12、硫丹降解细菌成为了研究热点。 发明内容 0006 本发明的目的是针对上述现有硫丹微生物对硫丹降解存在的无法于 10 日内实现 对 100 mg/L 硫丹的完全降解， 且降解产物多为毒性更大、 残留期更长和环境危害更大的硫 丹硫酸盐 （Endosulf sulfate） 的缺陷， 提供一种高效硫丹降解菌。 0007 本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复硫丹污染土壤中的应用。 0008 本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的 ： 一株硫丹降解菌， 该菌是嗜根寡养单胞菌 （Stenotrophomonas rhizophila）的菌 株 LD-6， 于 2012 年 3 月 2 日在中国。
13、微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 编号为 CGMCC No.5839， 该菌具有高效降解硫丹的能力。保藏单位的地址为北京市朝阳 区北辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所， 该菌的分类命名为嗜根寡养单胞菌 Stenotrophomonas rhizophila。 0009 一种所述硫丹降解菌在受硫丹污染土壤修复中的应用。 0010 作为优选， 将所述菌株 CGMCC No.5839 接种至含硫丹 50-100 mg/L 的基础无机盐 液体培养基中， 120 r/min 震荡培养 48h 以上， 所述的基础无机盐液体培养基成份为 （g/L） ： MgCl2 0.2， NH4。
14、NO3 1， KH2PO4 2， K2HPO4 7.5， NaCl 1， 硫丹 0.1， 去离子水 1 L。 0011 作为优选， 所述的液体培养温度为 25-30， 基础无机盐液体培养基的 pH 为 5.4-6.8。 0012 作为优选， 所述的液体培养温度为 30。 0013 作为优选， 将所述菌株CGMCC No.5839接种至发酵培养基中30恒温培养24小时 以上， 得到菌体发酵液， 对受硫丹污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解 ； 发酵培养基的成份 为 （g/L） ： 玉米粉 10 g/L， 豆粕粉 8 g/L， (NH4)2SO4 6 g/L， 玉米浆 6 g/L， MgSO47H2O。
15、 1 g/ L， K2HPO43H2O 2 g/L， MnSO4 0.05 g/L， pH 7.2。 0014 本发明所提供的硫丹降解菌Stenotrophomonas rhizophila LD-6 源自浙江桐庐 农药厂排污口附近淤泥， 经人工富集培养、 压力筛选和分离纯化得到。 该菌属嗜根寡养单胞 菌， 其系统发育地位分析如图1所示。 其生理生化特征为 ： 革兰氏染色阴性， 接触酶阳性， 氧 化酶阴性， V. P. 试验阴性， 吲哚试验阴性， 专性好养， 能够在 4生长， 但无法存活于 40， 能够以木糖为碳源， 菌体形态为短杆状， 菌落呈浅黄色、 圆形、 边缘齐整、 光滑湿润， 菌株 1。
16、6S rDNA 的 GenBank 登录号为 JQ670922， 于 2012 年 3 月 2 日在中国普通微生物菌种保藏管理 中心保藏， 编号为 CGMCC No.5839。 0015 该菌的最适生长条件为 ： pH 7.2， 温度为30。 以五分之一LB （Luria-Bertani） 或 工业发酵培养基 （玉米粉10 g/L， 豆粕粉8 g/L， (NH4)2SO4 6 g/L， 玉米浆6 g/L， MgSO4 7H2O 1 g/L， K2HPO43H2O 2 g/L， MnSO4 0.05 g/L， pH 7.2） 培养 24-36 小时后， 菌液浓度可达 5-8109 CFU/mL。。
17、 0016 该菌对四环素和卡那霉素敏感， 二者皆为常用抗生素。 可以认为 ： 当菌体被释放到 说 明 书 CN 102757907 A 4 3/6 页 5 自然环境中时， 不会因抗 （耐） 药性问题而产生超级细菌或在土著菌间传播。 0017 该菌对白色念珠菌 （Candida albicans） 、 立枯丝核菌 （Rhizoctonia solani） 、 核 盘菌 （Sclerotinia sclerotiorum） 、 黄萎病菌 （Verticillium dahliae） 、 小麦赤霉病菌 （Fusarium graminearum） 和辣椒枯萎病菌 （Fusarium oxysporu。
18、m） 呈现明显抑制作用。可 以认为 ： 菌体施用后， 能够在一定程度上起到抑制或减轻植物病害发生的作用。 0018 该菌对 13 种测试金属离子 （Li+、 Ag+、 Cu+、 Cu2+、 Hg2+、 Ba2+、 Pb2+、 Zn2+、 Mn2+、 Ni2+、 Fe2+、 Fe3+和 Co4+） 呈现不同程度的耐受性。鉴于我国土壤污染现状持久性有机污染物污染 和重金属污染并存， 农残降解菌株具备重金属耐受性能十分重要。 可以认为 ： 一般土壤环境 条件下， 该菌体施用修复效果受重金属抑制影响较小。 0019 该菌株在摇瓶降解试验中 （容积为250 mL的三角瓶， 装有100 mL液体无机盐培养。
19、 基， 硫丹浓度为100 mg/L， 摇床转速为160 r/min， 温度为30） ， 能在10天内将硫丹完全降 解 （降解速率为每天 10 mg/L） ， 代谢产物为硫丹醚和硫丹二醇， 二者毒性远小于硫丹， 且环 境降解快速。在土壤硫丹含量为 50 mg/kg 情况下， 施用该菌 28 天可使供试土样中 68.6% 的硫丹发生降解， 显著提升硫丹降解速率、 缩短降解时长， 具备实际应用意义和价值。 0020 该菌是已报道降解菌中， 唯一一株具备硫丹降解能力的嗜根寡养单胞菌。 0021 综上所述， 本发明和现有技术相比具有如下优点 ： 与现有技术相比， 本发明的Stenotrophomonas。
20、 rhizophila LD-6 是第一株具备硫丹 降解能力的嗜根寡养单胞菌， 可在好氧条件下以硫丹作为唯一碳源和硫源进行生长繁殖， 同时将其快速降解。在纯培养条件下， 它能将浓度为 100 mg/L 的硫丹在 10 天内降解完全。 与已有硫丹降解菌株相比， 该菌在具备更高硫丹降解速率 （仅次于上述绿色木霉 H082） 的同 时， 对常用抗生素敏感， 能耐受 13 种重金属， 对多种植物病原微生物存在抑制作用， 降解产 物低毒或无毒， 工业规模化发酵生产便捷、 发酵液菌体浓度高 （优于绿色木霉 H082） ， 且具备 在实际土壤环境条件下发挥硫丹降解作用的能力， 该菌株有望在硫丹污染土壤的生物。
21、环境 修复中发挥重要作用。 附图说明 0022 图 1、 菌株 LD-6 的系统发育地位分析。 0023 图 2、 菌株 LD-6 的降解能力测试， 其中 ： 硫丹 ； ： b 硫丹 ； ： 和 b 硫丹之 和。 0024 图 3、 菌株 LD-6 土壤环境中的硫丹降解情况， 其中 ： 灭活土样中 硫丹含量 （对 照） ； ： 喷施 LD-6 菌体灭活土样中 硫丹含量 ； ： 新鲜土样中 硫丹含量 （对照） ； ： 喷施 LD-6 菌体新鲜土样中 硫丹含量 ； ： 灭活土样中 b 硫丹含量 （对照） ； ： 喷施 LD-6 菌体灭活土样中 b 硫丹含量 ； ： 新鲜土样中 b 硫丹含量 （对照。
22、） ； ： 喷施 LD-6 菌体新鲜土 样中 b 硫丹含量。 具体实施方式 0025 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 应当理解， 本发 明的实施并不局限于下面的实施例， 对本发明所做的任何形式上的变通和 / 或改变都将落 入本发明保护范围。 说 明 书 CN 102757907 A 5 4/6 页 6 0026 在本发明中， 若非特指， 所有的份、 百分比均为重量单位， 所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。 0027 实施例 1 ：Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的分离与硫丹降解能力 现场采集浙江桐庐农药厂排污口附。
23、近的淤泥， 用150 mL三角瓶盛装， 并迅速带 回实验室。将取回的样品置于硫丹选择性基础无机盐液体培养基中驯化培养。培养基成份 为 （g/L） ： MgCl2 0.2， NH4NO3 1， KH2PO4 2， K2HPO4 7.5， NaCl 1， 硫丹 0.1， 去离子水 1 L， pH 6.8， 115湿热灭菌 30 分钟后备用。培养条件为 ： 28， 120 r/min 震荡培养， 容器装液量 为容器容积的 1/3。此后， 每隔 6-7 天将摇瓶静止片刻， 弃上清液， 随后补入等量的新鲜配 置的选择性液体培养基并继续震荡富集培养。四周后， 将上述培养物均匀涂布于固体选择 性基础无机盐培。
24、养基 （每升液体培养基中再加入 20 克的琼脂） 上。将涂布好的平板倒置后 放入培养箱， 28培养 72 小时。用无菌牙签挑选单菌落或用接种针划线直至出现单菌落再 行转接至新鲜配置的固体选择性平板上， 并通过气相色谱法逐一验证各菌株的硫丹降解能 力， 结果得到一株硫丹降解菌 LD-6。 0028 以 OD600值为 0.5 的接种量将菌株 LD-6 接入以 100 mg/L 硫丹为唯一碳源和硫源 的选择性基础无机盐培养基中， 30， 160 r/min震荡培养。 随后， 每隔2天对培养基中硫丹 的残留情况进行测试， 结果如图 2 所示。从中可看出菌株 LD-6 可以硫丹为唯一碳源和硫源 进行生。
25、长， 同时实现对硫丹的完全降解。 0029 本实施例说明分离得到的Stenotrophomonas rhizophila LD-6 可利用硫丹作为 唯一碳源和硫源进行生长繁殖， 并具有高效降解硫丹的能力。 0030 实施例 2 ：Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的抗药性实验 采用滤纸片法， 选择四环素和卡那霉素进行测试， 以各抗生素滤纸片 （30 g/片） 在培 养降解菌 LD-6 平板上的抑菌圈直径大小， 作为敏感或者耐药的判定标准。试验结果表明， 抑菌圈直径分别为 24 和 16 mm， 呈中度敏感反应 （中度敏感范围为 ： 四环素 23-25 mm ； 。
26、卡那 霉素 14-22 mm） 。 0031 本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时， 不会因抗 （耐） 药性问题而产生超级 细菌或在土著菌间传播， 为其今后的实际应用提供了安全保证。 0032 实施例 3 ：Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的重金属最小抑制浓度 （MIC） 测 试 MIC 测试设计参照 Filali 等人的研究进行 （Filali B.K.， Taoufik J.， Zeroual Y.， Dzairi F.Z.， Talbi M.， Blaghen M. Waste water bacterial isolates resistant to。
27、 heavy metals and antibiotics. Current Microbiology， 2000， 41(3) ： 151-156） ， 挑取等 大、 经活化处理的 LD-6 单菌落于培养试管中， 30， 160 rpm 振荡培养 48 小时。依菌体长 势判定 MICs， 每组设 3 个重复， 分别测试该菌对 13 种金属离子的耐受情况。结果如表 1 所 示， 该菌株具多重耐受性， 耐受性强。 说 明 书 CN 102757907 A 6 5/6 页 7 0033 实施例 4 ：Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的植物病原菌抑制试验 参照竺利红。
28、等人报道的方法 （竺利红， 吴吉安， 孙东昌， 施跃峰。硫丹降解菌 H082 的分 离、 筛选和抑菌性能研究） 进行菌株 LD-6 的抑菌能力测试。结果如表 2 所示， 该菌株对多种 供试病原菌呈现抑制作用。本实施例说明菌体施用后， 能够在一定程度上起到抑制或减轻 植物病害发生的作用。 0034 注 ： + 抑菌率 50-80% ； + 抑菌率 80% 以上。 0035 实施例 5 ：Stenotrophomonas rhizophila LD-6 降解土壤中硫丹的试验 将菌株 LD-6 在发酵培养基中 30恒温培养 24 小时后， 得到菌体发酵液。发酵培养基 的成份为 （g/L） ： 玉米粉。
29、 10 g/L， 豆粕粉 8 g/L， (NH4)2SO4 6 g/L， 玉米浆 6 g/L， MgSO47H2O 1 g/L， K2HPO43H2O 2 g/L， MnSO4 0.05 g/L， pH 7.2。 0036 在无菌水中加入一定量的硫丹 （硫丹预溶于丙酮之中） ， 在摇床上充分震荡混匀 后， 浸泡待试土壤 （供试土壤为pH 5.4的潮土） ， 使土壤颗粒能够均匀的吸附硫丹， 硫丹含量 为 50 mg/kg。喷施菌体发酵液， 搅拌均匀， 使土样中 LD-6 菌体浓度约为 1108 个 /g。土 说 明 书 CN 102757907 A 7 6/6 页 8 壤水分含量控制在 60% 。
30、左右， 恒温 25。同时， 参照 Li Wen 等人研究 （Li W.， Dai Y.， Xue B.B.， Li Y.Y.， Peng X.， Zhang J.S.， Yan Y.C. Biodegradation and detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter xylosoxidans strain CS5. Journal of Hazardous Materials， 2009， 167 ： 209-216） ， 设置对照。随后， 每隔 7 天取 5 g 土样测算硫丹降解情况。 0037 结果如图 3 所示， 28 天供试土样中有 68.6% 的硫丹发生降解， 喷施 LD-6 能够显著 提升硫丹降解速率、 缩短降解时长， 具备实际应用意义和价值。 说 明 书 CN 102757907 A 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102757907 A 9 2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757907 A 10 3/3 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757907 A 11 。