技术领域
本公开涉及一种用于基于纳米线探测器的核酸测序的设备。
背景技术
已知采取核酸测序的重要性不断增大，已经开发了各种技术用于 确定核苷酸序列。
一些已知的技术是基于将核酸分子分割为单独排序的短片段，通 常为数百个碱基。随后对根据该单独的部分而收集的信息进行处理并 且汇总，以用于重构形成了核酸分子的整个碱基序列。然而，序列的 重构是极其复杂的并且极其耗费资源(特别是处理能力和时间)的操 作。此外，可能发生的是，并未正确地读取和重构一些片段，并且因 此测序可能不完整。
纳米技术领域中的发展已经使得能够开发出能够处理单独的分 子的新的装置和技术，特别是向核酸提供电荷。例如，在一些装置中， 使用合适的电场以使得单个核酸分子通过隔膜中的纳米孔。实际中， 装置具有由隔膜分隔的两个腔室，隔膜具有纳米孔并且被设置有使得 电场形成的电极。含有核酸分子的溶液被装载到该两个腔室之一中。 随后，通常展现为纠缠的链的核酸分子的一端，可以由于电场的作用 而被引入纳米孔中。纳米孔具有如下尺寸，其使得一个分子一部分的 存在阻碍了其他分子的端部的进入(纳米孔的直径可以例如在5nm 与10nm之间)。如此方式，能够对单个序列进行隔离和处理。由电 场施加的力使得，当形成分子的链在其端部之后穿过纳米孔时，该形 成分子的链伸展。因此而伸展的链可以被分析以便测序。
该类型装置的示例在Liu Q.,Wu H.,Wu L.,Xie X.,Kong J.,等人 的(2012)“Voltage-Driven Translocation of DNA through a High Throughput Conical Solid-State Nanopore”，PLoS ONE 7(9):e46014； DOI:10.1371/journal.pone.0046014的文章中；以及在Tsutsui,M等人 的“Transverse Electric Field Dragging of DNA in a Nanochannel”，Sci. Rep.2,394；DOI:10.1038/srep00394(2012)中被描述。已知采取核酸测 序的重要性不断增大，已经开发了各种技术用于确定核苷酸序列。
然而，可应用的探测技术仍然仅使得能够识别相对较短的碱基序 列，在大多数有利的场合下至多几千个。因此存在根据相关的计算负 担和错误可能性来重组部分序列的需求。
实用新型内容
本公开的至少一个实施例提供了用于核酸测序的设备，该设备将 克服上述限制。
本公开的一个实施例是一种用于核酸测序的设备。设备包括在探 测位置处的碱基探测装置、以及输运装置。碱基探测装置被配置用于 探测核酸链的在探测位置处的部分的碱基。输运装置被配置用于延展 核酸链，并且用于使得延展的核酸链沿着路径滑动通过探测位置。碱 基探测装置包括沿着路径设置的多个场效应纳米线探测器，并且每个 场效应纳米线探测器包括各自的纳米线和核酸探针，核酸探针由各自 的碱基序列所限定并且固定至各自的纳米线。
附图说明
为了更好理解本公开，现在将纯粹借由非限定性示例以及参照附 图而描述本公开的一些实施例，其中：
图1是根据本公开实施例的、穿过集成了用于核酸测序设备的一 部分的本体的剖视图；
图2是图1的本体的顶部平视图；
图3是图1的设备的方框图；
图4－图7示出了在各自操作配置中图1的剖视图；
图8是图1的设备的一部分的更详细方框图；
图9示出了图1的设备的放大细节；以及
图10－图12是示出了关于图1的设备的电量的图表。
具体实施方式
参照图1和图2，用于核酸测序的设备整体被标注为附图标记1， 并且包括本体2，该本体2容纳：流体回路(fluidic circuit)3；碱基 探测装置4；和输运装置5，其被配置用于控制核酸链在流体回路3 中的移动。
在一个实施例中，本体2包括第一支撑结构层7和第二结构层8， 在两者之间设置有纳米厚度(例如小于20nm)的间隔件层9。第一 结构层7可以例如是本征半导体材料的衬底，或者可以是聚合物材料 或一些其他非导电材料。备选地，第一结构层7也可以是掺杂半导体 材料，并且例如通过界定了流体回路3自身的介电层而与流体回路3 电绝缘。第二结构层8和间隔件层9可以例如分别由氮化铝(或者本 征硅或者一些其他非导电的或与流体回路3绝缘的导电材料)和氧化 硅构成。
使用中，流体回路3采用包含变性的(denatured)核酸链的溶液 填充，并且包括纳米通道10，在一个实施例中纳米通道10被限定在 第一结构层7与第二结构层8之间。变性也可以直接在流体回路中在 纳米通道10的入口的上游实现。纳米通道10以例如被包括在100μm 与500μm之间的长度，沿着轴线A纵向延伸，并且具有纳米尺寸的 (特别是小于100nm的)垂直于轴线A的截面(例如20×20nm)。 纳米通道10的沿垂直于其长度的方向的横向尺寸被选择，以用于促 成单个核酸扩展链的通过，如在上述文献中所述的纳米孔的情形中。 具体而言，纳米通道10具有等于间隔件层9厚度的高度和宽度。然 而，在未示出的其他实施例中，纳米通道10可以具有不同的截面， 例如矩形、三角形或圆形。
流体回路3包括入口井12、控制井13、以及收集井14，所有均 由穿过第二结构层8的相应的开口而限定。特别地，可以通过入口井 12来从外部接入纳米通道10，以使得能够引入待分析的溶液。
用于提供纳米流体结构特别是纳米通道的技术是已知的，例如来 自已公开专利申请案号US2013/0213815A1，其全文通过引用被合并 入本文。
在一个实施例中，输运装置5(也参见图3)包括：第一电极15， 第二电极16，和第三电极17，这些电极沿着流体回路3设置，并且 配置用于将相应电压施加至存在于流体回路3中的流体；第一阻抗计 级18和第二阻抗计级19；以及控制单元20。
在一个实施例中，第一电极15、第二电极16、和第三电极17设 置在第二结构层8的与第一结构层7相对的表面上，并且分别涂覆了 入口井12、控制井13和收集井14的侧壁。特别地，第一电极15、 第二电极16、和第三电极17基本上延伸远至纳米通道10的范围，以 便于成为与被载入纳米通道10自身中的溶液接触。
碱基探测装置4位于沿着纳米通道10在第二电极16附近的探测 位置处，以便于与在纳米通道10中在探测位置处前进的核酸的伸展 链相互作用。配置碱基探测装置4以识别链的在探测位置处前进的一 部分中的单个碱基、或者由所编程的数目的(例如四个)碱基组成的 序列。由碱基探测装置4识别的碱基原始序列被提供至控制单元20， 如果需要的话，控制单元20将原始序列排序为有效的碱基序列SEQ (图3)如下文中详述的，以便于考虑到碱基探测装置4的探测模态 (modality)和可能的几何约束。
连接了第一阻抗计级18和第二阻抗计级19，以用于分别测量在 第一电极15与第二电极16之间的电阻抗Z’、以及在第二电极16与 第三电极17之间的电阻抗Z”。测得的阻抗Z’、Z”的数值由纳米通道 10的状态确定，并且被提供至控制单元20。更精确而言，当存在核 酸链的一部分时，在含有溶液的纳米通道10的展宽(stretch)中电阻 抗增大。第一阻抗计级18和第二阻抗计级19因此用作存在传感器， 分别探测了在纳米通道10的在第二电极16与第一电极15之间的第 一部分中、以及在纳米通道10的在第三电极17与第二电极16之间 的第二部分中的核酸链的存在。在其他实施例中(未示出)，可以使 用不同类型的存在传感器。
控制单元20在第一电极15上设置第一电压V1、在第二电极16 上设置第二电压V2、以及在第三电极17上设置第三电压V3，作为分 别由第一阻抗计级18和由第二阻抗计级19提供的第一阻抗值Z’和第 二阻抗值Z”的函数。
如以下所述，每次基于阻抗值Z’、Z”来选择电压V1、V2、V3以 便于：
促成将核酸链F的一端引入纳米通道10中；
当其已经被占据时，防止其他链进入纳米通道10中；
控制存在于纳米通道10中链F的前进的速度和方向；以及
施加力至存在于纳米通道10中链F的一部分，以便于使得链F 自身伸展，也即，是与缺乏外部力的情形相比、其中连续碱基被布置 为以更大的间距而相互间隔的状态。
如图4中所示，入口井12初始采用含有变性核酸链的溶液填充， 变性核酸链具有负性电荷。纳米通道10由溶液排他地占据，并且没 有链。第一电阻抗Z’具有相应的第一(低)数值。控制单元20设置 第一电压V1为负数值，并且设置第二电压V2为第一正数值，以便于 促成存在于入口井12中的一个核酸链的一端进入纳米通道10中(图 5)。在该步骤中第三电压V3的数值是不重要的，并且例如可以等于 第二电压V2的数值。
当核酸链F的端部进入纳米通道10的、被包括在入口井12与控 制井13之间的、碱基探测装置4定位在其处的第一部分时，由第一 阻抗计级18探测到的第一电阻抗Z’开始增大。响应于第一电阻抗Z’ 的增大，控制单元20设置第一电压V1为正数值，并且增大第二电压 V2直至比第一电压V1的正数值更高的相应的第二数值。第一电压V1的正数值使得其他变性链被吸引进入入口井12内，例如从未示出的 装载储槽。比第一电压V1更高的第二电压V2产生了静电力FE，吸 引存在于纳米通道10中链F的端部朝向第二电极16和控制井13。链 F的仍在入口井12中的一部分随着端部沿着纳米通道10前进而解开。
当存在于纳米通道10中链F的端部到达第二电极16和控制井13 时，控制单元20将第三电极17上的第三电压V3设置为比第二电极 16上第二电压V2的数值更高的数值(因此第二电压V2介于第一电压 V1与第三电压V3之间)，用于沿着纳米通道10的包括在碱基探测装 置4所在位置处的控制井13与收集井14之间的第二部分，而供给核 酸链F。
链F端部进入纳米通道10的第二部分，使得由第二阻抗计级9 探测到的第二电阻抗Z”增大。响应于第二电阻抗Z”增大，控制单元 20设置电压V1、V2、V3的数值，以便于促成从纳米通道10的第一部 分移除任何可能的阻塞(obstruction)。实际上，即便考虑到尺寸， 将其他核酸链引入已经被占据的纳米通道10极不可能，但是并不能 排除该类型事件。在一个实施例中，控制单元20因此施加趋向于从 已经被占据的纳米通道10移除额外的链的力。特别地，控制单元20 设置第三电压V3为比第一电压V1和第二电压V2均更高的数值，并 且将第一电压V1设置为比第二电压V2更高的数值，并且第一电压 V1由此介于第二电压V2和第三电压V3之间。如此方式，使得已经到 达纳米通道10的第二部分的链F停止，这是因为第三电压V3的更高 贡献占优势。替代地排除了另外存在于纳米通道10的第一部分中的 任何可能链，这是因为由第一电压V1和由第二电压V2确定的静电力 FE朝向入口井12推动带负电荷的核酸。因此使得纳米通道10不存 在可能的额外链。
一旦已经执行了对可能的阻塞的移除工序，控制单元20再次设 置电压V1、V2、V3，以便于控制存在于纳米通道10中链F的前进和 伸展。
更具体地，第三电压V3与第一电压V1之间的差异确定了核酸链 F沿着纳米通道10前进的速度和方向。当第三电压V3高于第一电压 V1时，链F从入口井12朝向收集井14前进。替代地，当第三电压 V3低于第一电压V1时，核酸链F沿相反方向从收集井14移动至入口 井12。第三电压V3与第一电压V1之间差值的绝对值确定了链F的前 进速度。
替代地，第三电压V3与第二电压V2之间的差值确定了在探测位 置处前进的核酸链F伸展。缺乏施加的外部力时，核酸链的连续碱基 设置为以近似恒定的间距(约0.33nm)相互间隔。由于第三电压V3和第二电压V2之间差值所导致的静电力FE作用在伸展的链F上，并 且引起在连续碱基之间特别是在探测位置处的分离。可以因此控制并 改变连续碱基之间的距离，以用于优化碱基探测装置4的性能和可靠 性。此外，如果碱基探测装置4基于目标低聚核苷酸的杂交，则能够 控制作用在正在被检查的链F上的力，以用于促成杂交并且随后将链 F与杂交的目标低聚核苷酸机械地分离。
输运装置5由此使得能够对核酸链沿着纳米通道10移动进行极 其精细和灵活的控制。三个电极15、16、17的使用实际上不仅使得 能够对前进方向和速度进行控制，而且也使得能够对施加在链F的正 在碱基探测装置4中被检查的的一部分上的力进行控制。
在一个实施例中，碱基探测装置4包括多个纳米线探测器21和 读取电路22，如图8中所示。纳米线探测器21设置在沿着纳米通道 10在探测位置处的相应的位置P1、P2…PK中。每个纳米线探测器 21提供了场效应装置，并且包括源极区域23、漏极区域24、以及连 接了源极区域23与漏极区域24的纳米线25。源极区域23和漏极区 域24是由具有第一导电类型例如N+的半导体材料形成的，并且关于 在探测位置处前进的核酸链的通道区域相对，特别地关于纳米通道10 的轴线A相对。半导体材料可以例如是硅、锗、InP、GaN。纳米线 25是与源极区域23和漏极区域24相同的半导体材料，但是具有第二 导电类型例如P。纳米线25限定了在源极区域23与漏极区域24之间 的沟道区域。纳米线25的电导由存在在纳米线25自身周围的电荷而 确定。特别地，在纳米线25附近的负电荷引起了电导相对于中性电 荷状态的下降。
纳米线探测器21的纳米线25在探测位置处横切纳米通道10的 轴线A的方向上设置，以使得沿着纳米通道10自身前进的核酸链将 跨越纳米线25。在一个实施例中，纳米线25相互平行并且沿着纳米 通道10接连地设置。
通过采用各自核酸探针27，而功能化每个纳米线25。核酸探针 27由具有相同数目N的(例如四个，如图9所示)碱基的低聚核苷 酸而限定。在一个实施例中，核酸探针27具有肽核酸(PNA)的结 构，其包含由肽键接合的N-(2-氨乙基)-甘氨酸的重复单元，并且是电 中性的。相同类型(也即包含相同碱基序列)的核酸探针27关联至 每个纳米线25。假定核酸探针27是电中性的，那么它们的存在并未 修改相应的纳米线探测器21的导电状态。然而，核酸探针27可以与 在纳米通道10中前进的核酸链中的对应碱基序列杂交。在该情形中， 使得杂交的核酸序列停止在纳米线25的附近，并且其自带的负电荷 引起纳米线探测器21的阻抗增大。
在其他实施例(未示出)中，核酸探针可以具有DNA或RNA结 构。在这些情形中，探针自身是带负电荷的。与链F的对应序列的杂 交引起了电荷的改变，并且因此引起了纳米线的阻抗的可探测的变 化。
纳米线25和相应的核酸探针27穷举了，通过采用包含在每个核 酸探针27中的数目N个碱基(适用于形成核酸的碱基在任何情形中 为四个：两个嘌呤－腺嘌呤和鸟嘌呤，以及两个嘧啶-对于DNA为胞 嘧啶和胸腺嘧啶，对于RNA为胞嘧啶和尿嘧啶)而可以获得的4N个 组合。在所述示例中，四个碱基的可能组合是44＝64个，并且存在 许多纳米线25，每个纳米线具有相应的类型的核酸探针27。此外， 每个纳米线25占据了沿着纳米通道10的相应的位置P1、P2、…、 PK(其中K＝4N是碱基的可能组合的数目)。
配置读取电路22以确定每个纳米线探测器21的导电状态，例如 通过阻抗探测。在一个实施例中，读取电路22包括阻抗计级30，该 阻抗计级30例如包括电压源31和电流传感器32，并且读取电路22 包括配置用于将阻抗计级30选择性连接至一个纳米线探测器21、特 别是连接至漏极区域24(纳米线探测器21的源极区域23连接至参考 电势线34，例如接地线)的多路复用器33。
如上所述，当一个纳米线探测器21的核酸探针27杂交了在纳米 通道10中前进的核酸链F的对应序列时，链F的负电荷使得纳米线 10的阻抗增大，这由阻抗计级30探测到。
控制单元20询问碱基探测装置4，其响应于询问而提供关于在纳 米通道10中前进的核酸链F的碱基的信息。具体而言，控制单元通 过控制信号SC来控制多路复用器33，以便于将阻抗计级30交替地 连接至每个纳米线探测器21，并且作为响应而接收到了读取信号SR， 该读取信号SR指示了连接至阻抗计级30的纳米线探测器21的导电 状态、并且因此指示了核酸链F的在探测位置前进的一部分中的各个 碱基组的存在。更精确地，纳米线探测器21中的一个(例如在位置 PJ)的阻抗的增大，指示了核酸链F的在探测位置前进的一部分中存 在碱基(四个，在所描述的示例中)的相应的序列，如图10中所示。 读取信号SR的系列(succession)定义了由碱基探测装置4提供的原 始序列。
控制单元20基于接收到的读取信号SR而重构了形成核酸链F的 有效的碱基序列SEQ，考虑了读取信号产生的时刻、以及沿着纳米通 道10由相应的纳米线25占据的位置P1、P2…PK。在一个实施例中， 将由碱基探测装置4所识别的每个碱基序列转换为有效碱基序列 SEQ，这在许多位置处进行，以便于补偿由于被杂交的纳米线探测器 21的一般位置PJ(在该位置处肯定已经完成了探测)与由核酸链F 到达的第一个纳米线探测器21的位置P1之间的距离的影响而导致的 探测延迟。例如，如果在探测位置处前进的核酸链F包含了：可以由 位置PJ处的纳米线探测器21探测到的N个碱基的序列SA、序列SA 被可以由在位置P1处的纳米线探测器21探测到的N个碱基的序列 SB跟随，那么碱基探测装置4在识别序列SA之前识别序列SB(图 11和图12：在对应于序列SB的纳米线探测器21阻抗ZJ增大之前， 对应于序列SAn的纳米线探测器21阻抗Z1增大)。控制单元20重 新排列序列SA和SB，并且通过采用序列SB相对于序列SA的、J-1 个位置的相对偏移，来补偿延迟。重新排列可以通过将序列SB向前 转换J-1个位置、或者通过将序列SA向后转换J-1个位置而获得。 更通常，可由在位置PI处的纳米线探测器21探测的序列与可由在位 置PJ(J>I)处的纳米线探测器21探测到的序列之间的重新排列，是 通过在有效碱基序列SEQ中采用J-I-1个位置的相对偏移而获得的。 将读取信号SR的原始序列转换为有效碱基序列SEQ，例如可以通过 将对应于读取信号SR的碱基序列输入到移位寄存器中、并且在位置 上相对于参考位置作为纳米线探测器21的位置的函数而进行转换而 获得。
控制单元20可以也考虑到在由碱基探测装置4识别的序列中的 可能的重叠。例如，包含碱基AAAAC的序列，可以由具有序列AAAA 的核酸探针27所关联的纳米线探测器21、以及由具有序列AAAC的 核酸探针27所关联的纳米线探测器21两者而识别。重叠部分(在该 情形中为AAA)可以用作对识别的正确性的检查。
根据本公开的设备1，特别是归功于碱基探测装置4，使得能够 对整个核酸链执行完整扫描，而不必采取断裂技术、子序列识别技术、 和重组技术。另一方面，因此消除了由于子序列重组中的错误的影响 而导致的部分序列遗失的可能性。事实上扫描是完整的。另一方面， 假如重构有效序列而言，按照执行识别的纳米线探测器的位置的函数 来对碱基进行转换是足够的，那么大大减少了用于处理碱基识别工序 下游的资源。
最终，显而易见的是，可以对所述装置做出修改和改变，而并未 由此脱离本公开的范围。
特别地，能够使用不同于上述的输运装置的输运装置。例如，输 运装置可以基于具有纳米孔的井，核酸链由于静电力的作用而穿过该 纳米孔并且延展。这些通过位于关于壁的相对侧上的电极的集合而获 得。驱动电极以用于促成链的一端进入纳米孔中，并且随后使得整个 链自身滑动穿过纳米孔、使其解开。碱基探测装置设置在纳米孔的出 口侧，其中链在延展状态下前进。
如上所述各个实施例可以组合，以提供其他实施例。可以在上述说明书的教导下对实施例做出这些和 其他改变。通常，在以下权利要求中，使用的术语不应构造为将权利要求限定至说明书和权利要求中 所述的具体实施例，而是应该构造为包括所有可能的实施例以及这些权利要求所赋予的等同方式的全 部范围。因此，权利要求并未由本公开限定。