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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610575095.9 (22)申请日 2016.07.21 (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路7号 (72)发明人 李鹏程杨悦邢荣娥刘松 于华华陈晓琳李克成秦玉坤 刘卫翔孙雨豪 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 李颖周秀梅 (51)Int.Cl. C08B 37/08(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 一种不同分子量-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯 及。
2、其制备方法 (57)摘要 本发明涉及海洋生物技术领域， 具体是一种 不同分子量-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备 方法。 不同分子量-C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖， 其结构式如下， 其中n为聚合度： 2200； 该化合 物的活性基团硫酸酯基(OSO3-)的含量为 31.336.5。 本发明制备方法属均相反应， 简单易行， 原料利用率高。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 105968231 A 2016.09.28 CN 105968231 A 1.一种不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯， 其特征在于： 不同分子量 -C-2， 3， 6-硫 酸酯-壳聚糖， 其结构式。
3、为： 其中n为聚合度： 2200； 化合物的活性基团硫酸酯基(OSO3)的含量为31.3 36.5。 2.按权利要求1所述不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法， 其特征在于： (1)磺化试剂的制备： 将N,N二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却， 然后在搅拌条件下滴加 氯磺酸， 使其在0-5反应； 其中N,N二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5： 1)-(10： 1)； (2)不同分子量的 -壳聚糖的制备： 将高分子量 -壳聚糖溶于过量的酸性溶液中， 而后 再加入双氧水， 混匀后于60-80水浴搅拌10-60分钟， 得到不同分子量的 -壳聚糖； (3) -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖。
4、的制备： 称取上述获得的不同分子量的 -壳聚糖， 加入 至甲酸或二氯乙酸中充分溶解， 溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺， 搅拌均匀后， 再加入上述磺 化试剂， 混合均匀后在微波辐射40-70条件下反应， 反应后纯化得不同分子量的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖； 其中， -壳聚糖、 甲酸或二氯乙酸、 N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5： 20-25: (g： ml： ml)； -壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1： 15-25(g： ml)。 3.按权利要求2所述的不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法， 其特征在于： 所述高分子量 -壳聚糖的分子量为2000kD。
5、a-4573kDa。 4.按权利要求2或3所述的同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料， 在40-45的微波辅助条件下反应1-3 分钟， 得到1000-4000Da分子量的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯； 将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料， 在45-55的微波辅助条件下反应1-5分钟， 得到 4.5-10KDa的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯； 将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料， 在45-70的微波辅助条件下反应1-5分钟， 得 到10-100KDa的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。 5.按权利。
6、要求2所述的不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇， 室温沉化 30-60min， 得到的沉淀物即是不同分子量的 -C-2， 3， 6-壳聚糖硫酸酯的粗产品； 将上述粗 产品抽滤， 滤饼用蒸馏水溶解， 再用NaOH溶液将其中和， 透析， 透析液浓缩， 冷冻干燥得不同 分子量的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105968231 A 2 一种不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及海洋生物技术领域， 具体是。
7、一种不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯 及其制备方法。 背景技术 0002 甲壳素是世界第二大纤维素资源， 由于来源不同， 其构型可分为 -甲壳素、 -甲壳 素、 -甲壳素， 目前研究最多的为 -甲壳素， 为反平行结构， 其次为 -甲壳素， 为平行结构， 不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。 壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物， 其生物相 容性好， 但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用； 天然制备的 -壳聚糖分子 量通常在2000kDa以上， 因而粘度很大不方便应用。 发明内容 0003 本发明的目的是要提供一种不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法。 0004。
8、 为实现上述目的， 本发明采用技术方案为： 0005 一种不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯， 不同分子量 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚 糖， 其结构式为： 0006 0007 其中n为聚合度： 2200； 化合物的活性基团硫酸酯基(OSO3)的含量为 31.336.5。 0008 不同分子量 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法： 0009 (1)磺化试剂的制备： 将N,N二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却， 然后在搅拌条件下 滴加氯磺酸， 使其在0-5磺化反应； 其中N,N二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5： 1)- (10： 1)； 0010 (2)不同分子量的 -壳聚糖的制备。
9、： 将高分子量 -壳聚糖溶于过量的酸性溶液中， 而后再加入双氧水(使溶液中H2O2最终体积分数为1-3)， 混匀后于60-80水浴搅拌10-60 分钟， 得到不同分子量的 -壳聚糖； 0011 (3) -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的制备： 称取上述获得的不同分子量的 -壳聚糖， 加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解， 溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺， 搅拌均匀后， 再加入上 述磺化试剂， 混合均匀后在微波辐射40-70条件下反应， 反应后纯化得不同分子量的 -C- 2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖； 0012 其中， -壳聚糖、 甲酸或二氯乙酸、 N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.。
10、5： 20-25:(g： ml： ml)； -壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1： 15-25(g： ml)。 说明书 1/4 页 3 CN 105968231 A 3 0013 所述高分子量 -壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。 其， 来源于鱿鱼软骨、 墨鱼 软骨等材料。 0014 所述步骤2)酸性溶液为浓度为1-3甲酸、 乙酸或盐酸。 0015 所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料， 在40-45的微波辅助条件下反 应1-3分钟， 得到1000-4000Da分子量的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯； 0016 将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料， 在45-55。
11、的微波辅助条件下反应1-5分钟， 得到4.5-10KDa的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯； 0017 将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料， 在45-70的微波辅助条件下反应1-5分 钟， 得到10-100KDa的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。 0018 所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇， 室 温沉化30-60min， 得到的沉淀物即是不同分子量的 -C-2， 3， 6-壳聚糖硫酸酯的粗产品； 将 上述粗产品抽滤， 滤饼用蒸馏水溶解， 再用NaOH溶液将其中和， 透析， 透析液浓缩， 冷冻干燥 得不同分子量的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖。
12、纯品。 0019 本发明所具有的优点： 0020 本发明将粘度极大的 -壳聚糖最终反应生成不同分子量的 -壳聚糖硫酸酯类化 合物， 是壳聚糖经磺化后所得2， 3， 6位壳聚糖硫酸酯衍生物， 具有强聚阴离子性质。 具体， 本 发明用 -壳聚糖原料降解成分子量更小的 壳聚糖， 方便制备成不同分子量的 -壳聚糖硫 酸酯， 从而获得良好的水溶性， 应用更加方便。 同时本发明采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的 含硫量高， 对壳聚糖原料利用率高； 制备过程采用均相反应， 制备方法简单快速， 操作成本 低， 污染少。 所用壳聚糖原料为不同分子量的 -壳聚糖， 可得到不同分子量的 -壳聚糖硫酸 酯。 且不同分子量的。
13、壳聚糖在许多活性方面如抑菌、 促生长、 免疫调节等方面显示不同的活 性， 因而本发明制备了不同分子量的 -壳聚糖硫酸酯， 从而改善其生物活性。 本发明制备方 法属均相反应， 简单易行， 原料利用率高。 附图说明 0021 图1为 -壳聚糖原料的红外表征谱图。 在1652cm-1附近， -壳聚糖只有一个氨基峰， 而另一氨基峰则位于1558cm-1附近， 符合 -壳聚糖结构特征。 0022 图2为分子量为3169Da的-C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。 在 1215.33cm-1处出现了SO的非对称伸缩振动， 在809.04cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振 动， 证明了分子。
14、中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。 0023 图3为分子量为5030Da的-C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。 在 1219.52cm-1处出现了SO的非对称伸缩振动， 在811.99cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振 动， 证明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。 0024 图4为分子量为14481Da的-C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。 在 1213.41cm-1处出现了SO的非对称伸缩振动， 在810.16cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振 动， 证明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。 0025 图5为分子量为3169Da的 -C-2，。
15、 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。 0026 图6为图5为分子量为5030Da的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。 0027 图7为分子量为14481Da的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。 说明书 2/4 页 4 CN 105968231 A 4 0028 图8为分子量为5030Da的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振氢谱。 可以看出在 壳聚糖的2， 3， 6位引入硫酸酯基后， 由于硫酸酯基的去屏蔽作用使氢的化学位移向低场漂 移。 0029 图9为分子量为5030Da的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振碳谱。 可以看。
16、出在 壳聚糖的2， 3， 6位引入硫酸酯基后， 由于硫酸酯基的去屏蔽作用化学位移向低场漂移。 具体实施方式 0030 本发明的实施例结合附图进一步说明如下。 0031 实施例1 -壳聚糖的制备 0032 将日本枪乌贼软骨表面的组织残留物洗净、 烘干， 称取97g鱿鱼骨置于过量的4 的盐酸中浸泡7h， 用蒸馏水洗至中性； 然后置于过量的1的氢氧化钠溶液中， 90水浴反 应2h， 用蒸馏水洗净至中性并烘干， 即得 -甲壳素， 称重为30.7g， 产率为31.6。 称取31.6g -甲壳素， 将其粉碎后与45(wt)的氢氧化钠溶液按照质量体积比1:8的比例混合95反 应6小时,获得26.1g -壳聚。
17、糖， 产率为85.02， 紫外光谱法测定脱乙酰度为87.58、 高效 液相法测定分子量为4574KDa。 0033 实施例2不同分子量 -壳聚糖的制备 0034 称取分子量为4574KDa、 脱乙酰度为87.58的 -壳聚糖， 溶解于过量的0.8(体 积浓度)的盐酸溶液， 搅拌溶解直至获得澄清、 均质的质量浓度为1.25的 -壳聚糖， 然后 加入过氧化氢(使溶液中H2O2最终体积分数为3)， 60-70水浴搅拌10-60分钟， 得到不同 分子量的壳聚糖， 高效液相法测定其分子量分别为8kDa,21kDa,1010kDa。 0035 实施例3不同分子量的 -C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备 0。
18、036 (1)磺化试剂的制备 0037 用N， N二甲基甲酰胺(DMF)为反应介质制备磺化试剂DMFSO3(二甲基甲酰 胺氯磺酸)磺化剂。 将装有搅拌装置的三口烧瓶置于冰水浴中， 三口瓶中加入500mL的N， N二甲基甲酰胺， 在搅拌状态下， 滴加100mL氯磺酸， 按照1-2滴/秒控制滴加的速度， 并使 反应体系的温度保持在0-5。 滴加完毕后在室温下继续搅拌至澄清， 使磺化试剂更为安全 有效。 0038 低分子量壳聚糖硫酸酯的制备 0039 称取不同分子量的 -壳聚糖原料2g于三口瓶中， 加入50ml甲酰胺， 搅拌均匀后， 加 入5ml甲酸及50ml的磺化剂， 混合均匀后， 放入微波降解反。
19、应器中， 在微波辐射条件下， 45- 70反应， 然后用反应液2-5倍体积量的无水乙醇沉淀， 室温沉化约30min， 得到的沉淀物即 是壳聚糖硫酸酯的粗产品。 将上述粗产品抽滤， 滤饼用蒸馏水溶解， 并用2MNaOH溶液将其 中和， 透析， 浓缩， 冷冻干燥得不同分子量的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖。 用高效液相色谱仪 测 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖的分子量(参见表1)。 0040 表1不同反应条件下不同分子量 -壳聚糖硫酸酯的制备 说明书 3/4 页 5 CN 105968231 A 5 0041 0042 实施例4 0043 将上述获得的不同分子量的 -C-2， 3， 。
20、6-硫酸酯-壳聚糖， 进行免疫增强活性的测 定， 以小鼠腹腔巨噬细胞为模型， 具体为： 0044 取处于对数生长期的RAW264.7细胞， 调整细胞浓度1106个/mL， 96孔板每孔接种 100ul。 在5的CO2培养箱中培养24h后， 加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL， 使其终浓 度分别为0， 6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200ug/mL， LPS做阳性对照， 终浓度为1ug/ml， 均设置3个 复孔。 将96孔板继续培养24h后， 每孔取100ul上清液到新的96孔板， 加入等体积的Griess试 剂， 室温避光放置10min， 酶联免疫检测仪570nm下测吸。
21、光度， 平行重复3次， 代入标准曲线求 出NO量。 (参见表2) 0045 表2不同分子量的 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖对NO表达量的影响 0046 分子量NO表达量(uM) 3169Da10.566.05 5030Da17.519.30 14481Da4.010.81 空白对照1.990.49 0047 不同分子量 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖均具有非常好的水溶性， 且由于硫酸酯基 的加入， 其具有非常好的免疫增强活性， 具体从上表2可以看出， -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖 能够明显促进细胞产生NO， 其产生NO的量为空白对照的2-10倍， 上表中分子量为5030的 - C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖免疫增强活性最强， 表明 -C-2， 3， 6-硫酸酯-壳聚糖具有良好的免 疫增强活性。 说明书 4/4 页 6 CN 105968231 A 6 图1 图2 说明书附图 1/5 页 7 CN 105968231 A 7 图3 图4 说明书附图 2/5 页 8 CN 105968231 A 8 图5 图6 说明书附图 3/5 页 9 CN 105968231 A 9 图7 图8 说明书附图 4/5 页 10 CN 105968231 A 10 图9 说明书附图 5/5 页 11 CN 105968231 A 11 。