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1、(10)申请公布号 CN 102807969 A (43)申请公布日 2012.12.05 CN 102807969 A *CN102807969A* (21)申请号 201110148896.4 (22)申请日 2011.06.03 CGMCC NO.4506 2010.12.28 C12N 5/10(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 7/00(2006.01) C12R 1/91(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 中国科学院动物研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 5 号 (72)发明人 李瑄 张。
2、寰 秦启联 王雁玲 王红托 张继红 苗麟 孟茜 张宁 朱未 周桂灵 杨青 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 刘丹妮 (54) 发明名称 高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备 方法和应用 (57) 摘要 本发明提供一种高产杆状病毒的转基因昆虫 细胞系及其制备方法和应用， 所述转基因昆虫细 胞系的名称为 IOZCAS-Spex IX， 该细胞系的保藏 号为 CGMCC No.4506 ； 所述转基因昆虫细胞系的 制备方法， 包括以下步骤 ： 培养甜菜夜蛾卵巢细 胞 ； 将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达 载体中， 获得重组表达载体 ； 将所述重组表。
3、达载 体引入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中 ； 和使所述甜 菜夜蛾卵巢细胞能够表达人端粒酶逆转录酶， 获 得转基因昆虫细胞系 ； 所述转基因昆虫细胞系的 应用为其在杆状病毒生产中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系， 该细胞系的名称为 IOZCAS-Spex IX 的转 基因昆虫细胞系， 其保藏号为 CGMCC No.4506。 2. 。
4、根据权利要求 1 所述的转基因卵巢细胞系， 其特征在于， 所述转基因卵巢细胞系含 有人端粒酶逆转录酶基因。 3. 根据权利要求 2 所述的转基因卵巢细胞系， 其特征在于， 所述人端粒酶逆转录酶基 因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。 4. 根据权利要求 1 至 3 任一项所述的转基因卵巢胞系的制备方法， 包括以下步骤 ： 步骤 1 ： 培养甜菜夜蛾卵巢细胞 ； 步骤 2 ： 将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中， 获得重组表达载体 ； 步骤 3 ： 将所述重组表达载体引入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中 ； 和 步骤 4 ： 使所述甜菜夜蛾卵巢细胞能够表达人端粒酶逆转录酶， 获得转。
5、基因昆虫细胞 系。 5. 根据权利要求 4 所述的转基因卵巢细胞系的方法， 其特征在于， 在步骤 2 中， 所述已 知的表达载体为 pIZT-V5-His 或 pIB-V5-His。 6. 根据权利要求 1 至 3 任一项所述的转基因卵巢细胞系的应用， 所述转基因卵巢细胞 系在杆状病毒生产中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病 毒或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。 权 利 要 求 书 CN 102807969 A 2 1/7 页 3 高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种转基因昆虫细胞系及其制。
6、备方法和应用， 尤其涉及一种高产杆状 病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用， 属于转基因动物技术领域。 背景技术 0002 昆虫细胞系的主要用途表现在 ： 作为研究材料， 一直是生理学、 发育生物学、 细胞 生物学、 分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具 ； 作为杆状病毒表达载体系统的重 要组成部分， 可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质 ； 作为生物反应器， 扩增昆 虫杆状病毒， 特别是含有外源基因的重组杆状病毒， 生产生物杀虫剂。 昆虫细胞系具有重要 的经济和应用价值， 但它的建立往往需要消耗大量的时间和精力。据报道， 在 1965 年第一 株昆虫细胞系成功建立后至今， 近。
7、 40 年的时间内， 已经建立的昆虫细胞系超过 500 种。它 们分别来源于鳞翅目、 双翅目、 同翅目、 膜翅目、 直翅目和鞘翅目等 170 多种昆虫， 其中大部 分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。鳞翅目 (Lepidoptera) 是昆虫纲第二大的目， 全世界已知 种达十万种以上， 与农业有关的有两个亚目。 鳞翅目昆虫具有重大经济意义， 除极少数取食 显花植物外， 许多是农林重要害虫。建立鳞翅目昆虫细胞系为科学研究与生物防治提供了 宝贵的生物学材料。 鳞翅目的细胞系来源于多种组织， 包括卵巢、 胚胎、 血细胞、 脂肪体等。 0003 到目前为止， 来自甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua。
8、) 的细胞系共有 6 株。Gelernter 和 Federici(Gelernter， W.D.and B.A.Federici J.Invertebr.Pathol.1986， 48 ： 199 207) 从剪碎的甜菜夜蛾初孵幼虫组织中， 建立了甜菜夜蛾第一个细胞系 UCR-SE-1。经克 隆形成法， 他们又从 UCR-SE-1 细胞系中分离了 SE-UCR-1A 细胞系。在 SE-UCR-1A 细胞系 的基础上， Mccarthy 和 Mckedy(Mccarthy W J， Mckedy D.Dev.Biol.， 1990， 26(8) ： 824 828) 筛选获得一个缺失了核苷激酶。
9、的细胞系。Hara 等 (Hara， K.， K.Tsuda， M. Funakoshi and T.Kawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993， 29A(12) ： 904 907) 也从甜菜夜蛾 初孵幼虫组织中建立了第二株细胞系 Se3FH。Se3FH 对 SeNPV 敏感， 生长速度比 UCR-SE-1 快。经克隆分离的 Se301 细胞系 100能被 SeNPV 感染， 生长速度比 Se3FH 快， 产生的空斑 比 Se3FH 大。第三株 Le-H-HNU7 细胞系是通过甜菜夜蛾血细胞建立的， 该细胞系对斜纹夜 蛾核多角体病毒敏感。第四株 SeHe92。
10、0-1a 细胞系也是来源于甜菜夜蛾血细胞， 接入微孢子 虫 (Vairimorpha sp.) 的孢子后， 比其它来源于鳞翅目昆虫非血细胞的细胞系具有更高的 感染细胞能力。其 12 个克隆株 SeHe920Y1 至 SeHe920Y12 中 SeHe920Y7 感染微孢子虫的能 力最强。另外两株是由本实验室建立的来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的细胞系， 这两株细胞 系对甜菜夜蛾核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒均非常敏感。 0004 尽管前述文献已有甜菜夜蛾细胞系的有关报道， 然而到目前为止， 还没有来源于 甜菜夜蛾卵巢的细胞系。昆虫的卵巢通常是成对的， 是卵子发生和发育的场所。卵巢是由 卵。
11、巢管(ovariole)组成， 在各类昆虫中卵巢管的数目差异很大， 鳞翅目昆虫一般为4、 6或8 条。自 Grace 利用卵巢组织建立了第一个昆虫细胞系以来， 卵巢一直是细胞系建立的重要 组织来源。解剖将要羽化的蛹获得的卵巢组织更易于操作， 减少污染机会。更多种类的昆 说 明 书 CN 102807969 A 3 2/7 页 4 虫细胞系仍存在很大的需求， 建立新的来源于昆虫卵巢的细胞系， 构建更加高效的杆状病 毒表达载体系统是十分有意义的。 0005 与哺乳动物细胞成熟的培养技术相比， 昆虫细胞培养技术亟待建立与完善。昆虫 是世界上种类最多的生物群体， 有着丰富的细胞遗传学系统。 细胞在体外。
12、培养过程中， 由于 受到各种环境因子的影响， 有时会发生自发转化， 即永生化。 永生化的细胞在生长过程中失 去接触抑制， 可无限繁殖传代， 这样的转化不仅所需时间长， 而且转化率极低。建立一株细 胞系往往需要培养大量原代细胞， 费时费力， 经常守株待兔式地等待细胞自发转化， 条件难 以控制， 常常因污染而前功尽弃。体外培养细胞成功传代后， 当培养到一定代数时， 通常会 进入生长抑制状态， 生命力明显减弱， 增殖能力下降， 生长停滞并最终死亡。人工诱导体外 培养细胞转化是获得细胞永生化的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化， 通常只需 1-3 个月就可实现， 而且转化率较高， 传代细胞。
13、生长周期长、 性状稳定。 0006 目前发现， 细胞永生化与端粒和端粒酶关系密切。端粒与端粒酶是真 核细胞染 色体末端的一种特殊结构， 由端粒 DNA 和端粒蛋白质组成。端粒 DNA 是富含 G 的高度保守 的重复核苷酸序列， 参与 DNA 复制， 并对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。体外 培养的细胞每分裂一次， 端粒缩短 50-200bp， 当缩短至一临界值时， 细胞就会停止分裂， 走 向衰老和死亡。人类细胞端粒是由 10-15kb 的重复序列 (TTAGGG)n 组成 ； 在植物中端粒 以 (TTTAGGG)n 重复序列出现 ； 昆虫细胞端粒一般是由 6-8kb 的重复序列 (TTA。
14、GG)n 组成。 目前已知， 在昆虫中存在三种端粒 DNA 类型 ： 家蚕 (Bombyx mori) 的端粒 DNA 由重复序列 (TTAGG)n构成(Okazaki et al.1993) ； 果蝇(Drosophila melanogaster)端粒DNA由转座 因子 HeT-A 和 TART 组成 (Biessmann et al.1990， Levis et al.1993) ； 摇蚊中的端粒 DNA 由复杂的基因串联重复序列组成 (Nielsen & 1993， Zhang et al.1994)。端 粒酶是一种核糖核蛋白酶， 由 RNA 和蛋白质组成， 具有逆转录酶的功能， 以自。
15、身的 RNA 为模 板合成端粒DNA， 以维持端粒的长度。 在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)能稳定端粒的长度， 使细胞易于永生化(Cemi C.Telomeres， telomerase， and myc. An updateJ.Mutat Res.2000， 462(1) ： 31-47.)。 0007 虽然有关将端粒酶基因应用于哺乳动物细胞永生化的报道很多， 但未见涉及利用 转染人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT) 获得昆虫永生化细胞系的报道。通过人工诱导体外转 化方法建立来源于昆虫蛹卵巢并表达人端粒酶逆转录酶基因的细胞系， 为获得永生化昆虫 细胞系提供了重要。
16、途径。 发明内容 0008 因此， 本发明的目的是针对目前尚无含有人端粒酶昆虫细胞系的不足， 提供一种 高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系， 其含有人端粒酶逆转录酶基因， 为获得永生化昆虫细 胞系提供了重要途径。 0009 本发明的另一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的制备方法。 0010 本发明的再一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的应用。 0011 针对上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 0012 本发明一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系， 该细胞系的名称为 IOZCAS-Spex IX 的转基因昆虫细胞系， 其保藏号为 CGMCC No.4506。 说 。
17、明 书 CN 102807969 A 4 3/7 页 5 0013 优选地， 所述转基因卵巢细胞系含有人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)。 0014 优选地， 所述人端粒酶逆转录酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。 0015 本发明的又一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的制备方法， 包 括以下步骤 ： 0016 步骤 1 ： 培养甜菜夜蛾卵巢细胞 ； 0017 步骤 2 ： 将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中， 获得重组表达载体 ； 0018 步骤 3 ： 将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中 ； 和 0019 步骤 4 ： 使所述甜菜夜蛾卵巢。
18、细胞能够表达人端粒酶逆转录酶， 获得转基因昆虫 细胞系。 0020 优选地， 在步骤 1) 中， 所述培养甜菜夜蛾卵巢细胞， 包括以下步骤 ： 0021 步骤 1.1 ： 将甜菜夜蛾雌性蛹浸没在 3次氯酸溶液中 5 分钟， 75乙醇溶液中 10-20 分钟， 进行表面消毒， 然后用无菌蒸馏水清洗昆虫， 再吸干蛹表面水分 ； 0022 步骤 1.2 ： 解剖昆虫， 取出甜菜夜蛾卵巢组织 ； 0023 步骤 1.3 ： 用生理盐水清洗步骤 2 中获得的组织 2-3 次， 再用细胞培养液 I 清洗， 清洗后把该组织放入含有1mL细胞培养液I润洗过的细胞培养瓶中， 盖紧瓶盖， 放入27无 光照的细胞培。
19、养箱中培养 24 小时 ； 0024 步骤 1.4 ： 加入适量的细胞培养液 I， 使组织完全或大部分浸没在该培养液中， 在 与步骤 1.3 同样条件下培养 ； 0025 步骤1.5 ： 每7-10天吸出半量的培养液， 并同时换入半量新的细胞培养液II， 直至 观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶。 0026 优选地， 在步骤 2 中， 所述已知的表达载体为 pIZT-V5-His 或 pIB-V5-His。 0027 优选地， 在步骤 3) 中， 所述重组表达载体通过脂质体导入所述的甜菜夜蛾卵巢细 胞中。 0028 优选地， 在步骤 4) 中， 具体通过以下步骤获得转基因卵巢细胞系。
20、 ： 0029 步骤 4.1 ： 放入与步骤 1.3 同样条件下培养至少 4 小时， 并不时晃动。转染后换适 量细胞培养液 II 继续在与步骤 1.3 同样条件下培养 ； 0030 步骤 4.2 ： 72 小时后荧光倒置显微镜观察转染效果， 换含有真核细胞 筛选抗生素 的细胞培养液 III 或者细胞培养液 IV 筛选， 成功表达 hTERT 的细胞继续与步骤 1.3 同样条 件下培养 ； 0031 步骤 4.3 ： 在将该细胞与步骤 1.5 相同培养细胞， 直至获得转基因昆虫细胞系。 0032 上述整个过程都是在无菌条件下进行的 ； 其中所述的四种细胞培养液分别是细胞 培养液 I 是昆虫细胞培。
21、养液与青霉素、 链霉素、 苯基硫脲和胎牛血清的混合物 ； 细胞培养液 II 是昆虫细胞培养液与青霉素、 链霉素和胎牛血清的混合物， 细胞培养液 III 是昆虫细胞 培养液与青霉素、 链霉素、 博莱霉素 (zeocin) 和胎牛血清的混合物， 细胞培养液 IV 是昆虫 细胞培养液与青霉素、 链霉素、 杀稻瘟菌素 (blasticidin) 和胎牛血清的混合物， 配成的细 胞培养液 pH 为 6.0-6.8。 0033 昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液， 如 TNM-FH， Grace s， Sf 900， TC-100， IPL-41， Ex-Cell 400 等等。 0034 通。
22、常， 细胞培养液中青霉素含量为 100U/mL、 链霉素含量为 100U/mL ； 筛选转基因 说 明 书 CN 102807969 A 5 4/7 页 6 细胞的培养液为上述培养液含博莱霉素 (zeocin)400g/mL ； 转基因细胞系培养液为上述 培养液含博莱霉素 (zeocin)50g/mL ； 动物血清含量为细胞培养液的 10 ( 体积比 )。 0035 本发明的再一方面提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的应用， 所述转基 因卵巢胞系在杆状病毒生产中的应用。 0036 优选地， 所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病毒 (SeNPV) 或苜蓿银纹夜蛾核型 多角体病毒 (AcMNPV。
23、)。 0037 本发明中表达了人端粒酶逆转录酶 (hTERT) 基因的甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的生 物学特征观察和测定 ： 0038 1.经实验观察， 该细胞系大部分为贴壁细胞， 也有部分悬浮于培养液中。 细胞的形 状有 3 种类型 ： 大部分细胞圆形、 少部分梭形， 较少似巨噬细胞形， 易聚集形成细胞团 ； 荧光 信号转染初期较强， 转染效率高。 0039 2.IOZCAS-Spex IX 对甜菜夜蛾核型多角体病毒及苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 敏感， 可以观察到典型的细胞病理特征， 即细胞核增大， 内含大量的多角体颗粒， 感染率分 别为 92.41和 83.15 ； 并且至少可以连续传代 3 代。
24、。 0040 3. 按照 McIntosh and Ignoffo， 1989(McIntosh， A.H.and C.M.IgnoffoJ. Invertebr.Pathol.1989， 54 ： 97 102) 的方法， 测定第 10 代细胞生长曲线 和群体倍增时 间。以 2.5105 细胞 /mL 的浓度接种到 24 孔培养板中， 27培养， 每 48h 测定细胞浓度， 绘制生长曲线， 并按公式Ttlg2/lg(N/N0)计算， 第10代的细胞群体倍增时间为70.09 小时。 0041 其中 T 在对数期平均增长一倍所需的时间 0042 t 接种到测定细胞数的时间 0043 N0 接种时。
25、的细胞数 0044 N 时刻 t 所测定的细胞总数 0045 4. 按照 Takahashi et al.(Takahashi， Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop. Growth and Differ.22 ： 11-19) 的方法， 测定了第 12 代细胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色 体数目 n 31(Hara， Tsuda， Funakoshi and Kawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993， 29A(12) ： 904907)， 而IOZCAS-Spex IX的染色体数目在116-131之间， 因此， 新建立的细 胞。
26、系 IOZCAS-Spex IX 由 4 倍体细胞组成。 0046 5. 使用 DAF-PCR 的方法 (McIntosh， Grasela and Matteri(1996)， InsectMol. Biol.5 ： 187 195) 鉴定了细胞系 IOZCAS-SpexIX 确是来源于甜菜夜蛾， 而非其它细胞系 的污染。由 IOZCAS-SpexIX 提取的 DNA 与甜菜夜蛾蛹 DNA、 来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的 IOZCAS-SpexII-A的DNA扩增后主要的带型相同 ； 而与对照， 来源于草地贪夜蛾的Sf9、 棉铃 虫脂肪体的 IOZCAS-Ha-I、 美洲棉铃虫蛹卵巢的 BCI。
27、RL-Hz-AM1 的细胞带型明显不同。 0047 6. 使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理， 保存细胞的种 资， 并成功复苏。 附图说明 0048 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中 ： 0049 图 1 为本发明所述的 IOZCAS-Spex IX 的培养形态图， 图中标尺所示为 400m ； 说 明 书 CN 102807969 A 6 5/7 页 7 0050 图 2 为本发明所述的 IOZCAS-Spex IX 的转染荧光 ( 绿色荧光 GFP 标记 ) 图， 图中 标尺所示为 400m ； 0051 图 3 为本发明所述的 IOZCAS-Spex。
28、 IX 感染甜菜夜蛾后获得大量的病毒多角体试 验结果图， 图中标尺所示为 200m ； 0052 图 4 为本发明所述的 IOZCAS-Spex IX 感染苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒后获得 大量的病毒多角体试验结果图， 图中标尺所示为 200m ； 0053 图 5 为本发明所述的 IOZCAS-Spex IX 的生长曲线 ； 0054 图 6 为本发明所述的 IOZCAS-Spex IX 的核型 ； 0055 图 7 为 DAF-PCR 鉴定 IOZCAS-Spex IX 的 DNA 指纹扩增琼脂糖电泳图， 图中 1 为 IOZCAS-Spex IX， 2 为甜菜夜蛾蛹 (Spodopter。
29、a exigua pupa)， 3 为脂肪体的 IOZCAS-Spex II-A， 4 为棉铃虫脂肪体的 IOZCAS-Ha-I， 5 为美洲棉铃虫蛹卵巢的 BCIRL-Hz-AM1， 6 为草地 贪夜蛾的 Sf9， 7 为 DNA 标记 (DNAMarker) ； 0056 图 8 为表达载体质粒 pIZT-V5-His， 具有多克隆位点、 杆状病毒早起启动子、 V5 表 位和抗 Zeocin 基因 ； 0057 图9为表达载体质粒pIB-V5-His， 具有多克隆位点、 杆状病毒早起启动子、 V5表位 和抗 Blasticidin 基因 ； 0058 图 10 为转基因昆虫细胞系 PCR 。
30、扩增的琼脂糖电泳结果示意图， 图中 1 为 IOZCAS-Spex IX细胞系， 2为甜菜夜蛾卵巢(spodoptera exigua ovary)， 3为DNA标记(DNA Marker)。 具体实施方式 0059 以下实施例中所使用的技术， 包括基因扩增， 基因克隆， 细胞转染， 以及细胞培养、 检测技术， 除非特别说明， 均为本领域的技术人员已知的常规技术 ； 所使用的仪器设备、 试 剂、 细胞等， 除非是说明书中特别说明， 均为本领域技术人员可以通过公共途径获得的。 0060 实施例 1. 转基因甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的建立 0061 取末龄的甜菜夜蛾 5 天雌性蛹浸没在 3次氯酸溶液中。
31、 5 分钟， 75乙醇溶液中 10-20 分钟， 进行表面消毒。解剖该蛹取出卵巢组织， 操作时尽量保持其完整。用生理盐水 清洗该组织2-3次， 再用细胞培养液I(以TNM-FH为主， 含100U/mL的青霉素， 100U/mL的链 霉素和10(v/v)的胎牛血清， pH6.2)清洗1-2次， 放入使用1mL培养液润洗过的25cm2 的细胞培养瓶中， 放入摄氏27无光照的细胞培养箱中培养24小时。 然后加入3mL细胞培 养液I， 放入同样条件下培养。 注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织紧贴在细胞培 养瓶底， 勿使组织悬浮在细胞培养液中。以后每 7-10 天左右吸出半量的培养液， 并同时换 。
32、入半量的新细胞培养液 II。在此操作第 3 天后可以观察到组织周围游离出大量单个的细 胞， 并逐 渐向外围扩展。 当甜菜夜蛾卵巢的原代细胞增殖至10天时， 根据invitrogen公司 Cellfectin II Reagent(Cat.no.10362-100， 10362-125) 方法将本实验室构建的人端粒酶 逆转录酶重组质粒转染到原代细胞中， 27无光照的细胞培养箱中培养。转染后第三天可 通过荧光倒置显微镜观察转染效果。转染初期， 部分细胞漂浮死亡， 每 7 天半量换细胞培养 液 II， 观察细胞增殖情况。当细胞有聚团增殖趋势时， 加入 400g/mL 博莱霉素 (zeocin) 筛选。
33、， 成功转染了重组质粒基因的细胞贴壁生长正常， 未转染的细胞则漂浮死亡。 11天后当 说 明 书 CN 102807969 A 7 6/7 页 8 细胞增殖至将要铺满整个培养瓶时， 细胞连同全部的培养液吸出放入新培养瓶中， 并加入 2mL 新的细胞培养液 III 或 IV( 含 50g/mL 博莱霉素 (zeocin)。细胞系建立初步成功。 在细胞开始传代的第17天后开始第二次分瓶传代， 以后传代时间逐渐缩短， 传到第5代时， 传代时间缩短至 10 天， 细胞生长开始稳定， 传至第 12 代时， 传代时间已缩短至 4-5 天。最 终该细胞系被命名为 IOZCAS-Spex IX。IOZCAS-。
34、Spex IX 已于 2010 年 12 月 28 日保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 ： CGMCC No.4506， 分类命名 ： 甜菜 夜蛾蛹卵巢转基因细胞株。 0062 实施例 2. 人端粒酶逆转录酶 (hTERT) 基因重组质粒 pIZT-hTERT 和 pIB-hTERT 的 构建 0063 利用载体质粒 pIZT-V5-His 构建重组质粒 pIZT-hTERT。如图 8 所示， 载体质粒 pIZT-V5-His 具有多克隆位点、 杆状病毒早起启动子、 V5 表位和抗 Zeocin 基因。将载体质 粒 pIZT-V5-His 进行 EcoR I 和 。
35、EcoR V 限制性酶切， 将 hTERT 基因 ( 其序列如 SEQ ID NO 1 所示 )( 来自质粒 pBABE-puro-hTERT) 进行 Sal I 限制性酶切， dNTP 补平、 EcoR I 酶切后， 克隆到载体质粒中获得 hTERT 重组质粒 pIZT-hTERT。 0064 利用载体质粒 pIB-V5-His 构建重组质粒 pIB-hTERT。如图 9 所示， 载体质粒 pIB-V5-His 具有多克隆位点、 杆状病毒早起启动子、 V5 表位和抗 Blasticidin 基因。将 载体质粒 pIB-V5-His 进行 EcoR I 和 EcoR V 限制性酶切， 将 hT。
36、ERT 基因 ( 来自质粒 pBABE-puro-hTERT) 进行 Sal I 限制性酶切， dNTP 补平、 EcoR I 酶切后， 克隆到载体质粒中 获得 hTERT 重组质粒 pIB-hTERT。 0065 实施例 3.IOZCAS-Spex IX 的生物学特性观察和测定 0066 (1) 形态特征 ： 经显微镜观察， 该细胞系细胞易于形成细胞团且可忍受高密度生 长环境， 突破了接触抑制。如图 1-2 所示， 细胞的形状有 3 种类型 ： 圆形、 梭形和椭圆形。大 部分细胞贴壁。 0067 (2) 细胞的生长 ： 27下， 细胞系第 10 代在含 10胎牛血清、 100U/mL 的青霉。
37、素、 100U/mL 的链霉素、 50g/mL 博莱霉素的 TNM-FH 培养液中， 群体倍增时间为 70.09h。如图 5 所示， 细胞最高密度约可达 2.7106个细胞 /mL。 0068 (3) 核型分析 ： 如图 6 所示， IOZCAS-Spex IX 第 12 代细胞是 4 倍体细胞， 染色体数 目范围 116-131(2n 62)。 0069 (4)DAF-PCR 鉴定 ： 如图 7 所示， 细胞系 IOZCAS-Spex IX 确是来源于甜菜夜蛾， 而 非其它细胞系的污染。由 IOZCAS-Spex IX 提取的 DNA 同于甜菜夜蛾蛹和脂肪体的 DNA 指 纹扩增图谱， 而不。
38、同于草地贪夜蛾的 Sf9、 棉铃虫脂肪体的 IOZCAS-Ha-I、 美洲棉铃虫蛹卵 巢的 BCIRL-Hz-AM1 的图谱。 0070 (5) 冻存和复苏 ： 使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处 理， 保存细胞的种资， 并可以成功复苏。 0071 实施例 4. 病毒敏感性 0072 IOZCAS-Spex IX对甜菜夜蛾核型多角体病毒敏感 ： 将SeNPV及AcMNPV出芽型病毒 粒子 BV 以 0.001 幼虫当量 / 毫升的浓度接种 IOZCAS-SpexIX， 培养 7 天后， 如图 3-4 所示， 通过倒置显微镜可以观察到典型的细胞病理特征， 即细胞核增大， 内含大。
39、量的多角体颗粒。 并且至少可以连续传代 3 代。病毒感染率分别为 92.41和 83.15。 说 明 书 CN 102807969 A 8 7/7 页 9 0073 实施例 5. 转 hTERT 基因细胞中 hTERT 基因的测定 0074 利用 PCR 技术， 测定转 hTERT 基因的细胞系 IOZCAS-Spex IX 中 hTERT 基因的存 在。 0075 引物 ： 0076 hTERT 上游引物 ： AGC TGC GGC CCT CCT TCC TAC TCA 0077 hTERT 下游引物 ： GAC GCT CGG CCC TCT TTT CTC TGC 0078 反应条件 。
40、： 0079 95， 2min ； 0080 95 /30S， 57 /30S， 72 /60S ； 30 个循环 0081 72， 5min。 0082 如图 10 所示， PCR 检测结果证明， 转基因的细胞株内存在 hTERT 基因。 说 明 书 CN 102807969 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102807969 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 102807969 A 11 1/5 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102807969 A 12 2/5 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102807969 A 13 3/5 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102807969 A 14 4/5 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102807969 A 15 5/5 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102807969 A 16 。